變波長高效液相法同時測定糕點中的丙酸鈣和納他霉素

劉 瑩,王曉蕾，李 偉，張義丞，馬雪婷

(1.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,天津 300384；2.北京聯(lián)合智業(yè)檢驗檢測有限公司，北京 100012)

變波長高效液相法同時測定糕點中的丙酸鈣和納他霉素

劉 瑩1,王曉蕾1，李 偉1，張義丞1，馬雪婷2

(1.天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,天津 300384；2.北京聯(lián)合智業(yè)檢驗檢測有限公司，北京 100012)

建立一種同時測定糕點中丙酸鈣和納他霉素的變波長梯度洗脫高效液相色譜檢測方法。樣品采用超聲處理,以甲醇和0.01mol/mL酸性磷酸氫二銨為流動相進行梯度洗脫,經(jīng)色譜柱為C18(4.6mm×150mm,5μm)分離,程序化變波長檢測,外標法定量。該方法可以將丙酸鈣和納他霉素兩種防腐劑很好的分離,保留時間分別為(3.5±0.2)min和(9.4±0.2)min,丙酸鈣和納他霉素的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.9999,方法回收率為89%～98%。采用高效液相色譜同步測定糕點中丙酸鈣和納他霉素的方法具有快速、準確、靈敏度和精密度高的優(yōu)點,能滿足糕點中丙酸鈣和納他霉素含量同步測定的要求。

高效液相色譜法,糕點,丙酸鈣,納他霉素

丙酸鈣在酸性條件下產(chǎn)生游離丙酸,具有抗菌作用,對各類霉菌、革蘭氏陰性桿菌或好氧芽孢桿菌有較強的抑制作用,還可以抑制黃曲霉素的產(chǎn)生。丙酸是人體代謝過程中的一種產(chǎn)物和反應物,丙酸鈣分解后的Ca2+可被吸收[1],所以丙酸鈣是一種安全可靠的食品防霉劑。納他霉素(Natamycin)是納他爾鏈霉菌經(jīng)過發(fā)酵得到的一種次級代謝產(chǎn)物,是一種多烯大環(huán)內(nèi)脂類抗真菌劑。由于它能夠有效專一的抑制酵母菌和霉菌[2-4],而且具有較好的穩(wěn)定性,因此是廣泛使用的天然生物性食品防腐劑和抗菌添加劑。按照GB2760-2011《食品安全國家標準食品添加劑使用標準[5]中規(guī)定,對糕點中添加丙酸鈣限量值為2.5g/kg,納他霉素限量值為0.3g/kg。

由于糕點是高水分含量食品,為了延長糕點的保質(zhì)期,生產(chǎn)商往往添加復合防腐劑以增強其防腐保鮮效果,導致防腐劑存在多殘留和超范圍使用現(xiàn)象。因此,建立一種能夠同時測定丙酸鈣和納他霉素食品添加劑的方法十分必要。目前,大多數(shù)分析方法只能單一測定上述物質(zhì),所用的方法有高效液相色譜法[6]、氣相色譜法[7-8]、離子色譜法[9-10]。由于兩種物質(zhì)的檢測條件不同,能夠同時檢測的方法研究較少。本實驗旨在研究用變波長高效液相色譜法同時測定糕點中丙酸鈣和納他霉素的方法可能性,從而提高檢測效率,縮短檢測時間。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夾心蛋糕、月餅 均購于超市;丙酸鈣(貨號:C16493100)、納他霉素(貨號:C162084000),以上標準品純度均大于或等于89.5% 均購自Dr. Ehrenstorfer GmbH;甲醇(色譜純) 美國TEDIA公司;磷酸、磷酸氫二銨 均為國產(chǎn)分析純;實驗用水 為超純水。

Aglient 1260高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器) 美國Aglient公司;KQ800DB型數(shù)控超生波清洗器800W 昆山市超聲儀器有限公司;EASYPUREⅡ型超純水器 北京普析通用儀器有限責任公司;BSA2245-CW電子分析天平 北京賽多利斯公司;H-2050R 型低速冷凍離心機 北京雷勃爾離心機有限公司;IKA T25型組織搗碎機 上海標本模型廠;pH紙 天津市塘沽區(qū)化學試劑廠;0.45μm微孔濾膜 天津市東康科技有限公司。

1.2 高效液相色譜分析條件

色譜柱:Agilent ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm,安捷倫公司);柱溫25℃;流速1.0mL/min;流動相A為甲醇,流動相B為0.01mol/mL磷酸氫二銨用磷酸,調(diào)整pH4.5～5.5;檢測波長程序:0～3.5min,214nm;3.5～12min,305nm;12～14min,214nm;進樣量:10μL。按表1進行梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Elution program of mobile phase

1.3 標準曲線

標準品儲備液:準確稱取丙酸鈣140mg和納他霉素兩種標準品20.0mg,分別用水溶解并定容至100mL。吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置10mL容量瓶中,加稀釋溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品系列溶液,以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪出校準曲線圖。

1.4 樣品溶液的制備

準確稱取5g試樣至100mL燒杯中,加水20mL,加入0.01mol/L磷酸溶液0.5mL混勻,經(jīng)超聲浸提15min后,用0.01mol/L磷酸溶液調(diào)pH4.5～5.5左右,轉(zhuǎn)移試樣至50mL容量瓶中,用水稀釋至刻度搖勻。將試樣全部轉(zhuǎn)移至50mL具塞塑料離心管中,以不低于4000r/min離心10min,取上清液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后,待液相色譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

實驗選取以A液甲醇和B液0.01mol/L磷酸氫二銨溶液,用磷酸調(diào)節(jié)pH4.5～5.5作為流動相,減少流動相中甲醇的比例或甲醇比例上升較慢時各組分保留時間變長,分離效果較好,但擴散效應大,峰形差。反之,會使出峰時間提前,兩種物質(zhì)的峰分不開,發(fā)生重疊[11]。通過改變流動相比例,對丙酸鈣和納他霉素標準溶液進行梯度洗脫,最終確定的最佳流動相梯度如表1所示。用此梯度能使兩物質(zhì)得到完全分離,保證丙酸鈣出峰時間3.5min,且縮短納他霉素出峰時間時間為9.4min,同時峰形較好,減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象(見圖1),而且保留時間與變波長檢測程序的設(shè)計相吻合。

圖1 丙酸鈣、納他霉素混合標準色譜圖Fig.1 HPLC standards chromatograms of calcium propionate and natamycin 注:1:丙酸鈣;2:納他霉素;丙酸鈣納他霉素混合 標準溶液為0.568、0.1mg/mL。

2.2 變波長檢測條件的確定

由于不同物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)各異,特征吸收峰的波長各不相同,因此將兩種物質(zhì)標準溶液分別采用DAD進行全波段掃描,以確定其最佳吸收波長。從三維色譜圖(見圖2)中可見,丙酸鈣最大吸收波長在214nm處,納他霉素最大吸收波長在305nm處。以此作為變波長檢測方法的確定依據(jù)。丙酸鈣的出峰時間為3.5min左右,因此在0～3.5min采用214nm作為其檢測波長;納他霉素的出峰時間為9.4min左右,因此在3.5～12min采用305nm作為其檢測波長。

2.3 樣品前處理方法的選擇

丙酸鈣易溶于水,微溶于甲醇、乙醇等有機溶劑;納他霉素微溶于水和甲醇,難溶于大部分有機溶劑[12]。所以選擇純水作為兩種物質(zhì)提取溶劑,加入適量磷酸溶液,超聲浸提。糕點經(jīng)直接浸提后,雜峰較少,且與丙酸鈣和納他霉素的保留時間不一致,能夠有較好的分離,同時有效提取兩種物質(zhì)。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

丙酸鈣在35.0～710μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,納他霉素在0.1～100μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。兩組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)見表2。根據(jù)信噪比S/N=3 計算檢出限,結(jié)果見表2。

2.5 回收率和精密度的測定

稱取夾心蛋糕分別添加丙酸鈣、納他霉素標準混合溶液三個水平濃度后進行樣品處理,測定回收率和精密度。夾心蛋糕中的丙酸鈣不同添加量的回收率在89.2%～96.7%之間,納他霉素不同添加量的回收率在92.5%～98.9%之間。相對標準偏差在3.88%～6.23%之間?；厥章逝c精密度測定結(jié)果分別見表3。由方法回收率與精密度實驗結(jié)果表明,對于含有微量成分樣品的定量測定而言,回收率在80%以上完全能滿足定量測定的要求;同時精密度實驗的結(jié)果表明本研究建立的方法系統(tǒng)誤差較小,測定結(jié)果比較準確,分析方法可行性高。

表2 糕點中丙酸鈣和納他霉素標準樣品的標準曲線方程Table 2 Standard curve equations of calcium propionate and natamycin

圖2 丙酸鈣、納他霉素全波長掃描圖Fig.2 UV-absorption spectra of calcium propionate and natamycin注:A:丙酸鈣;B:納他霉素。

表3 丙酸鈣和納他霉素回收率和精密度實驗結(jié)果Table 3 The recovery and precision of calcium propionate and natamycin

2.6 實際樣品的測定

隨機購買市售的月餅、夾心蛋糕為樣本,按照1.4樣品前處理的方法,再按照1.2色譜條件進行測定。每種樣品平行三次,測定其中的丙酸鈣和納他霉素含量色譜圖見圖3,結(jié)果見表4。該方法對這些樣品均具有良好的適用性,色譜無干擾,在所檢樣品中均未超過國標對食品添加劑的要求。

圖3 夾心蛋糕丙酸鈣及納他霉素色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of cake注:1:丙酸鈣;2:納他霉素。

樣品丙酸鈣納他霉素月餅214.1260.416216.4110.420209.4650.419夾心蛋糕158.7150.358169.3540.361149.6890.368

3 結(jié)論

3.1 在流動相的選擇上,采用甲醇溶液(A)和 0.01mol/mL磷酸氫二銨溶液(B)進行梯度洗脫,程序0.0～3.5min,20% A;3.5～5.0min,20%～70% A,5.0～ 12.0min,70% A,12.0～14.0min,70%～20% A。確定了變波長同時檢測糕點中丙酸鈣和納他霉素檢測條件,其檢測波長分別為:214nm(0～3.5min),305nm(3.5～12 min),214nm(12～14min)。

3.2 在供試品溶液的制備中,采用超聲波在酸性條件下萃取樣品,結(jié)果干擾物質(zhì)較少,同時將兩種物質(zhì)有效提取出來。

3.3 本實驗建立的方法操作合理簡便,方法精密度高,重復性及線性關(guān)系良好,回收率令人滿意,對于了解食品中丙酸鈣的含量水平以及對納他霉素的加入量的控制有一定的指導意義。

[1]嚴成. 丙酸鈣對牛肉保鮮效果的研究[J]. 食品科學,2009,30(14):300-303.

[2]Harrg Brik. In Analyticalp rofiles of Drug substances[C].

New York:Academic Press,1994:514-557.

[3]Davisnd,Dieneruc . Food and BeverageMycology[C]. New York:Nostrand～ Reinhold,1987:517-526.

[4]Davipsonpm,Doanch . Natamycin[J]. Antimicrobiol in Foods,1993:395-407.

[5]中國人民共和國國家標準. 食品安全國家標準食品添加劑使用標準[S]. GB2760-2010. 北京:中國標準出版社,2011:7.

[6]中國人民共和國國家標準. 食品中丙酸鈉,丙酸鈣的測定高效液相色譜[S]. GB/T 23382-2009. 北京:中國標準出版社,2009:1-6.

[7]中國人民共和國國家標準.食品中丙酸鈉,丙酸鈣的測定[S].GB/T 5009.120-2003.北京:中國標準出版社,2004:99-100.

[8]王玉飛,李繼革,施家威.氣相色譜法測定食品添加劑丙酸鈉和丙酸鈣的方法改進[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2011,31(6):312-315.

[9]袁勇軍,戚向陽,黃麗金,等.毛細管氣相色譜法測定食品中的丙酸鹽[J]. 食品科技,2009,24(8):237-240.

[10]李艷芳. 超高效液相色譜法測定乳制品中納他霉素含量[J]. 食品工業(yè),2013,34(8):220-222.

[11]程春梅,彭進,董劉敏. 高效液相色譜法同時檢測果汁飲料中的六種合成著色劑[J]. 食品科技,2011,36(10):301-304.

[12]馬曉晨.天然食品防腐劑納他霉素的特性及其在食品工業(yè)中的應用[J]. 現(xiàn)代園藝,2009(9):55-56.

Simultaneous determination of calcium propionate and natamycin in cake by high performance liquid chromatography with programmed wavelength UV detection

LIU Ying1,WANG Xiao-lei1,LI Wei1,ZHANG Yi-cheng1,MA Xue-ting2

(1.Tianjin Products Quality Supervision and Inspection Institute,Tianjin 300384,China;2.United Intelligence. Ltd,Beijing 100012,China)

A method of simultaneous determination of calcium propionate and natamycin in cake by high performance liquid chromatography with programmed wavelength UV detection was developed. The samples were extracted with ultrasound pretreatment,separated with Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×150mm)using methanol-di-ammonium hydrogen phosphate(0.01mol/mL)as mobile phase with a gradient elution program,determined with variable wavelength detector,and quantified with external standard curve. This method could achieve the separation of calcium propionate and natamycin in cake,and the retention time of calcium propionate and natamycin was(3.5±0.2)min and(9.4±0.2)min,respectively. The correlation coefficients of calibration curves were all above 0.9999,and average recoveries were 89%～98%.It could conclude that the method that using HPLC to simultaneously determine calcium propionate and natamycin in cake had characters of quickness,accuracy and high-sensitivity,which could meet the requirements of simultaneously determining calcium propionate and natamycin in cake.

HPLC;cake;calcium propionate;natamycin

2014-03-28

劉瑩(1982-)，女，碩士研究生，主要從事食品檢驗研究。

國家重大科學儀器設(shè)備開發(fā)專項(2013YQ510391);國家自然科學基金項目(31201426)。

TS201.7

A

1002-0306(2015)01-0316-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.058