熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分

趙 新,王 永,蘭青闊,劉 娜,陳 銳,朱 珠,李歐靜

(天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,天津 300381)

熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分

趙 新,王 永*,蘭青闊,劉 娜,陳 銳,朱 珠,李歐靜

(天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,天津 300381)

根據羊線粒體DNA細胞色素b基因序列,設計特異性引物和Taqman探針。通過反應條件的優(yōu)化篩選,構建標準曲線,建立靈敏、可靠的肉制品中羊源性成分的實時熒光PCR鑒別方法。結果表明,所設計的引物可有效地進行肉制品中羊肉成分的鑒別,特異性強,靈敏度高達16pg/μL;標準曲線擴增效率達98.561%,R2=1,符合《實時熒光定量國際化標準-MIQE指南》要求;本研究建立的方法檢測結果與國標GB/T 20190-2006 方法結果符合率達100%,且不需電泳、酶切和測序等步驟。通過對市售肉制品樣本的鑒別驗證了方法的實用價值,為肉制品質量的有效控制提供了新的途徑。

熒光定量PCR方法,羊源性成分,鑒別

隨著市場上羊肉價格的不斷大幅上漲,部分不法企業(yè)及商販在高成本的羊肉中摻入低廉的其他肉類品種,或通過羊油浸泡、作料添加等方式處理后冒充羊肉進行銷售,由此引發(fā)了國內乃至國際貿易中諸如“馬肉風波”、“牛羊肉摻”等一系列的食品安全事件,嚴重危害了人民健康,擾亂和破壞了市場秩序。

20世紀80年代,國外開始對肉的種屬鑒定進行研究,多應用復合PCR技術,隨機擴增多態(tài)性PCR技術,限制性片段長度多態(tài)性PCR技術,巢式PCR技術以及實時熒光定量PCR技術對不同種屬的肉類品種進行廣泛研究,而國內針對鑒別肉品種類的研究多局限于普通PCR技術的應用[1-2]。同時,參比檢疫部門依據國家標準《飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應(PCR)法》(GB/T 20190-2006)對進出口飼料進行牛羊源性成分檢測的一般PCR方法,均需對PCR產物進行凝膠電泳才能完成整個檢測,而且一旦遇到可疑陽性結果,必須進行酶切鑒定[3]。因此,基于時效性和準確性上的優(yōu)勢,實時熒光定量PCR技術已經在動物源性成分檢測的很多項目上逐步取代了普通PCR方法,成為檢測動物源性成分最常用的分子生物學方法[4]。

國外多應用復合PCR技術,隨機擴增多態(tài)性PCR技術,限制性片段長度多態(tài)性PCR技術,巢式PCR技術以及實時熒光定量PCR技術對不同種屬的肉類品種進行廣泛研究。

動物線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)無組織特異性,進化速度快,大約為單拷貝核DNA的5～10倍,在基因組成上具有較高的保守性,一般由2個非編碼區(qū)和37個編碼基因組成,是研究動物種群遺傳學和分子系統(tǒng)學最常用的分子標記。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展,動物線粒體基因組測序研究突飛猛進,迄今已有上千種動物完成了線粒體基因組全序列的測序。本研究根據用作動物品種鑒定標志的線粒體DNA,選取其中細胞色素b基因的保守區(qū)域,設計羊源性成分的引物與探針,以FAM熒光素進行標記,擴增目的片段大小為82bp,大小僅為國標方法目的片段的1/3,成功建立了鑒別羊源性成分的實時熒光定量PCR方法,適用于肉制品中動物源性成分產品的羊源性成分的鑒別[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮羊肉、生鮮牛肉、生鮮豬肉、生鮮雞肉、生鮮鴨肉、驢肉、鯽魚、大豆粉 均購于天津市農貿市場;裂解液(10mol/L NaOH、500mmol/L EDTA、1mol/L Tris·Cl、5mol/L NaCl、10%十二烷基磺酸鈉)、TE緩沖液(10mmol/L Tris·HCl、1mmol/L EDTA)、三氯甲烷-異戊醇(24∶1)、異丙醇、70%乙醇、滅菌雙蒸水;定量PCR SuperMix-UDG預混液 invitrogen公司;引物、探針 由上海生工生物技術有限公司合成。

StepOnePlus Real-time PCR儀 美國ABI公司;SUB-cell GT核酸電泳儀、ND-1000 NanoDrop核酸蛋白測定儀 美國Bio-Rad公司;G:BOX凝膠成像系統(tǒng) 英國SYNGENE公司;Allegra 21R Centrifuge高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物與探針的設計 根據GenBank中公布的羊線粒體DNA細胞色素b基因序列,運用Primer Express 3.0軟件,設計引物和探針序列,見表1,引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR和測序引物序列Table 1 PCR primers and sequencing primers

1.2.2 標準品的制備 取生鮮羊肉和雞肉的瘦肉部分切成約1cm3大小肉丁,用蒸餾水洗凈,在10℃的蒸餾水中浸泡過夜,以去除多余的鹽分和油脂,肉丁置攪拌機中充分絞碎,將肉泥于白瓷盤中鋪成薄餅狀,70℃烘干4h左右即為干餅,再置攪拌機中絞碎為干粉狀。按照質量濃度,以雞肉為基質,配制羊肉濃度含量為100%、50%、10%、5%、1%的標準品,備用。

1.2.3 DNA模板的提取 稱取50mg樣品,加入500μL DNA提取細胞裂解液和10μL蛋白酶K,混勻,55℃水浴消化2h,加入4μL RNA酶,37℃ 10min;將消化后的裂解液加入等體積的Tris飽和酚,緩慢顛倒混勻,12000r/min離心10min;取上清液,加入等體積的Tris飽和酚,緩慢顛倒混勻,12000r/min離心10min;取上清液,加0.5倍體積的Tris飽和酚和0.5倍體積的氯仿/異戊醇(24∶1),緩慢顛倒混勻,4℃ 12000r/min離心10min;取上清液,加0.1倍體積的乙酸鈉溶液和2.5體積的4℃預冷的無水乙醇,輕輕顛倒混勻,4℃ 12000r/min離心5min;取沉淀,加500μL 70%乙醇洗滌沉淀2次;室溫下放置使殘留乙醇完全揮發(fā),加入100μL TE(pH8.0)溶解DNA沉淀,在NanoDrop核酸蛋白測定儀中進行核酸含量的測定,也可用等效動物基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.4 羊源性成分實時熒光PCR反應條件的建立 PCR反應體系為20μL,各成分含量為:2×SuperMix-UDG預混液10μL,上下游引物各1μL,探針引物0.4μL,模板2μL(模板濃度50ng/μL)無菌超純水補足20μL,混勻后離心,在實時熒光PCR儀上開始循環(huán)。循環(huán)參數為:95℃預變性15min,然后進行45個循環(huán),每個循環(huán)為95℃變性20s,62℃退火30s。

1.2.5 標準曲線的建立 將配制的50%、10%、5%、1%的4個梯度標準品作為模版,建立20μL反應體系,每個標準品設置3個平行,根據1.2.4建立的反應條件進行實時熒光PCR擴增。

1.2.6 方法特異性研究 分別選取生鮮牛肉、生鮮豬肉、生鮮雞肉、生鮮鴨肉、驢肉、鯽魚、大豆粉的DNA作為PCR反應的模版,以已知的生鮮羊肉DNA作為陽性對照模版,去離子水作為陰性對照模版,按1.2.4反應程序及條件進行實時熒光PCR擴增。

1.2.7 方法靈敏度研究 用鮭魚精DNA將提取的羊肉DNA原液稀釋至50ng/μL,然后進行5倍系列梯度稀釋,即50、10、2ng/μL、400、80、16、3.2pg/μL、640fg/μL等8個梯度,去離子水作為陰性對照模版,以1.2.4建立的反應程序及條件進行實時熒光PCR檢測。

1.2.8 樣品檢測 分別采用實時熒光PCR方法和國標GB/T 20190-2006方法對30份不同肉制品來源的DNA樣品進行羊源性成分檢測,驗證所建立的實時熒光PCR方法檢測肉制品中羊源性成分的適用性。在每一個檢測實驗中采用同管等量的DNA模板,每份DNA樣品的每種方法檢測必須重復2次,每次均設置2個平行實驗,只有當每種方法的2次重復實驗與所有平行實驗結果都一致時,才確定該份DNA樣品的檢測結果,否則需重新進行檢測。最后,分別比對2種方法對每一份DNA樣品的檢測結果是否一致,計算2種方法的檢測結果符合率。

2 結果與分析

2.1 DNA模版提取及濃度測定

DNA提取結果如表2所示,260/280比值在1.8～2.0之間,260/230比值在2.0以上,提取方法對核酸中蛋白質、RNA、鹽分等雜質的處理較為得當,同時用1%瓊脂糖電泳檢測核酸提取質量,可得到相對單一條帶,符合定量檢測DNA質量要求,結果見圖1。

表2 不同肉源品種DNA濃度Table 2 DNA concentration of different meat varieties

圖1 不同肉源品種DNA電泳檢測Fig.1 DNA electrophoresis detection of different meat varieties注:M,DL2000 DNA Marker;1,生鮮羊肉;2,生鮮牛肉; 3,生鮮豬肉;4,生鮮雞肉;5,生鮮鴨肉;6,驢肉;7,鯽魚。

2.2 標準曲線的建立

本實驗標準曲線的建立是通過對不同質量濃度梯度的標準品(50%、10%、5%、1%)進行擴增,每個梯度設三個重復,選取重復性好的作為標準點,以標準品的Ct值(threshold cycle)為橫坐標對初始濃度的對數值作圖,即得標準曲線y=-3.357x+32.942(注:標準曲線公式 y=ax+b,式中以Ct值作為y軸,以拷貝數的對數作為x軸),R2=1,擴增效率達98.561%,符合《實時熒光定量國際化標準-MIQE指南》要求,R2>0.980,擴增效率在90%～105%之間,如圖2所示。在實時定量PCR過程中,Ct值是一個重要的參數,它與擴增產物成正比。反應初,模板數越高,需要越少的循環(huán)數達到熒光信號閾值,閾值的信號明顯高于背景信號,這時所需要的循環(huán)數便是Ct值,有實驗表明它總是出現在擴增指數期,根據每管中樣品各自的Ct值,借助于標準曲線方程便可知其所含基因初始量。

圖2 定量標準曲線Fig.2 Quantitative standard curve

2.3 引物和探針的特異性實驗

分別選取生鮮牛肉、生鮮豬肉、生鮮雞肉、生鮮鴨肉、熟驢肉、鯽魚、大豆粉的DNA作為檢測模板,使用real-time PCR進行檢測,檢測結果均為陰性,引物和探針的特異性較高,符合實驗要求,見圖3。同時以已知的生鮮羊肉DNA作為陽性對照,去離子水作為陰性對照模版,結果均正常,實驗可信度較高。

圖3 方法特異性研究熒光擴增曲線Fig.3 Fluorescent amplification curve of specific research method

2.4 方法敏感性實驗

結果表明,以50、10、2ng/μL、400、80、16pg/μL的羊源性成分DNA樣本作為模板時,均能收集到明顯的FAM熒光擴增曲線,而以3.2pg/μL、640fg/μL的羊源性成分DNA樣本和去離子水作為模板時,FAM 熒光擴增為陰性,如圖4及表3所示,因此本方法的最低檢出限為16pg/μL DNA濃度。

圖4 方法靈敏度研究熒光擴增曲線Fig.4 Fluorescent amplification curve of sensitivity research method

表3 羊源性成分靈敏度檢測結果Ct值Table 3 DNA concentration of different meat varieties

表4 本研究建立的實時熒光PCR方法和GB/T 20190Y-2006方法的樣品檢測比對結果Table 4 Comparison of results detected by real-time PCR and GB/T 20190-2006 method

2.5 實際樣品鑒定結果

按方法1.2.4,分別采用本研究建立的實時熒光PCR方法和國標方法對30份不同肉制品來源DNA樣品進行羊源性成分檢測。檢測結果表明,本研究建立的實時熒光PCR方法具有良好的特異性,與國標方法的檢測結果符合率為100%,未出現假陽性或假陰性結果,兩種方法的檢測結果比對見表4。

3 結論與討論

物種基因的正確選擇及基因片段長度的大小是動物源性成分檢測的關鍵。線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質,基因組中無間隔系列、無組織特異性、種內遺傳穩(wěn)定、種間高度變異、個體不同組織中均含有大量的線粒體、可以獲得較高的拷貝數,已廣泛用作食品及飼料中動物源性成分檢測的靶基因[6-8]。

同時有研究表明待測樣本DNA的破壞程度與加工溫度密切相關,如加熱到100℃,DNA片段長度會銳減到1100bp,至120℃則銳減到600bp以下[9],如果待測基因片段過長,可能在實際檢測中無法發(fā)現目的片段。因此本研究特選擇羊線粒DNA細胞色素b基因作為靶基因;同時采用Taqman實時熒光PCR技術,檢測片段長度僅為82bp[10]。

本研究所建立的實時熒光定量PCR技術檢測肉制品中羊源性成分具有較高的準確性與穩(wěn)定性,通過熒光信號的檢測可以直接對產物進行定量,再加上它高通量和低成本的優(yōu)點,必將代替?zhèn)鹘y(tǒng)的檢測方法。該方法所建立的標準曲線擴增效率達98.561%,相關系數值為1,符合《實時熒光定量國際化標準-MIQE指南》中要求的R2>0.980,擴增效率在90%～105%之間,測定結果準確可靠,該研究為動物源性成分鑒定的深入研究提供了新的先進可靠的手段。

最后應用本方法對實際樣本進行檢測,30份模擬樣本的檢測結果與實際情況完全吻合。表明本研究所制定的方法完全能夠滿足肉制品中羊源性成分日常檢測需求,是防止商家摻假牟利的有效手段?；蚨糠治鍪俏磥頇z測手段的一個重要發(fā)展方向,雖然還存在著一定的技術性問題,比如對于熟肉制品加工工藝當中DNA斷裂損傷或提取效率不充分對定量結果與真實值之間偏差的影響,但是隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展必將會日趨完善,在生命科學技術領域會有很大的應用前景[11-13]。

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Real-time PCR detection of sheep derived materials in meat product

ZHAO Xin,WANG Yong*,LAN Qing-kuo,LIU Na,CHEN Rui,ZHU Zhu,LI Ou-jing

(Institute of Tianjin Agriculture Quality Standard and Testing Technology,Tianjin 300381,China)

Targetingcytochromeb gene of mitochondrial DNA from sheep,the specific primers and TaqMan probes were designed. After optimization of reaction conditions and establishment of standard curve,a fluorescent real-time PCR method had been set up to detect sheep derived materials. The results showed that the specific primers could identify sheep derived materials in meat product specially and effectively,and the sensitivity was as high as 16pg/μL. Amplification efficiency of the standard curve was 98.561% and correlation coefficientR2was 1.000. These properties meet the requirement of the《MIQE Guide》. The results obtained according to the new method and the National Standard(GB/T20190Y-2006 routine PCR method)were exactly the same,and electrophoresis,restriction digestion and sequencing were avoided in the new method. The value of this method was proved though the identification of the meat product from the market. The assay provides a new way for the quality control of the meat products.

Real-time PCR method;sheep derived materials;detection

2014-03-27

趙新(1983-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：主要從事農產品分子檢測技術研究。

*通訊作者:王永(1977-)，男，博士，副研究員，研究方向：主要從事農產品安全質量分子檢測技術研究。

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(14JCQNJC14800)。

TS251.5

A

1002-0306(2015)01-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.054