基于QuEChERS前處理技術(shù)的水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物多殘留ELISA檢測方法的建立

楊金易，張 燕,曾道平,王 弘,徐振林,沈玉棟,雷紅濤,孫遠明

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,廣東廣州 510642;2.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東佛山 528300；3.廣州萬聯(lián)生物科技有限公司,廣東廣州 510642)

基于QuEChERS前處理技術(shù)的水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物多殘留ELISA檢測方法的建立

楊金易1，張 燕2，+,曾道平3,王 弘1,徐振林1,沈玉棟1,雷紅濤1,孫遠明1

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,廣東廣州 510642;2.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東佛山 528300；3.廣州萬聯(lián)生物科技有限公司,廣東廣州 510642)

建立了水產(chǎn)品中3種喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星)獸藥多殘留的新型QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合酶聯(lián)免疫快速檢測的分析方法?；玖鞒虨闃悠方?jīng)90%乙腈(1%乙酸)均質(zhì)提取離心后,上清液依次用C18凈化、靜置沉淀蛋白后用于測定,該前處理方法靈敏、快速、經(jīng)濟、實用性強。測試曲線線性范圍為0.107～177.896ng/mL,檢出限為0.0087μg/kg,IC50值為4.34ng/mL。樣品批內(nèi)和批間平均回收率分別為94.10%、93.70%,批內(nèi)變異系數(shù)為4.09%～8.41%,批間變異系數(shù)2.78%～7.99%。檢測結(jié)果與HPLC的相關(guān)系數(shù)R2=0.9897,表明酶聯(lián)免疫檢測方法及樣品前處理方法適合喹諾酮類藥物多殘留檢測。

QuEChERS,ELISA,多殘留,喹諾酮,水產(chǎn)品

氟喹諾酮類藥物(FQs)是一類人工合成藥物,屬于廣譜抗菌藥,具有廣譜、高效、低毒等特點。其主要用于動物疾病的防治和飼料中動物生長促進劑[1],但藥物濫用現(xiàn)象較為嚴重,導(dǎo)致藥物殘留,威脅人類健康[2]。世界各國十分重視FQs類抗菌藥殘留問題,對常用的FQs藥物制定了相應(yīng)的殘留限量標準,如歐盟[3]規(guī)定動物肌肉等組織中恩諾沙星等的MRLs為0.01～1.9mg/kg;美國禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用FQs[4];日本對進口生鰻魚及其制品的環(huán)丙沙星等殘留限量控制在檢測限的0.05mg/kg[5]。因此,加強對FQs類藥物的殘留監(jiān)控并建立一種快速高效的檢測方法對加強水產(chǎn)品質(zhì)量安全的監(jiān)測具有重要的意義。

關(guān)于FQs檢測方法研究報道,一般有高效液相色譜[6-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]、免疫測定法[14-17]等,液相色譜法儀器昂貴,成本較高,不易推廣應(yīng)用,免疫測定法具有操作簡便、快速等優(yōu)點。樣品前處理技術(shù)是整個分析技術(shù)中的關(guān)鍵步驟,近年來,出現(xiàn)了一些新的樣品前處理技術(shù),如基質(zhì)固相分散萃取[18],固相萃取[19-20],超臨界流體萃取[21]等,在傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)的基礎(chǔ)上有了較大的改善,但是這些方法各有一些無法避免的缺陷。Anastassiadas等在2003年提出了一種快速(Quick)、簡單(Easy)、廉價(Cheap)、高效(Effective)、可靠(Rugged)和安全(Safe)的分散固相萃取(QuEChERS)技術(shù)。QuEChERS作為一項新型的前處理技術(shù),目前已有科研人員將該技術(shù)應(yīng)用于動物組織中的獸藥殘留檢測[22-26],但是將該樣品前處理方法運用于檢測喹諾酮類藥物多殘留的ELISA方法尚未見報道。

本文首次將QuEChERS法和酶聯(lián)免疫檢測方法有機結(jié)合起來用于檢測FQs多殘留,對提取凈化方法、酶聯(lián)免疫方法建立的條件進行了改進和優(yōu)化,建立了一種QuEChERS結(jié)合ELISA同時檢測水產(chǎn)品中3種FQs藥物多殘留的方法,具有快速、簡單、準確度高等優(yōu)點,能夠滿足水產(chǎn)品中FQs藥物殘留檢測要求,適合大批樣品的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

喹諾酮類藥物 浙江國邦藥業(yè)有限公司;HRP標記羊抗鼠IgG 武漢博士德生物工程有限公司;水產(chǎn)品 市售;分散固相吸附劑(C18、PSA、NH2) 博納-艾杰爾科技公司;包被液、稀釋液、洗滌液、封閉液均按照文獻[27]的方法配制;喹諾酮類包被原、喹諾酮類抗體均為實驗室前期制備;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Wellwash MK2洗板機 美國Thermo公司;6k高速冷凍離心機 德國Sartorius公司;Multiskan MK 3酶標儀 美國Thermo公司;微量移液器 美國Eppendorf公司;酶標板 深圳金燦華實業(yè)有限公司;高效液相色譜儀 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 FQs間接競爭酶聯(lián)免疫分析法(FQs-ELISA)的實驗步驟 用包被液將FQs包被原稀釋30000倍,加入酶標板孔中,100μL/孔,37℃包被過夜;用洗滌液洗2次,拍干,加入120μL封閉液,37℃水浴箱孵育3h,甩干孔中液體,放37℃烘箱中烘干備用。

用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBST)分別將標準品稀釋不同濃度的標準品溶液,如0、0.01、0.05、0.2、0.78、3.13、12.5、50、200ng/mL。取50μL稀釋好的標準品到包被好的板條中,加入50μL稀釋好的抗體,在37℃水浴箱中孵育30min,用洗液洗5次;拍干后加入100μL酶標二抗(羊抗鼠),在37℃水浴箱中孵育20min,用洗液洗5次;拍干后加入底物緩沖液和底物液等體積的混合液100μL/孔,混勻后置于37℃水浴箱孵育10min。加入50μL終止液,用波長為450nm的酶標儀測定吸光值A(chǔ)。

1.2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 按照1.2.1中的操作步驟,分別對包被原稀釋倍數(shù)、抗體稀釋倍數(shù)、競爭反應(yīng)時間、標準品稀釋液等條件進行優(yōu)化。通過比較最大吸光值A(chǔ)max、半抑制濃度IC50以及Amax/IC50來確定最優(yōu)的反應(yīng)參數(shù),建立標準曲線。

1.2.3 標準曲線的繪制 按照優(yōu)化方案優(yōu)化ELISA方法后,得到FQs間接競爭ELISA方法的最佳反應(yīng)條件,即:包被抗原稀釋倍數(shù)為1∶30000,包被溫度為37℃,包被時間為12h(過夜);FQs抗體稀釋液為T液,稀釋倍數(shù)為1∶6000;標準品稀釋液為0.01mol/L PBST,反應(yīng)體系的pH7.5;二抗稀釋液為P液,稀釋倍數(shù)為1∶6000;反應(yīng)時間為一抗30min、二抗20min,反應(yīng)條件為37℃水浴。

在最優(yōu)的工作條件下,以環(huán)丙沙星藥物的溶液濃度對數(shù)為橫坐標,B/B0(%)值為縱坐標,采用OriginPro8.5軟件進行擬合,繪制環(huán)丙沙星icELISA方法的標準曲線。根據(jù)標準曲線計算出該方法的半抑制濃度(IC50)和線性范圍(IC20～IC80)。

1.2.4 樣品前處理 將樣品用均質(zhì)機進行均質(zhì),準確稱取1g樣品,置于15mL離心管中,加入5mL 90%乙腈(1%乙酸)提取液,渦旋振蕩5min,以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min。取上清液轉(zhuǎn)入裝有分散固相萃取劑(200mg C18)的10mL離心管中,渦旋2min。將10mL離心管放入離心機中以6000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min。靜置10min,充分沉淀蛋白質(zhì)。取適量的萃取液稀釋到合適的倍數(shù),待測。

1.2.5 添加回收實驗 稱取陰性樣品,樣品中加入標準品的濃度為20、50、100ng/g,同時用不添加藥物的樣品作陰性對照。按照1.2.2步驟進行樣品處理,用ELISA進行檢測,計算其回收率。

1.2.6 特異性實驗 交叉反應(yīng)率反映某種測定方法對被測物質(zhì)的專一程度。對檢測方法特異性的考察,通常比較待測物與其結(jié)構(gòu)或功能類似物質(zhì)之間的交叉反應(yīng)率。選擇ELISA檢測步驟,在同等條件下以環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)為基準物質(zhì),依次繪制其他結(jié)構(gòu)類似物競爭抑制曲線,計算結(jié)構(gòu)類似物的IC50,以下列公式計算交叉反應(yīng)率(Cross Reactions,CR)。

1.2.7 基質(zhì)效應(yīng) 選擇空白樣品,進行樣品預(yù)處理,得到樣品提取液,以各樣品處理液和標準品稀釋液將各標準品按照配制標準曲線的梯度稀釋,進行ELISA實驗,分別繪制標準曲線,比較分析,考察不同樣品基質(zhì)對標準曲線的影響[28-29]。

1.2.8 方法準確性實驗 準確度是指測的結(jié)果與真實值的接近程度,表示分析方法測量的正確性,可用回收率表示[30]。在空白樣品中添加不同含量水平的標準品,按照1.2.4方法進行樣品處理,按照1.2.5步驟進行測定,計算回收率。計算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 FQs-ELISA標準曲線建立

以環(huán)丙沙星標準品溶液濃度對數(shù)為橫坐標,B/B0值為縱坐標,進行擬合,結(jié)果如圖1所示。該方法的IC50值為4.34ng/mL;檢出限為0.0087μg/kg,檢測范圍為0.107～177.896ng/mL。

表1 不同提取劑對FQs回收率的影響(%,n=3)Table 1 Effect of the extracting solvent on recovery(%,n=3)

注:a:100%乙腈(1%乙酸);b:90%乙腈(1%乙酸)水溶液;c:75%乙腈(1%乙酸)水溶液;d:50%乙腈(1%乙酸)水溶液;e:90%乙腈水溶液;f:100%乙腈。

表2 提取方法對回收率的影響(n=3)Table 2 Effect of the extracting method on recovery(n=3)

圖1 環(huán)丙沙星icELISA法標準曲線(n=3)Fig.1 Standard curve of CIP by IC-ELISA(n=3)

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

實驗中考察了萃取劑、提取方式、提取時間、凈化填料、凈化時間等各項實驗條件對回收率的影響,從而確定最優(yōu)條件。上述的參數(shù)是相互制約的,共同影響著萃取和分離平衡,從而影響樣品回收率高低。

2.2.1 提取試劑的選擇 分別采用100%乙腈(1%乙酸)、90%乙腈(1%乙酸)水溶液、75%乙腈(1%乙酸)水溶液、50%乙腈(1%乙酸)水溶液、90%乙腈水溶液、100%乙腈作為提取溶劑,樣品中加入標準品的濃度為20、50、100ng/g,測定回收率,結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示,含酸的乙腈提取效果遠大于純乙腈,和文獻[36]報道相一致。當(dāng)在乙腈和乙腈(1%乙酸)中分別加入不同比例的水時,提取效率順序為:90%乙腈(1%乙酸)-水溶液>90%乙腈-水溶液;90%乙腈(1%乙酸)-水溶液>75%乙腈(1%乙酸)-水溶液;90%乙腈(1%乙酸)-水溶液>100%乙腈(1%乙酸)>50%乙腈(1%乙酸)-水溶液。所以選擇90%乙腈(1%乙酸)水溶液作為提取劑。

萃取劑的選擇不僅要遵循“相似相溶”規(guī)則,而且要考慮萃取溶劑對隨后的處理過程的影響。由于恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等喹諾酮藥物結(jié)構(gòu)式中均有4-喹諾酮母核,是酸堿兩性的化合物[25,32],易溶于含乙酸的乙腈水溶液,且樣品的回收率更高,與文獻[25，33-34]報道一致。針對于水產(chǎn)品樣品,其富含蛋白質(zhì),采用含乙腈的萃取劑時,提取的上清液中含有的蛋白質(zhì)更少,對于采用QuEChERS除雜過程更有利。

涂裝是現(xiàn)代產(chǎn)品制造工藝中的重要環(huán)節(jié)之一，它包括涂裝前對被涂物表面的處理、涂布工藝和干燥三個基本工序以及設(shè)計合理的涂層系統(tǒng)。傳統(tǒng)涂裝工藝中，在噴漆、烘干工段會產(chǎn)生大量的有機溶劑氣體，其主要成分是甲苯、二甲苯、苯等，這些有害物質(zhì)外排不僅影響大氣環(huán)境，而且有火災(zāi)和爆炸的環(huán)境風(fēng)險。涂裝工藝產(chǎn)生的環(huán)境污染與涂料選擇、作業(yè)環(huán)境條件、質(zhì)量及工藝管理各方面息息相關(guān)［1］。

表3 不同吸附劑對FQs回收率的影響(n=3)Table 3 Recovery data of FQs for different sorbents(n=3)

表4 不同種類樣品添加回收實驗結(jié)果(n=3)Table 4 Recovery data of FQs for different samples(n=3)

2.2.2 提取方式的選擇 樣品中加入標準品,以酸化乙腈為提取劑,分別比較渦旋振蕩、搖床振蕩、超聲波破碎3種提取方式對提取效率的影響,測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明,3種提取方式的回收率均表現(xiàn)出差異,可以看出渦旋振蕩的提取方法回收率最高,效果最好。

2.2.3 凈化填料的選擇 凈化填料有乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、氨基(-NH2)和C18吸附劑。采用酸性乙腈為提取溶液,分別比較了C18、NH2、PSA的幾種吸附劑對樣品基質(zhì)的凈化效果,測定了相應(yīng)的回收率,結(jié)果如表3。實驗結(jié)果表明,C18的凈化效果是最好的,回收率在90%左右,其他幾種吸附劑除雜效果較差,回收率偏低。

由于PSA和NH2可清除脂肪酸、部分酚類、色素和糖類,而C18吸附劑是在硅膠基質(zhì)上接有十八烷基,具有較高的相覆蓋率和碳含量,對非極性物質(zhì)有較高的容量,對油脂和一些非極性的基質(zhì)成分的去除效果很好[25]。針對于水產(chǎn)品來說,C18吸附劑除雜效果最好。因此選取C18作為實驗的凈化吸附劑。并對C18的用量進行了優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示。綜合考慮,最終選擇C18的用量為200mg。

圖2 C18使用量的優(yōu)化Fig.2 Comparison of the abilities of different amount of C18

2.2.4 凈化時間的選擇 對樣品凈化時間進行了優(yōu)化,比較了2、5、10、15min的凈化效果,結(jié)果如圖3所示,表明凈化時間為2min時,效果最好。隨著凈化時間的延長,C18吸附劑在吸附雜質(zhì)的同時,可能會吸附一定的目標物,導(dǎo)致回收率偏低。因此從節(jié)約時間和回收效果方面綜合考慮,選擇凈化時間為2min。

圖3 凈化時間的優(yōu)化Fig.3 Comparison of the abilities of different Cleaning time

2.3 方法準確性

準確度是指測的結(jié)果與真實值的接近程度,表示分析方法測量的正確性,可用回收率表示。在空白樣品中添加不同含量水平的FQs標準品,進行樣品預(yù)處理,按照ELISA步驟測定,計算回收率。用同一批次試劑盒對樣品進行檢測,每個樣品設(shè)3個重復(fù),連續(xù)測定3次,計算批內(nèi)和批間變異。結(jié)果如表4所示,各種樣品批內(nèi)、批間平均回收率94.10%、93.70%,且各個樣品批內(nèi)變異系數(shù)為4.09%～8.41%,批間變異系數(shù)為2.78%～7.99%。

表5 喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)表Table 5 Cross-reactivity of FQs antisera with analogues

本實驗選擇恩諾沙星、氧氟沙星、格林沙星、諾氟沙星、普盧利沙星、培氟沙星、莫西沙星、沙拉沙星、可林沙星9種環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)類似物或功能類似物在相同條件下分別進行ELISA測定,計算其標準曲線的IC50值,以環(huán)丙沙星的交叉反應(yīng)率為基準(100%),考察交叉反應(yīng)率的情況(見表5)。由實驗結(jié)果得知,該抗體除與普盧利沙星、沙拉沙星和莫西沙星有低的交叉反應(yīng)率外,與其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均大于50%。表明該抗體可用于實際樣品中喹諾酮類藥物的多殘留檢測。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

樣品的基質(zhì)效應(yīng)是指由于樣品提取液的基質(zhì)成分復(fù)雜,其中某些雜質(zhì)可能會影響反應(yīng)過程中抗原抗體的特異性結(jié)合,從而對目標物的檢測造成一定影響的現(xiàn)象。基質(zhì)效應(yīng)的存在可能會降低檢測靈敏度,還有可能產(chǎn)生假陽性。因此,需要評估樣品中的潛在干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。本實驗對不同種類陰性樣品進行樣品預(yù)處理,得到樣品提取液,考察不同樣品提取液對ELISA方法的影響,結(jié)果如下圖4所示。由圖可知,所得到的標準曲線幾乎全部重合,表明經(jīng)過前處理后不同樣品的基質(zhì)效應(yīng)對ELISA檢測FQs基本無影響。

表6 不同種類樣品中FQs添加回收實驗結(jié)果(n=3)Table 6 Recoveries of FQs from spiked fish and shrimp by ELISA and HPLC(n=3)

圖4 不同基質(zhì)標準曲線與FQs標準曲線的比較Fig.4 Normalised standard curve by ELISA for FQs under optimized conditions

2.6 相關(guān)性實驗結(jié)果

稱取空白樣品,加入不同濃度的標準品溶液,進行樣品預(yù)處理,得到樣品提取液,過0.22μm濾膜上機測定或稀釋合適的倍數(shù)后用試劑盒測定,結(jié)果如圖5和表6所示。由實驗結(jié)果可知,HPLC法回收率在80%～110%之間,所建立的HPLC法準確度良好。

圖5 魚肉空白樣品和加標樣品(50ng/mL)色譜圖Fig.5 Chromatogram data of FQs from spiked fish by HPLC注:OFL:氧氟沙星;CIP:環(huán)丙沙星;ENR:恩諾沙星。

對兩種方法測定結(jié)果進行線性回歸分析,以ELISA試劑盒測得的樣品濃度為x軸,以HPLC測得的樣品濃度為y軸,繪制散點圖,做擬合曲線,結(jié)果如圖6所示?；貧w方程為y=1.0658x+0.4006,相關(guān)系數(shù)R2=0.9897,說明建立的ELISA檢測樣品中的FQs結(jié)果準確可靠。

圖6 HPLC與ELISA法檢測樣品中FQs的線性相關(guān)性分析Fig.6 Analytical result of ELISA and HPLC methods

3 結(jié)論

本文以水產(chǎn)品中國際較為關(guān)注的喹諾酮類藥物為目標物,通過改進樣品前處理方法中的一些提取凈化的相關(guān)條件,首次建立了QuEChERS-ELISA快速測定水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物多殘留的方法。該方法不僅簡化了實驗步驟,而樣品前處理和檢測過程均縮短了檢測時間,降低了檢測成本,并且能夠保證多種藥物同時檢測。相比于儀器的方法,更加的省時,方便,快捷。該方法批內(nèi)回收率為86.32%～101.89%,批間回收率86.15%～102.75%,與曹慧、曹鵬等人[35-36]相比,樣品回收率更高,結(jié)果更穩(wěn)定,符合喹諾酮類藥物殘留測定要求。經(jīng)HPLC-MS方法進行確證,該ELISA方法及樣品前處理方法檢測結(jié)果準確可靠,可以滿足水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的實際檢測需求。

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Simultaneous determination of Fluoroquinolones in seafood by modified QuEChERS and Enzyme-linked Immunosorbent Assay

YANG Jin-yi1，ZHANG Yan2，+,ZENG Dao-ping2,WANG Hong1,XU Zhen-lin1,SHEN Yu-dong1,LEI Hong-tao1,SUN Yuan-ming1

(1.College of Food Science,South China Agriculture University,Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision,Foshan 528300,China;3.Guangzhou Wanlian Biological Technology Co.,Ltd.,Guangzhou 510642,China)

A method was developed for the simultaneous determination of 3 Fluoroquinolones(FQs)(enrofloxacin,ciprofloxacin,ofloxacin)residues including enrofloxacin,ciprofloxacin,ofloxacin in seafood samples by new QuEChERS and Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA). The approach involved the extraction of sample with acetonitrile containing 1%(v/v)acetic acid,and the supernatant liquid was directly purified with C18,meanwhile,was used for the precipitation of protein. The method was proved to be sensitive,rapid,precise,economical and applied. The calibration curve should be virtually linear in the range of 0.107～177.896ng/mL,the limit of detection(LOD)was 0.0087μg/kg,and IC50value was 4.34ng/mL. Average recovery rate was 94.10% and 93.70% separately in same batch and different batch,coefficient of variation was 4.09%～8.41% and 2.78%～7.99% separately in same batch and different batch. The results showed good coefficient with HPLC(R2=0.9897),which proved to be suitable for the screening of seafood samples for the presence of FQs.

QuEChERS;ELISA;multi-residues;Fluoroquinolones;seafood

2014-03-26 +并列第一作者

楊金易(1979-)，男，博士，講師，研究方向：食品質(zhì)量與安全。 張燕(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全檢測技術(shù)。

廣州市珠江科技新星專項(2013J2200080)；國家星火計劃(2012GA780001，2013GA780035)；NSFC-廣東聯(lián)合基金(U1301214)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013030013338)；教育部博士點基金(20114404130002)；廣東省科技計劃項目(重點專項)(2012A020100002，2010A032000001-4)；廣州市科技企業(yè)孵化器發(fā)展專項(2012Ss-P204)。

TS254.7

A

1002-0306(2015)01-0292-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.053