銀葉樹種子蛋白的提取及其功能性研究

熊 拯,鐘秋平,李麗清

(欽州學(xué)院 海洋學(xué)院,廣西欽州 535099)

銀葉樹種子蛋白的提取及其功能性研究

熊 拯,鐘秋平,李麗清

(欽州學(xué)院 海洋學(xué)院,廣西欽州 535099)

以銀葉樹種子為原料,考察提取工藝對其蛋白提取率的影響。通過單因素實驗對影響銀葉樹種子蛋白提取率的pH、提取時間、液料比和提取溫度等四個因素進行研究,并采用Box-Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)曲面分析法確定銀葉樹種子蛋白提取的最佳工藝條件。結(jié)果表明:最佳提取工藝條件為提取溫度55℃、pH10、提取時間2h、液料比11∶1,在此條件下蛋白提取率為50.85%;銀葉樹種子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于大豆分離蛋白;而大豆分離蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于銀葉樹種子蛋白。

響應(yīng)曲面,銀葉樹種子,蛋白質(zhì),提取

銀葉樹(Heritieralittoralis)是銀葉樹屬紅樹植物,也稱大白葉仔,為梧桐科銀葉樹屬真紅樹植物,廣泛分布于熱帶海岸,在我國海南、廣東、廣西和臺灣等地均有分布[1]。果實內(nèi)僅含一粒種子,為其主要藥用部位,種子無胚乳,主要由兩片肥厚的子葉構(gòu)成[2],銀葉樹種子主治腹瀉、痢疾[3],其種仁被作為一種滋補品,有一定的食用價值[4]。

目前,國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于銀葉樹的研究主要集中于通過溶劑萃取、大孔吸附樹脂柱層析、硅膠柱層析、Sephadex LH.20柱層析、HPLC等方法從該植物的根、莖、葉中分離鑒定化合物[5-7],但是從食品研究開發(fā)的角度對銀葉樹進行的研究非常少。本研究擬采用堿溶酸沉法[8-10]對銀葉樹種子中的蛋白質(zhì)進行提取,通過單因素實驗考察pH、提取溫度、提取時間和液料比四個因素對提取率的影響,并采用響應(yīng)曲面法對銀葉樹種子蛋白質(zhì)的提取條件進行優(yōu)化,以期為銀葉樹種子系列食品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀葉樹種子,采自防城港銀葉樹生態(tài)保護區(qū);石油醚,分析純,成都科龍化工試劑廠;硫酸鉀、硫酸銅和硼酸,分析純,廣東光華化學(xué)廠有限公司;硫酸、鹽酸和甲基紅,分析純,成都科龍化工試劑廠;溴甲酚綠、醋酸和醋酸鈉,分析純,天津市光復(fù)精細化工研究所。

80-1型電動離心機 上海梅香儀器有限公司;FA2004型電子分析天平 上海耀杰有限公司;PHS-3CF型精密酸度計,上海大普儀器有限公司;101-3型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海東星建材實驗設(shè)備有限公司;自動凱氏定氮儀 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;FW-100型高速萬能粉碎機 上海勝啟儀器儀表有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀葉樹種子脫脂 銀葉樹果實去殼后,在溫度50℃下的烘箱里烘干至恒重,粉碎,過40目篩,按照10∶1(V/W,以下同)的液料比用石油醚脫脂,置于冰箱中冷藏備用。

1.2.2 銀葉樹種子蛋白等電點的測定 稱取10g樣品,液料比為10∶1,pH調(diào)至10。在溫度30℃下磁力攪拌浸提1.0h,離心(4000r/min,20min)取上清液,分取上清液8份各20mL,用醋酸和醋酸鈉緩沖溶液分別調(diào)pH為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0,離心(4000r/min,20min),出現(xiàn)沉淀量最大時的緩沖溶液pH為銀葉樹種子蛋白質(zhì)的等電點。實驗中出現(xiàn)沉淀量最大時的緩沖溶液pH為3.5。

1.2.3 銀葉樹種子蛋白的提取工藝流程 銀葉樹果實→去殼→干燥→粉碎(過40目篩)→脫脂→攪拌浸提→離心分離(4000r/min,10min)→取上清液→調(diào)蛋白等電點→離心分離(4000r/min,20min)→沉淀→干燥→粗蛋白[11]

其中,蛋白質(zhì)提取率計算如下:

蛋白質(zhì)提取率(%)=(產(chǎn)品質(zhì)量×產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的百分含量/樣品質(zhì)量×樣品中蛋白質(zhì)的百分含量)×100

其中,樣品為粉碎后的銀葉樹種子;產(chǎn)品為所提取的蛋白質(zhì);蛋白提取液和產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量用微量凱氏定氮法測定。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 提取溫度的影響 固定pH為10.0,提取時間為1.0h,液料比為10∶1,提取溫度設(shè)定25、35、45、55、65℃五個水平梯度,考察提取溫度對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.4.2 pH的影響 固定提取溫度為55℃,提取時間為1.0h,液料比為10∶1,pH設(shè)定8.0、9.0、10.0、11.0和12.0五個水平梯度,考察pH對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.4.3 提取時間的影響 固定提取溫度為55℃,pH為10.0,液料比為50∶1,提取時間設(shè)定1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h五個水平梯度,考察提取時間對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.4.4 液料比的影響 固定提取溫度為55℃,pH為10.0,提取時間為2.0h,液料比設(shè)定5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1五個水平梯度,考察液料比對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.5 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計 應(yīng)用Design Expert 軟件,根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理,在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,綜合考慮實際生產(chǎn)的需要,以銀葉樹種子為原材料,堿溶pH為X1,提取時間為X2,提取溫度為X3,液料比為X4,蛋白提取率Y為響應(yīng)值,進行響應(yīng)曲面實驗設(shè)計,因素水平見表1。在實驗設(shè)計中,每個實驗點重復(fù)3 次,結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)分析主要采用散點圖、相關(guān)分析和回歸分析等方法進行。

表1 實驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of the experiments

1.2.6 銀葉樹種子蛋白功能特性評價方法 本文分別參照相應(yīng)的參考文獻對銀葉樹種子蛋白的吸水性、吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性功能性進行評價分析[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對銀葉樹種子蛋白提取率的影響

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可知,銀葉樹種子蛋白的提取率隨著溫度的升高而增加,溫度55℃時達到最高值;而提取溫度超過55℃,提取率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。因為蛋白質(zhì)溶解時必須破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用,而加熱使蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的二硫鍵斷裂,亞基伸展,疏水基暴露,使蛋白質(zhì)的氮溶解指數(shù)升高[13];但在溫度高于55℃時,隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)開始變性,蛋白質(zhì)的氮溶解指數(shù)降低。因此,溫度選擇在55℃較為適宜。

圖1 提取溫度對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.2 pH的影響 由圖2可知,在pH10時,蛋白質(zhì)的提取率最好,降低或增加pH均有使蛋白質(zhì)提取率降低的趨勢?？赡苁怯捎趬A液對蛋白質(zhì)體系的平衡和多肽鏈中某些側(cè)鏈基團的解離程度發(fā)生變化的結(jié)果。因此,選擇pH較為10適宜。

圖2 pH對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.3 提取時間的影響 由圖3可知,蛋白質(zhì)的提取率隨著提取時間的延長呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這是由于隨著提取時間的延長,溶液中的蛋白質(zhì)出現(xiàn)凝聚沉淀,離心時蛋白質(zhì)和殘渣一同被排除,從而降低了蛋白質(zhì)的提取率[14-15]。因此,提取時間選擇2h較為適宜。

圖3 提取時間對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.4 液料比的影響 由圖4可知:當液料比為10∶1時,蛋白質(zhì)的提取率最高。在液料比由5∶1上升到10∶1,隨著液料比的增加,蛋白質(zhì)的提取率也升高。液料比達到10∶1后繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)的提取率反而降低了。因此,液料比選擇10∶1較為適宜。

圖4 液料比對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid/solid ratio on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 結(jié)果回歸分析 由單因素實驗可知,不同因素對蛋白提取率的影響程度不同,故以pH、提取時間、液料比和提取溫度四個因素為可控工藝參數(shù),以提取率為實驗指標,采用Box-Behnken設(shè)計方法來優(yōu)化銀葉樹種子蛋白提取工藝條件,實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

利用Design Expert軟件,通過表3中實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得銀葉樹種子蛋白質(zhì)提取率對編碼自變量pH、提取時間、液料比和提取溫度的二次多項回歸方程:

Y=52.83+0.61X1+0.21X2+0.49X3-0.37X4+0.68X1X2+0.47X1X3+0.35X1X4-0.1X2X3-0.24X2X4-0.077X3X4-3.31X12-1.29X22-1.24X32-1.62X42

回歸方程中各變量對蛋白質(zhì)提取率影響的顯著性由F檢驗來判定;概率p越小則相應(yīng)變量的顯著性越高[16]。對上述回歸模型進行方差分析(表3),結(jié)果表明,回歸方程極顯著,相關(guān)系數(shù)的平方即R2=97.20%,說明響應(yīng)值(提取率)的變化有97.20%來源于所選變量,即浸提溫度,浸提時間和料液比。因此,回歸方程擬合度良好,可利用該方程代替真實實驗點進行分析。由P值可知,方程的X1、X3、X1X2、X12、X22、X32和X42對Y值影響極顯著,X4、X1X3對Y值影響顯著,表明該方程并非簡單的線性關(guān)系,交互作用對響應(yīng)值影響很大,方程二次項對響應(yīng)值影響也很大。失擬項p=0.1890,無顯著性影響,表明數(shù)據(jù)沒有異常點,不需要分析更高次數(shù)的項,模型適當。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 響應(yīng)面分析及蛋白質(zhì)提取條件的優(yōu)化 通過響應(yīng)曲面圖可以直觀地反映實驗條件對蛋白質(zhì)提取效果的影響。由圖5可知,提取率隨著溫度的升高而增加,而提取溫度超過50℃,提取率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢;提取率隨著pH的升高而增加,而pH超過10時,呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢;提取率提取率隨著提取時間的增長而顯著增加,而提取時間超過2h,提取率反而有下降的趨勢;蛋白質(zhì)的提取率隨著液料比的增加而增加,而液料比超過10∶1,蛋白質(zhì)的提取率反而降低了。這與單因素實驗的結(jié)果趨勢相同。

表3 回歸模型方程的方差分析Table 3 Analysing variance of regression model

圖5 各因素交互作用對銀葉樹種子蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions on the extraction yield of Heritiera littoralis seed protein

注:Pr值是方差齊性檢查的結(jié)果;**表示極顯著水平(p<0.01);*表示顯著水平(p<0.05)。

為了進一步求得各因素的最佳條件組合,對回歸方程進行數(shù)學(xué)處理,偏導(dǎo)求零后的極值方程組求解,得到銀葉樹種子蛋白提取的優(yōu)化條件為:堿溶pH10.11,時間2.055 h,液料比11.05∶1,溫度56.1℃,此時所得蛋白提取率為52.95%。采取上述最優(yōu)條件進行實驗,同時考慮到實際操作的情況,將銀葉樹種子蛋白質(zhì)提取條件修正為提取溫度55℃、pH10、提取時間2h、液料比11∶1,粗蛋白質(zhì)量分數(shù)為88.53%;實測提取率為50.85%,說明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的實驗參數(shù)是可靠的。

2.2.3 銀葉樹種子蛋白與大豆分離蛋白的功能性質(zhì)比較 實驗將銀葉樹種子蛋白與大豆分離蛋白的幾種功能性質(zhì)進行了比較研究[11],實驗結(jié)果見表4。結(jié)果表明,銀葉樹種子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于大豆分離蛋白;而大豆分離蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于銀葉樹種子蛋白。

表4 銀葉樹種子蛋白和大豆分離蛋白的功能性比較Table 4 Comparing on functionality of Camellia oleifera seed protein and SPI

3 結(jié)論

通過單因素實驗和Box-Behnken實驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析對銀葉樹種子蛋白提取工藝進行了優(yōu)化,各因素對提取率的影響大小為:堿溶pH>提取溫度>液料比>提取時間。結(jié)合實際操作,確定提取銀葉樹種子蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件是:提取溫度55℃、pH10、提取時間2h、液料比11∶1,提取率為50.85%。銀葉樹種子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于大豆分離蛋白;而大豆分離蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于銀葉樹種子蛋白。

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Study on the extraction and function of Heritiera littoralis seed protein

XIONG Zheng,ZHONG Qiu-ping,LI Li-qing

(School of Ocean,Qinzhou University,Qinzhou 535099,China)

The effect of process on extraction rate of Heritiera littoralis seed protein was discussed in this study. The factors of pH,temperature,time,and liquid/solid ratio were studied by single factor experiments,and Box-Behnken design and response surface methodology were applied to confirm the optimum experiment condition. The highest protein extraction rate was 50.85% under the condition:temperature(55℃),pH10,extraction time 2h,liquid/solid ratio 11∶1. The water retention capability,foaming properties and foaming stability of Heritiera littoralis seed protein were better than SPI;the oil-absorbing,emulsifying capacity,and emulsifying stability of SPI were better than Heritiera littoralis seed protein’s.

response surface methodology(RSM);Heritiera littoralis seed;protein;extraction

2014-02-10

熊拯(1981-)，男，碩士，副教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(2013YB260)。

TS202.1

B

1002-0306(2015)01-0239-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.041