蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶產(chǎn)生菌的分離篩選和鑒定

張艷芳,賈彩鳳,何 燦,康 立,黃 迪,成 楠,寧顯尚,黃 靜,金明飛,魯 偉,步國建,高紅亮,*

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200241;2. 泰興市東圣食品科技有限公司,江蘇泰興 225411)

蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶產(chǎn)生菌的分離篩選和鑒定

張艷芳1,賈彩鳳1,何 燦1,康 立1,黃 迪1,成 楠1,寧顯尚1,黃 靜1,金明飛1,魯 偉2,步國建2,高紅亮1,*

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200241;2. 泰興市東圣食品科技有限公司,江蘇泰興 225411)

[目的]篩選出能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)的菌株,并對(duì)篩選出的菌株分類和鑒定。[方法]以carboxybenzoxy(Cbz)-Gln-Gly為唯一氮源,從來自全國各地采集到的726份土樣中富集篩選能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的菌株,分別從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)方面對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行分類鑒定,并測(cè)定發(fā)酵上清的脫酰胺活性。[結(jié)果]共篩選到9株產(chǎn)PG酶的細(xì)菌,經(jīng)鑒定,其中7株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes),一株為解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum),另外一株為粘金黃桿菌(Chryseobacterium.gleum)。[結(jié)論]分別發(fā)酵測(cè)定9株菌的PG酶活性,產(chǎn)吲哚金黃桿菌ZYF120413-7發(fā)酵酶活最高,為0.7168U/mL。粘金黃桿菌D4-1-1的產(chǎn)酶能力最低,其酶活為0.1029U/mL。本課題的研究成果擴(kuò)大了PG酶產(chǎn)生菌株的來源,為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶產(chǎn)生菌，分離篩選，金黃桿菌屬，鑒定

天然蛋白質(zhì)含有較多的谷氨酰胺和天冬酰胺殘基,它們會(huì)以氫鍵的形式和其他氨基酸交聯(lián),導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解性降低,進(jìn)而影響蛋白的工藝特性,如乳化性、起泡性、凝膠性等[1]。這限制著蛋白質(zhì)在食品、飲料、保健品、醫(yī)藥領(lǐng)域的很多應(yīng)用。脫酰胺是解決這一問題的重要途徑,研究表明,脫酰胺作用能夠改善蛋白質(zhì)的溶解性和其他功能特性。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG),是近年來才被研究的一種新型水解酶,它能夠脫去多種蛋白質(zhì)、多肽或者短肽的氨基[2],將L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,且僅作用于蛋白質(zhì)或肽的谷氨酰胺基團(tuán),而對(duì)天冬酰胺殘基或游離谷氨酰胺沒有影響,同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和水解[3],從而提高蛋白質(zhì)的溶解度和乳化性等,且該酶在酸性條件下也能起作用,是食品行業(yè)中一種非常有前景的酶。2000年Shotaro Yamaguchi 等從解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670T中首次發(fā)現(xiàn)了PG酶[4],但由于生產(chǎn)菌株的稀少,目前為止,國內(nèi)外對(duì)PG酶的研究主要集中在該酶的結(jié)構(gòu)[5]和應(yīng)用[6-8]上,而對(duì)能夠產(chǎn)生PG酶的其他菌株研究甚少,這在一定程度上限制了PG酶的大量應(yīng)用。因此,研究能夠產(chǎn)生PG酶的其他菌種十分必要。

本文詣在篩選能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的菌株,并對(duì)其進(jìn)行分類鑒定,為以后提高菌株的產(chǎn)酶活性和在食品工業(yè)中的開發(fā)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 9株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的菌株,從采集自全國各地的726份新鮮土樣中分離得到。

培養(yǎng)基:a.篩選培養(yǎng)基(1000mL):carboxybenzoxy(Cbz)-Gln-Gly 1g;Glucose 5g;KH2PO40.2g;MgSO4·7H2O 0.2g;NaCl 0.1g;CaCl20.02g;FeSO4·7H2O 0.002g;NaMO4·2H2O 0.005g;NaWO4·4H2O 0.005g;MnSO4·4H2O 0.005g;CuSO4·5H2O 0.1g;pH 8.0。b. PY培養(yǎng)基(1000mL):polypeptone 10g,Yeast Extract 2g,MgSO4·7H2O 1g。調(diào)pH至7.0。c. 發(fā)酵培養(yǎng)基(1000mL):lactose 5g;polypeptone 10g;Na2HPO4·H2O 1.7g;KH2PO40.25g;MgSO4·7H2O 0.25g;FeSO4·7H2O 0.05g。調(diào)節(jié)pH至7.2。d. LB培養(yǎng)基,配方略。

藥品和試劑:酵母粉,胰蛋白胨 購自oxide;聚蛋白胨 購自Nihon Seiyaku;細(xì)菌生理生化鑒定管 購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司(Qingdao Hope Bio-Technology Co.,Ltd);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

電子天平,酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司(北京);全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;電熱恒溫干燥箱,恒溫水浴鍋,GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏;恒溫?fù)u床 上海聚辰科學(xué)儀器公司;高速冷凍離心機(jī) Thermo;Hitech反滲透超純水機(jī) 上海和泰儀器有公司;可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 土壤樣品的采集與處理

土樣按照隨機(jī)、等量、多點(diǎn)混合的原則進(jìn)行采集,選擇五點(diǎn)取樣法,用取土鏟鏟去2～5cm的表層土,每個(gè)點(diǎn)取樣100g左右,然后將所取的5個(gè)點(diǎn)的土樣壓碎,充分混合均勻,依四分法棄去多余部分,揀去枯枝敗葉、石礫等雜質(zhì),保留土樣50g左右,存放于4℃的冷藏庫,用于菌株的篩選來源。

1.3 平板法初步篩選產(chǎn)PG酶的菌株

稱取土樣10g加入到含有適量玻璃珠和90mL蒸餾水的錐形瓶中,混勻,制備成土壤懸液。取土壤懸液在超凈臺(tái)內(nèi)靜置10min后的上清液,以2%接種量接種于篩選培養(yǎng)基,220r/min 30℃,培養(yǎng)富集6d。之后取富集后的菌懸液在相同條件下再次富集培養(yǎng)3d。將二次富集后的培養(yǎng)液以10倍梯度稀釋,涂布于LB固體平板,30℃恒溫倒置培養(yǎng)1～2d。用3% KOH溶液噴灑在黃色或橘黃色菌落表面,若菌落變成紅色,則再噴灑3% HCl溶液。若菌落又變回黃色或橘黃色,即為疑似菌株,并進(jìn)行進(jìn)一步篩選。挑取疑似菌株接種于LB平板,30℃恒溫倒置培養(yǎng)1～2d。進(jìn)行簡(jiǎn)單染色,觀察菌落形態(tài);并進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色,選取革蘭氏陰性,桿狀,不產(chǎn)芽孢的菌株,以Cbz-Gln-Gly為底物,測(cè)定其發(fā)酵上清中的酶活,進(jìn)行復(fù)篩。

1.4 產(chǎn)PG酶菌株的搖瓶復(fù)篩

將篩選到的疑似菌株挑取單菌落接種于試管斜面,30℃恒溫培養(yǎng)1～2d。從試管斜面上刮下菌體,制備菌懸液,接種于PY培養(yǎng)基,30℃ 200r/min恒溫培養(yǎng)12～14h,再以2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃ 200r/min恒溫培養(yǎng)10～15h,4℃,10000r/min離心,棄菌體,上清液中蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活性的測(cè)定方法參考GRAS Notice No. GRN 000267(FDA,2008)并稍作改進(jìn)。即將上清液稀釋5倍,取0.1mL的上清稀釋液加入到試管中,37℃溫浴1min;然后向其中加入已預(yù)熱的0.01mol/L Cbz-Gln-Gly溶液或1.0% 酪蛋白溶液 1mL,37±0.5℃溫浴反應(yīng)60min。然后加入1mL的三氯乙酸溶液,混合均勻,終止反應(yīng)。苯酚法測(cè)定反應(yīng)后溶液中氨的含量。A630測(cè)定吸光值A(chǔ)1。對(duì)照組為先加入三氯乙酸溶液后反應(yīng)60min后再加入底物溶液。其余操作同實(shí)驗(yàn)組。測(cè)定A630為A2。規(guī)定每分鐘產(chǎn)生1μmol氨所需的酶的量為一個(gè)酶活單位(1U)。發(fā)酵液中酶活計(jì)算公式如下:

酶活力(U/mL)=(A1-A2)×2.1/0.1×1/17.03×1/60×a×5

A1:實(shí)驗(yàn)組的吸光值;A2:對(duì)照組的吸光值;a:苯酚法測(cè)定的氨的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

然后選取搖瓶法初篩得到的酶活性較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩,重復(fù)3次以上。選取酶活性較高且相對(duì)穩(wěn)定的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定。

1.5 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選到的菌株于LB平板上畫線法分離單菌落,觀察各菌株的單菌落的狀態(tài);并進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色[9]。

1.6 菌株的生理生化鑒定

取平板上分離的單菌落,參考說明書通過直接接種法或菌懸液法接種于制備好的生理生化管中,根據(jù)需要培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間,觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 16S rDNA序列測(cè)定及分析

提取所篩選菌株的總基因組DNA,并以此為模版,擴(kuò)增該菌株的16S rDNA序列,其引物序列為7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′),1540r(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,割膠回收,并送公司測(cè)序。測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將測(cè)得的16S rDNA序列提交到GenBank,并在RDP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列匹配,從中得到同源性較高的其他菌株的16S rDNA序列。下載并比對(duì)分析這些同源性較高的菌株的16S rDNA序列,連同目的序列在ClustalX1.83軟件中進(jìn)行比對(duì),去除兩端冗余序列,保存為.aln格式,然后在MEGA5.1中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,對(duì)菌種進(jìn)行分類。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)選擇neighbor-joining tree,設(shè)定Bootstrap replication為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣信息的統(tǒng)計(jì)和分析

按照土樣的標(biāo)準(zhǔn)采集方法,我們從全國各地共采集到726份土樣,這些樣品覆蓋了中國的25個(gè)省、直轄市,其分布情況見圖1(A)。其中華東地區(qū)包括上海市、山東省、江蘇省、安徽省、浙江省、福建省,共采集到275份土樣,占全部樣本的38%;西南地區(qū)(包括重慶市、四川省、貴州省、云南省、西藏自治區(qū))和華中地區(qū)(湖北省、湖南省、河南省,江西省)分別采集到177份和108份,分別占樣本的24%和15%。采樣的地理?xiàng)l件和環(huán)境多種多樣,如樹林、草原、農(nóng)田、山地、公路邊、花園、果園、茶園等,具體分布情況見圖1(B)。充足的樣本量和各種各樣的地理環(huán)境為不同微生物的生長和繁殖提供了可能性,為后續(xù)篩選產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的菌株提供了廣泛而充足的來源。

圖1 土樣的地理分布(A)和采樣環(huán)境情況(B)Fig.1 The geographical distribution(A) and the environment(B)of soil samples

2.2 產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株的篩選和分離

以Cbz-Gln-Gly為唯一氮源,經(jīng)兩次富集和平板篩選,我們從726份土樣中篩選到168株疑似菌株。這些菌株經(jīng)純培養(yǎng)后,發(fā)酵測(cè)定上清液中的PG酶活性,每個(gè)菌株3個(gè)平行。其結(jié)果見圖2(A)。由該圖可知,大部分菌株的酶活性都比較低,沒有利用價(jià)值。而酶活在0.6U/mL以上的菌株有24株,選取這些菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩,每個(gè)菌株3個(gè)平行,重復(fù)篩選3次。第三次搖瓶復(fù)篩的產(chǎn)酶情況見圖2(B)。在進(jìn)行搖瓶復(fù)篩時(shí),發(fā)現(xiàn)很多菌的產(chǎn)酶能力都有所下降,有些菌株的產(chǎn)酶能力不穩(wěn)定,而有的菌株退化很快,傳到第三代時(shí)菌株的產(chǎn)酶能力幾乎為零,進(jìn)行分離純化復(fù)壯之后,酶活力有所提高。我們從中挑選了7株產(chǎn)酶能力較高且相對(duì)穩(wěn)定的菌株(ZYF120413-7、Y8-12-1、D4-19-1、Y6-17-1、CFL-4-40、HC-12、ZYF120111-1)和2株產(chǎn)酶能力不高但很穩(wěn)定的菌株(ZYF120810-1和D4-1-1)進(jìn)行鑒定。

圖2 產(chǎn)PG酶菌株的搖瓶初篩和復(fù)篩Fig.2 The screening of strains producing protein-glutaminase with shake-flask cultureA：平板初篩得到的菌株首次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)酶情況; B：搖瓶法重復(fù)發(fā)酵三次后的產(chǎn)酶情況。

2.3 細(xì)菌的形態(tài)和生理生化特征

將9株篩選到的細(xì)菌平板劃線法于LB固體培養(yǎng)基上分離單菌落,30℃培養(yǎng)48h,觀察菌株在LB平板上的生長狀況。這9株菌形成的菌落均呈圓形,邊緣整齊,金黃色或橘黃色,不透明,菌落表面濕潤光滑,有光澤。進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色發(fā)現(xiàn),菌株均呈桿狀,革蘭氏陰性,不產(chǎn)芽孢。其中Y8-12-1的革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果如圖3所示。然后用KOH溶液對(duì)菌株產(chǎn)生的色素再次進(jìn)行鑒定。其中一株菌Y8-12-1的KOH變色反應(yīng)如圖4所示。由圖可知,該菌株能夠產(chǎn)生典型的黃色色素,且該色素能夠與稀堿溶液KOH起反應(yīng),而變成橘紅色或棕黃色。而用HCl溶液中和后,又變回原來的顏色。能夠產(chǎn)生有此性質(zhì)的不溶性黃色色素是金黃桿菌屬細(xì)菌的典型特征之一,此外產(chǎn)黃色素的細(xì)菌還有假單孢菌屬和類黃桿菌屬。由此,可初步確定該菌株歸屬于金黃桿菌屬或其相近屬。而其他8株菌都有相同的顏色變化。

表1 所篩選菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和比較Table 1 The physiological test results of the isolates and their comparison

圖3 Y8-12-1的革蘭氏染色和芽孢染色觀察Fig.3 The results of Gram’s staining and spore staining of the Y8-12-1A：革蘭氏染色圖;B：芽孢染色圖。

圖4 KOH溶液鑒定菌株產(chǎn)生的色素Fig.4 Change in color of ZYF120413-7 by 3% KOH and 3% HClA：KOH溶液作用前;B：KOH溶液作用后; C：HCl溶液中和后。

注:“+”,陽性;“+-”,弱陽性;“-”,陰性。

對(duì)所篩選到的菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定,結(jié)果如表1所示。所篩選到的菌株氧化酶、過氧化氫酶均呈陽性,可水解淀粉、明膠、七葉苷等,并能利用麥芽糖、葡萄糖、木糖、海藻糖、阿拉伯糖等產(chǎn)酸。其中D4-1-1和ZYF120810-1的生理生化特征和其他7株有較大差異。將菌株的菌落形態(tài)、生理生化特征與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]中描述進(jìn)行比對(duì),并查閱相關(guān)參考文獻(xiàn),可初步認(rèn)定所篩選的菌株歸屬于為金黃桿菌屬。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析

圖5 相鄰交聯(lián)法構(gòu)建所篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbour-joining tree of the isolates based on nearly completed 16SrDNA sequences, the scale bar indicates 0. 02 subtitutions per nucleotide position

分別將測(cè)序得到的各菌株的16S rDNA堿基全長序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast軟件與已有細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì),發(fā)現(xiàn)ZYF120413-7、Y8-12-1、D4-19-1、Y6-17-1、CFL-4-40、HC-12、ZYF120111-1比對(duì)出的序列幾乎相同,與之同源性較高的典型菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes)LMG 8337(NR_042507.1)。而與D4-1-1同源性較高的菌株為粘金黃桿菌(Chryseobacteriumgleum)CCUG14555(NR_042506.1),與ZYF120810-1同源性較高的菌株為解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670T(AB039830)。然后提交目的序列到RDP數(shù)據(jù)庫中并搜索和其親緣關(guān)系最近的菌株,其數(shù)據(jù)集選擇可培養(yǎng)的典型菌株,可知所篩選菌株的分類學(xué)地位均為:Bacteriadomain,Bacteroidetesphylum,Flavobacteriaclass,Flavobacterialesorder,Flavobacteriaceaefamily,Chryseobacteriumgenus。結(jié)果如圖5。從圖中可以看出,菌株ZYF0810-1與Chryseobacteriumproteolyticum的親緣關(guān)系最近,且結(jié)點(diǎn)處的數(shù)值為100,這表明在1000次的bootstrap運(yùn)算中,兩者聚類到一起的幾率為100%。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析的結(jié)果,可以確定菌株ZYF0810-1是解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum),命名為解朊金黃桿菌ZYF0810-1(ChryseobacteriumproteolyticumZYF0810-1)。同理,D4-1-1命名為黏金黃桿菌D4-1-1(ChryseobacteriumgleumD4-1-1),其余菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes)。

2.5 所篩選菌株的產(chǎn)酶能力比較和分析

將所篩選到的9株細(xì)菌反復(fù)發(fā)酵,測(cè)定上清液中的PG酶對(duì)底物Cbz-Gln-Gly的活性,其結(jié)果如表2所示。Chryseobacteriumindologenes的產(chǎn)酶能力較高,最高為0.7168U/mL,最低為0.6348U/mL,其平均值為0.6759U/mL,是Shotaro Yamaguchi 在2000年篩選出的菌株Chryseobacteriumproteolyticum9670T的產(chǎn)生的酶活性的2.6倍[4]。而另外兩株菌的酶活力較低。

3 結(jié)論與討論

通常去?；鞍踪|(zhì)因?yàn)閹ж?fù)電的基團(tuán)增多而使等電點(diǎn)降低[12],從而使蛋白質(zhì)在弱酸性環(huán)境下的溶解性增強(qiáng)。一般來說利用酸、堿或機(jī)械處理蛋白質(zhì)可改善蛋白質(zhì)的溶解性能,但副作用較大,會(huì)破壞蛋白質(zhì)的其他功能[13-14]。所以現(xiàn)在多采用作用條件比較溫和的酶來達(dá)到改善蛋白質(zhì)功能的目的。研究表明,蛋白酶可用于蛋白質(zhì)的脫酰胺作用,從而改善蛋白質(zhì)的溶解性和其他功能特性,但是蛋白酶容易引起肽鏈水解,氨基酸消旋等,產(chǎn)生不良的風(fēng)味[15]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,EC 2.3.2.13)是一種從哺乳類到微生物類分布很廣泛的酶,該酶催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的?；D(zhuǎn)移反應(yīng),許多有機(jī)氨類,包括蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基,可以作為酰基受體。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有有機(jī)氨時(shí),水可以作為?；荏w,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的脫酰胺反應(yīng)。但是TG酶容易引起蛋白質(zhì)交聯(lián),從而使蛋白質(zhì)不溶性增加。但若其過量使用,會(huì)對(duì)食物造成凝聚等現(xiàn)象。肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase,EC 3.5.1.43/44)也可用于改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì),只對(duì)分子量低于5000的多肽的谷氨酰胺酰殘基起作用,對(duì)高分子量的多肽和蛋白不發(fā)揮作用,且脫酰胺程度不高[16]。

表2 所篩選菌株的產(chǎn)酶能力比較Table 2 The comparison of protein-glutaminase activity of the isolates

蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)的脫酰胺作用較好,具有十分廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。2000年Shotaro Yamaguchi 等從解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670T中首次發(fā)現(xiàn)了PG酶[4],隨后公布了該酶的基因序列[17];2010年Kumeta H等揭示了PG酶高級(jí)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理[5],隨后各研究小組陸續(xù)報(bào)導(dǎo)了該酶對(duì)小麥蛋白[6]、米谷蛋白[7]、大豆蛋白[18]、玉米蛋白[19]、脫脂牛奶[8]等多種蛋白的影響。2012年汪正華[20]通過重疊延伸PCR法合成了PG酶的全長基因,并對(duì)其蛋白進(jìn)行了重組表達(dá)。2013年Noriko Miwa研究了PG酶作用后的乳清分離蛋白構(gòu)象的改變和它的凝膠性能之間的關(guān)系[21],Chun Cui研究了PG酶對(duì)小麥蛋白的結(jié)構(gòu)影響[22],而Suppavorasatit則對(duì)PG酶處理后的豆?jié){中蛋白的溶解度和豆?jié){風(fēng)味的影響進(jìn)行了探究[23]。

雖然PG酶的脫酰胺作用較好,但目前國內(nèi)外對(duì)PG酶的研究主要集中在該酶的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用上,而對(duì)能夠產(chǎn)生PG酶的其他菌株研究甚少,且目前用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株9670T產(chǎn)酶能力較低,這在一定程度上限制了PG酶的大量應(yīng)用。因此,研究能夠產(chǎn)生PG酶的其他菌種十分必要。

土壤被認(rèn)為是地球上微生物多樣性最豐富的環(huán)境,據(jù)估算,每克土壤中約含數(shù)萬個(gè)物種,100億左右微生物,而其中有1%的物種可通過分離培養(yǎng)進(jìn)行研究[24]。中國地域廣闊,地形多樣,自然環(huán)境復(fù)雜,土壤的物質(zhì)組成、理化過程等更是豐富多樣,這為微生物的生長和繁殖提供了各種各樣的物理結(jié)構(gòu)與化學(xué)營養(yǎng),因此我國的微生物資源十分豐富。所以我們推測(cè)從我國的土壤中應(yīng)該可以找到PG酶的高產(chǎn)菌株,然后對(duì)其進(jìn)行改造,用于工業(yè)生產(chǎn)。

本研究從全國各地采集土樣,以Cbz-Gln-Gly為唯一氮源進(jìn)行富集和篩選能夠產(chǎn)生PG酶的菌株。我們從中篩選到9株能夠產(chǎn)生PG酶的細(xì)菌,并比較了它們形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)及產(chǎn)酶能力的差異。經(jīng)鑒定,9株菌均為金黃桿菌屬,這一方面與本文的篩選方法有關(guān),但同時(shí)也說明金黃桿菌屬中能夠產(chǎn)生PG酶的菌株較多。9株菌中,其中一株菌Y8-10-1與目前用于工業(yè)生產(chǎn)的9670T是同一種,為解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum),酶活性也與之相近,為0.2357U/mL。而產(chǎn)吲哚金黃桿菌的PG酶酶活最高為0.7168U/mL,顯著高于9670T。

本課題的研究成果擴(kuò)大了PG酶產(chǎn)生菌株的來源,并給我們一個(gè)提示,PG酶的產(chǎn)生菌株可能廣泛存在于自然界中,我們可以尋找其他的篩選方法,以得到產(chǎn)酶能力更高,性能更加優(yōu)良的菌株,為工業(yè)生產(chǎn)PG酶打下良好的基礎(chǔ)。但是本課題還有很多地方需要深入研究,比如以上菌株產(chǎn)生的PG酶的基因序列,結(jié)構(gòu)酶學(xué)性質(zhì)是否有差異,酶的分離純化條件還有待于研究,菌株的培養(yǎng)條件等還有待于優(yōu)化。

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Isolation and identification of nine bacteria strains producing Protein-glutaminase

ZHANG Yan-fang1,JIA Cai-feng1,HE Can1,KANG Li1,HUANG Di1,CHENG Nan1,NING Xian-shang1，HUANG Jing1,JIN Ming-fei1,LU Wei2,BU Guo-jian2,GAO Hong-liang1,*

(1. College of Life Science,East China Normal University Shanghai 200241,China;2.Taixing Dongsheng Food Science and Technology co.,LTD,Taixing 225411,China)

[Objective]Isolating and screening the strains producing Protein-glutaminase and then making Identification of them.[Methods]726 soil samples from all over the country were collected,from which the strains producing Protein-glutaminase were enriched with Cbz-Gln-Gly as the sole nitrogen source by preliminary screening in plates. Then the isolates were identified in morphology,physiology and molecular biology. The enzyme activity of deamidation was also been detected.[Results]Totally 9 strains that could produce PG were isolated,of which 7 bacteria were identified asChryseobacteriumindologenes,one was identified asChryseobacteriumproteolyticumand another was identified asChryseobacterium.gleum.[Conclusions]The 9 strains were fermented in aerobic,and the PG activity in fermentation supernatant was tested. The results shown thatChryseobacteriumindologenesZYF120413-7 had the highest enzyme activity with 0.7168U/mL.Chryseobacterium.gleumcame the lowest with only 0.1029U/mL. This study enlarged the source of the PG producing strains,lying a good foundation for the following research.

strain of producing protein-glutaminase;screening and isolation;Chryseobacteriumgenus;identification

2014-03-05

張艷芳(1987-),女,碩士研究生,研究方向:食品微生物學(xué)及應(yīng)用。

*通訊作者:高紅亮(1973-),男,博士，副教授,研究方向:微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶,丙酸桿菌細(xì)菌素和大豆多糖的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用等。

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201310255)。

TS

A

1002-0306(2015)01-0170-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.027