芽孢桿菌配伍發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)中性蛋白酶條件研究

溫?fù)碥?游玟娟,郭 浪

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南株洲 412004)

芽孢桿菌配伍發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)中性蛋白酶條件研究

溫?fù)碥?游玟娟,郭 浪

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南株洲 412004)

為了提高中性蛋白酶的產(chǎn)量,采用響應(yīng)曲面法研究了微生物配伍發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)中性蛋白酶的條件。確定了微生物配伍菌種為BacillussubtilisUV-7+UN-11(1∶1);在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以中性蛋白酶活力為指標(biāo),進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì),獲得最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度35.7℃,轉(zhuǎn)速193r/min,接種量為7.58%,該條件下中性蛋白酶活力的理論值為2709.9U/mL,在最佳條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證,中性蛋白酶活力為(2714.5±2.4)U/mL,與理論預(yù)測值基本一致,比未優(yōu)化前的2602.7U/mL提高了4.3%。

芽孢桿菌,菌株配伍,菜籽粕,中性蛋白酶,發(fā)酵條件

中性蛋白酶是一類能在中性pH條件下,將蛋白質(zhì)水解成肽類和部分游離氨基酸的內(nèi)肽酶。它在食品工業(yè)、皮革工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)及化妝品行業(yè)等方面有廣泛的應(yīng)用[1-6]。菜籽粕是油菜籽經(jīng)預(yù)壓浸出工藝處理后得到的副產(chǎn)物,其含蛋白質(zhì)、粗纖維較豐富。常用來做飼料蛋白、有機(jī)肥料、提取植酸、單寧等化工原料,還可用作食品添加劑[7-11]。但以菜籽粕為原料,通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用芽孢桿菌配伍發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)中性蛋白酶,并采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵條件,旨在提高酶產(chǎn)量,進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。利用菜籽粕發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶,對擴(kuò)大菜籽粕的應(yīng)用范圍,提高菜籽粕的附加值,促進(jìn)其綜合利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) 購于中國微生物菌種保藏中心;枯草芽孢桿菌BacillussubtilisUV-7、UN-11,本實(shí)驗(yàn)組誘變所得中性蛋白酶高產(chǎn)突變株;斜面培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,瓊脂2%;液體種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%;液體發(fā)酵培養(yǎng)基:菜籽粕 5%,Na2HPO4·12H2O 0.04%,KH2PO40.03%,CaCl20.1%,調(diào)至pH7.0。

超凈工作臺CBV-1500A 上海瑞仰凈化裝備有限公司;恒溫培養(yǎng)搖床QYC.2102 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;生化培養(yǎng)箱HPS-250 哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠;紫外可見分光光度計(jì)UV-9100 北京瑞利分析儀器公司;離心機(jī)LDZ4-0.8A 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;水浴鍋HH.SYH-Ni2-C 北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表2 不同菌株配伍發(fā)酵中性蛋白酶活Table 2 Protease activity of products fermented by different strains and their combination

注:BL為Bacilluslicheniformis的簡稱。

1.2.1 菜籽粕脫毒處理 采用純堿脫毒法[12],向菜籽粕中加入10%的純堿溶液,加壓蒸沸15min,去除硫甙等有毒物質(zhì)。

1.2.2 配伍菌種的選擇 將供試的三種菌株制成搖瓶種子液,兩兩配伍或三者配伍(比例均為1∶1)按6%總接種量接入裝有100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,置于溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200r/min搖床上發(fā)酵培養(yǎng)48h時,測定中性蛋白酶活力。

1.2.3 粗酶液制備 取一定量的發(fā)酵液,置于4000r/min的離心機(jī)上離心分離15min,取上清液經(jīng)8層紗布過濾所得澄清液體即為粗酶液。

1.2.4 酶活力測定 按蛋白酶活力測定法GB/T23527-2009進(jìn)行[13]。酶活力單位定義:在pH7.0、40℃條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位(U)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),探討各因素對中性蛋白酶活的影響。

取6個250mL搖瓶,裝入100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基后,按6%的總接種量(UV-7、UN-11 各3%)接入種子液,分別置于溫度分別為30、32、34、36、38、40℃,轉(zhuǎn)速200r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)48h。

取5個250mL搖瓶,裝入100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基后,按6%的總接種量(UV-7、UN-11 各3%)接入種子液,置于溫度為36℃,轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)分別發(fā)酵36、42、48、54、60h。

取5個250mL搖瓶,裝入100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基后,按6%的總接種量(UV-7、UN-11 各3%)接入種子液,分別置于轉(zhuǎn)速為140、170、200、230、260r/min,溫度為36℃的搖床發(fā)酵培養(yǎng)分別發(fā)酵48h。

取5個250mL搖瓶,裝入100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基后,分別接入2%、4%、6%、8%、10%的種子液,于溫度為36℃、轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床發(fā)酵培養(yǎng)分別發(fā)酵48h。

取5個250mL搖瓶,分別裝入將60、80、100、120、140mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基,按6%的總接種量(UV-7、UN-11 各3%)接入種子液,置于轉(zhuǎn)速為200r/min,溫度為36℃的搖床發(fā)酵培養(yǎng)分別發(fā)酵48h。

1.2.6 響應(yīng)面分析 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,按Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取溫度、轉(zhuǎn)速、接種量進(jìn)行三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn),見表1。利用mintab15軟件進(jìn)行分析,確定最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株配伍發(fā)酵結(jié)果

按實(shí)驗(yàn)方法,將三種供試菌種按1∶1比例配伍發(fā)酵48h測定中性蛋酶活力,得到結(jié)果如表2所示。

從表2結(jié)果可知,單菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力:UN-11>UV-7>BL,在配伍組合中,UV-7+UN-11中性蛋白酶活力最高,達(dá)到2602.7U/mL,該兩菌株表現(xiàn)出良好的協(xié)同性。而BL菌株無論是與UV-7、UN-11兩兩配伍,還是BL+UV-7+UN-11三者配伍,中性蛋白酶活力均大大降低,表現(xiàn)出該菌株與UV-7和UN-11之間存在一定的拮抗性,因此,最佳配伍組合菌株為UV-7+UN-11。

表1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Factor and levels table of BBD design

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 發(fā)酵溫度對中性蛋白酶活力的影響 溫度能對細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)速度產(chǎn)生作用,對細(xì)胞的生長和代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響,溫度過高或過低對發(fā)酵產(chǎn)物的積累都是不利的。一般來講,微生物在一定條件下發(fā)酵,均存在一個最利于發(fā)酵產(chǎn)物積累的溫度,即最適發(fā)酵溫度。從圖1結(jié)果來看,發(fā)酵溫度對中性蛋白酶活力存在顯著影響。當(dāng)發(fā)酵溫度逐漸增加時,中性蛋白酶活力大小呈“鐘罩”狀,最適發(fā)酵溫度為36℃,該溫度下中性蛋白酶活力為2635.4U/mL。

圖1 發(fā)酵溫度對中性蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on neutral protease activity

2.2.2 發(fā)酵時間對中性蛋白酶活力的影響 由圖2可知,發(fā)酵時間在30～54h內(nèi),中性蛋白酶活力隨時間的增加而增大,但超過48h后,增速緩慢;而當(dāng)發(fā)酵時間超過54h后,中性蛋白酶活力反而下降。原因是中性蛋白酶的積累與芽孢桿菌的生長不一致,有一定的“滯后性”。從效益角度來看,發(fā)酵時間選48h為佳。

圖2 發(fā)酵時間對中性蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of time on neutral protease activity

2.2.3 轉(zhuǎn)速對中性蛋白酶活力的影響 因?yàn)檠挎邨U菌是好氧微生物,溶氧是其液體發(fā)酵主要限制因素。一定的搖床轉(zhuǎn)速能促進(jìn)氣液間傳質(zhì),提高溶氧濃度有利于發(fā)酵,提高產(chǎn)量。但轉(zhuǎn)速過快,會產(chǎn)生過大的剪切力,損傷細(xì)胞而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。由圖3可以看出,轉(zhuǎn)速對中性蛋白酶活力影響顯著。當(dāng)轉(zhuǎn)速200r/min時,中性蛋白酶活力最高,為2660.2U/mL,再降低或升高轉(zhuǎn)速,中性蛋白酶活力均明顯下降,故轉(zhuǎn)速宜選200r/min。

圖3 轉(zhuǎn)速對中性蛋白酶活力的影響Fig. 3 Effect of revolution on neutral protease activity

2.2.4 接種量對中性蛋白酶活力的影響 從圖4可知,接種量對中性蛋白酶活力影響較為顯著,且呈正相關(guān)。接種量為6%,中性蛋白酶活力為2670.6U/mL。但當(dāng)接種量>6%后,酶活的增速減緩。適當(dāng)增加接種量,能節(jié)約生產(chǎn)時間,但接種量太大則會增加制備種子液的成本,因此接種量宜選6%。

圖4 接種量對中性蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of inoculum concentration on neutral protease activity

2.2.5 裝液量對中性蛋白酶活力的影響 在搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,裝液量對發(fā)酵的溶氧量影響極大,裝液量少則溶氧高,反之則反。由表3可知,裝液量越少溶氧越高,單位體積中性蛋白酶活力越高,總酶活則100mL裝液量時最高,達(dá)到2.70×105U。故裝液量宜選100mL。

表3 裝液量對中性蛋白酶活力的影響Table 3 Effect of medium volume on neutral protease activity

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

選取對影響中性蛋白酶活力較顯著的3個因素作為考察對象,即溫度(X1)、轉(zhuǎn)速(X2)、接種量(X3)。其它因素選最佳水平。按Box-Behnken設(shè)計(jì),進(jìn)行3因素3個水平實(shí)驗(yàn)。BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析均采用Minitab15軟件。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Box-Behnken design and experimental results

利用 Minitab15軟件對表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸模型:中性蛋白酶活力 Y=2715.4-8.6X2-12.4X3-61.7X12-22.3X22+36X1X2-24X1X3-24.8X2X3。模型的方差分析表明(見表5),模型回歸的p=0.000,失擬項(xiàng)的p=0.136>0.1,說明模型失擬不顯著,回歸顯著。轉(zhuǎn)速(X2)、接種量(X3)以及X1、X2平方項(xiàng)和交互項(xiàng)對中性蛋白酶活力影響顯著,而溫度(X1)與X3平方項(xiàng)不顯著。R2(調(diào)整)=96.55%,表明該模型能夠解釋96.55%酶活隨發(fā)酵條件的變化,可用該模型預(yù)測發(fā)酵中中性蛋白酶活力的理論值。對模型求解,得到最佳條件為:X1=-0.15、X2=-0.35、X3=1.58,換算成實(shí)際水平,即:發(fā)酵溫度35.7℃,轉(zhuǎn)速193r/min,接種量為7.58%,該條件下中性蛋白酶活力的理論值為2709.9U/mL,在最佳條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證,所得結(jié)果平均值為(2714.5±2.4)U/mL,與理論預(yù)測值基本一致,說明模型對實(shí)際生產(chǎn)有一定指導(dǎo)作用。

表5 模型的方差分析Table 5 Variance analysis of model

采用Mintab15軟件繪制三維響應(yīng)面圖和等高線圖,可直觀地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)間的交互作用,如圖5～圖7。當(dāng)特征值均為正值時,響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面,有極小值存在。當(dāng)特征值為負(fù)值時,為山丘曲面,有極大值存在。當(dāng)特征值有正有負(fù)時,為馬鞍形曲面,無極值存在[14-15]。等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則表示不顯著。從圖5可以看出,當(dāng)接種量固定在X3=0時,等高線呈橢圓形,說明溫度與轉(zhuǎn)速之間的交互作用十分顯著,當(dāng)溫度為35.8℃時,轉(zhuǎn)速在180～196r/min范圍內(nèi),中性蛋白酶活力隨轉(zhuǎn)速增加而增加,當(dāng)轉(zhuǎn)速>196r/min 后,則隨轉(zhuǎn)速增加酶活反而下降,當(dāng)轉(zhuǎn)速為196r/min時,存在最大酶活2716.6U/mL。從圖6、圖7可以看出,響應(yīng)曲面呈馬鞍狀,沒有最大值和最小值,且發(fā)酵溫度與接種量、接種量與轉(zhuǎn)速之間交互作用都極為顯著,對中性蛋白酶活力的影響較復(fù)雜。

圖5 Y=f(X1,X2)響應(yīng)面立體分析和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of y=f(X1,X2)

圖6 Y=f(X1,X3)響應(yīng)面立體分析和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of y=f(X1,X3)

圖7 Y=f(X2,X3)響應(yīng)面立體分析和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of y=f(X2,X3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法研究了微生物配伍發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)中性蛋白酶的條件。確定了微生物配伍菌種BacillussubtilisUV-7+UN-11(1∶1);通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了各顯著因素及水平,分別為:溫度36℃,轉(zhuǎn)速200r/min,接種量6%。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì),進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn),采用Minitab15軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸方程:中性蛋白酶活力 Y=2715.4-8.6X2-12.4X3-61.7X12-22.3X22+36X1X2-24X1X3-24.8 X2X3。得到最佳條件為:發(fā)酵溫度35.7℃,轉(zhuǎn)速193r/min,接種量為7.58%,該條件下中性蛋白酶活力的理論值為2709.9U/mL,在最佳條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證,所得結(jié)果平均值為(2714.5±2.4)U/mL,與理論預(yù)測值基本一致,比未優(yōu)化前的2602.7U/mL提高了4.3%,說明模型對實(shí)際生產(chǎn)有一定指導(dǎo)作用。

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Fermentation conditions of neutral protease on rapeseed meal fromBacilluscompatibility

WEN Yong-jun,YOU Wen-juan,GUO Lang

(Hunan Chemical Industry Vocational Technology Institute,Zhuzhou 412004,China)

In order to increase the yield of neutral protease,the fermentation conditions of strain compatibility based on rapeseed meal were optimized by single factor tests and Response Surface Methodology(RSM). The results showed that the best strain compatibility wasBacillussubtilisUV-7 and UN-11(1∶1). The second-order polynomial model for neutral protease was established,and the optimal fermentation technology was obtained as following:temperature 35.7℃,rotational speed 193r/min,and inoculum concentration 7.58%.Under the optimal conditions,the predicted yield of fitted model was 2709.9U/mL and verification test result was 2714.5±2.4U/mL,which increased 4.3% compared with the original conditions.

Bacillus;strain compatibility;rapeseed meal;neutral protease;fermentation conditions

2014-05-04

溫?fù)碥?1980- )，男，碩士，副教授，研究方向：微生物發(fā)酵工程。

湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)課題(Hnhy2012A003)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)01-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.026