四株野生酵母菌株耐受性的研究

劉興艷,潘 軍,顧一洪,雷 智,蘭 昊,敖曉琳,羅 超

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院,四川雅安 625014)

四株野生酵母菌株耐受性的研究

劉興艷,潘 軍,顧一洪,雷 智,蘭 昊,敖曉琳,羅 超

(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院,四川雅安 625014)

釀酒酵母對于葡萄酒風味形成起著重要的作用,使用產(chǎn)區(qū)酵母釀造葡萄酒可以突出產(chǎn)區(qū)的典型特色,從而避免我國葡萄酒在品種和風格上的單一。本實驗利用WL培養(yǎng)基從采自攀枝花的葡萄自然發(fā)酵液中分離了釀酒酵母,結(jié)合顯微鏡下的細胞形態(tài),及26S rDNA D1/D2區(qū)的序列分析和比對,成功分離得到四株釀酒酵母。進一步對這四株菌株的耐受性(高滲透壓、高溫、營養(yǎng)饑餓、高糖濃度、高濃度酒精、低pH)進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四株菌在上述耐受性方面有一定差異,以菌株C1和M1相對較佳。

葡萄酒,釀酒酵母,分離,鑒定,耐受性

葡萄酒的釀造是酵母菌利用葡萄中的糖分生成酒精,同時形成一系列風味物質(zhì)的過程,葡萄酒的風味主要來源于葡萄酒的本身品質(zhì)和酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)物的特性,其中酵母對于葡萄酒風味物質(zhì)的形成起著重要的作用[1]。葡萄酒釀造中有多種微生物參與,但以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)最為重要[2]。原始的葡萄酒發(fā)酵直接利用了附著在葡萄果實上的酵母進行自然發(fā)酵,在此過程中該地區(qū)特有的生物群也參與了發(fā)酵,賦予了葡萄酒特有的風味[3]。但自然發(fā)酵法得到的葡萄酒品質(zhì)不穩(wěn)定,各年份各批次之間差異較大[4]。因此,為了獲得迅速可靠的發(fā)酵,通常采用各種精選的商業(yè)酵母菌株。目前我國葡萄酒生產(chǎn)上大部分依賴進口葡萄酒酵母,使用方便,品質(zhì)穩(wěn)定,但這樣的生產(chǎn)方式造成了我國葡萄酒在品種和風格上比較單一,地域特色不突出的特點[5]。產(chǎn)區(qū)酵母已經(jīng)適應了本地的微環(huán)境,易于在葡萄酒發(fā)酵中占主導地位,而且使用產(chǎn)區(qū)酵母釀造葡萄酒可以保證產(chǎn)區(qū)的典型特色[4,6]。所以,近幾年國內(nèi)外很多學者均將葡萄酒酵母的研究轉(zhuǎn)向了產(chǎn)區(qū)酵母。目前,很多研究者已經(jīng)通過菌種選育,篩選到了優(yōu)質(zhì)的本土酵母[3-8]。攀枝花是四川主要的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū),具有得天獨厚的發(fā)展釀酒葡萄的條件。從攀枝花篩選野生酵母有助于為生產(chǎn)具有四川特色的葡萄酒,提高四川葡萄酒的品質(zhì)和知名度提供菌種支持?；诖?本實驗利用了選擇性培養(yǎng)基WL培養(yǎng)基和26s rDNAD1/D2區(qū)序列比對,從攀枝花葡萄自然發(fā)酵過程中分離了幾株野生釀酒酵母,并對其耐受性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄 玫瑰蜜和赤霞珠,充分成熟,采自攀枝花仁和區(qū)平地鎮(zhèn),用密閉的硬質(zhì)材料包裝,轉(zhuǎn)運回實驗室,4℃保存待用。

Bio-rad T100TMPCR儀 美國伯樂公司;DYY-Ⅲ31A/31B型電泳槽、DYY-Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠;SX-300型凝膠成像系統(tǒng) 上海四星生物技術(shù)有限公司;HZQ-X100A恒溫振蕩培養(yǎng)箱 昆山一恒儀器有限公司;GY-600-2L全自動高壓殺菌機 溫州貝諾機械有限公司;全自動蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;SW-CJ-1F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BT124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;XW-80A漩渦混合儀 上海青葩食品包裝機械有限公司。

DNA聚合酶、dNTP 均購自天根生化科技有限公司;DL 5000 DNA ladder、GoldviewTM均購自北京全新拓達生物科技有限公司;6×loading buffer 購自TAKARA公司。

YPD培養(yǎng)基[9]酵母浸粉1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖2.0%、瓊脂2.0%。為了在篩選過程中排除細菌的干擾,在YPD培養(yǎng)基中加100 mg/L的氯霉素;WL培養(yǎng)基[9]配制方法為(按1L計)酵母浸粉4g、胰蛋白胨5g、葡萄糖50g、瓊脂20g、儲液A40 mL、儲液B1 mL,調(diào)pH至6.5,滅菌后加儲液C1 mL。其中,儲液A為磷酸二氫鉀5.5g、氯化鉀4.25g、氯化鈣1.25g、硫酸鎂1.25g,定容至400mL。儲液B為氯化鐵0.25g、硫酸錳0.25g、定容至100mL;儲液C 為0.44g溴甲酚綠溶于20mL50%的酒精中;1%瓊脂糖凝膠的配制 稱取0.2g瓊脂糖,置于三角瓶中,加入25mL 1×TBA,將該三角瓶置于微波爐加熱至瓊脂糖溶解,冷卻至50℃左右時加入1μL GoldviewTM核酸染料,充分混勻。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒酵母的分離鑒定

1.2.1.1 釀酒酵母的選擇性分離 在超凈工作臺上無菌稱量約100g新鮮成熟度好的葡萄,用無菌紗布包裹破碎后將葡萄汁、葡萄果肉和葡萄皮一起放入無菌的500mL三角瓶,置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在發(fā)酵前期(第1d)、中期(第3d)和后期(第6d)各取發(fā)酵液1.0mL,加入9.0mL無菌水中進行梯度稀釋至10-7,取0.1mL稀釋菌液放入YPD固體培養(yǎng)基,以無菌涂布器涂勻,28℃培養(yǎng)24～48h,挑取單菌落保存[5]。

將分離后的菌落,隨機篩選10～15個接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基上,活化24h后接種到WL培養(yǎng)基,27℃培養(yǎng)5d后觀察,篩選出菌落顏色為奶油色略帶綠色、球形突起、表面光滑、不透明、奶油狀[5]。

1.2.1.2 釀酒酵母的鏡檢 對YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后的菌株,以400倍顯微鏡鏡檢,篩選出以多端出芽繁殖的菌株[4]。

1.2.1.3 釀酒酵母DNA模板快速制備 挑取復篩后的典型菌株的新鮮菌體于盛有20μL SDS(0.2%)裂解液的1.5mL離心管中,漩渦振蕩1min。沸水浴5min后,立即放入-20℃中保存15min,再離心(12000r/min)1min,上清液即為DNA模板。

1.2.1.4 26S rDNA D1/D2區(qū)擴增 使用正向引物NL-1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′,反向引物NL-4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′,進行26S rDNA D1/D2區(qū)的擴增。PCR反應體系(30μL)為:1μL DNA模板,正反向引物各1μL,10×buffer 3μL,dNTP 3μL,Taq酶0.5μL,無菌水20.5μL。PCR擴增條件為:94℃ 1min,52℃ 1min,72℃ 1min 30sec,36個循環(huán),4℃保存[9-10]。

1.2.1.5 PCR產(chǎn)物的電泳檢測 1%瓊脂糖凝膠,5μL Marker(DL 5000),各擴增液5μL,loading buffer 1μL。13V/cm電壓電泳15min。若得到條帶不純,則重復擴增步驟。取出膠體,用UVI成像系統(tǒng)拍照。

1.2.1.6 PCR產(chǎn)物測序 將PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序。

1.2.1.7 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序獲得的26S rDNA D1/D2區(qū)核酸序列輸入美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的核酸數(shù)據(jù)庫比對系統(tǒng),利用Blast程序進行比對分析。采用MEGA5.1軟件中的neighbor-joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行1000次Bootstraps檢驗。

1.2.2 酵母的耐受性研究 對四株分離得到的釀酒酵母進行了如下耐受性研究。

1.2.2.1 滲透脅迫耐受性 依次取OD600為1.0的菌液3μL 100、10-1、10-2、10-3、10-4稀釋度的菌液接種于含量為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mol/L的KCl的YPD固體平板上進行生長實驗,25℃培養(yǎng)48～72h,觀察記錄酵母生長狀況[2,11]。

1.2.2.2 高溫耐受性 依次取OD600為1.0的菌液3μL 100、10-1、10-2、10-3、10-4稀釋度的菌液接種于YPD固體平板上并于在37℃和42℃溫度條件下培養(yǎng)48～72h,觀察記錄酵母的生長狀況[2]。

1.2.2.3 營養(yǎng)饑餓耐受性 在無菌條件下將OD600為1.0的菌液分別接種到無菌水中,接種量為1%。在25℃條件下分別靜置5、6、7、8、9和10d,然后接種到Y(jié)PD固體平板上進行生長實驗,25℃培養(yǎng)48～72h,觀察記錄酵母生長情況[11]。

1.2.2.4 高糖耐受性 依次取OD600為1.0的菌液3μL 100,10-1,10-2,10-3,10-4稀釋度的細胞接種于含量為10%、20%、30%、40%和50%的葡萄糖的YPD固體平板上進行生長實驗。在25℃的條件下培養(yǎng)培養(yǎng)48～72h,觀察其生長狀況[2,10]。

1.2.2.5 酒精耐受性 將活化好的菌種(1.0)接種于酒精含量分別為8%、10%、12%、14%和16%vol的YPD液體培養(yǎng)基中,接種量為1%,28℃培養(yǎng)72h,每8h取樣一次,測定其在600nm下的OD值,繪制酵母生長曲線,與未添加酒精所得生長曲線對比,觀察其耐受性[12-13]。

1.2.2.6 低pH耐受性 將活化好的菌種(OD600為1.5)分別接種于pH為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 YPD液體培養(yǎng)基(以5mol/L H2SO4調(diào)節(jié))中,接種量為1%,28℃培養(yǎng)24h,每3h取樣一次,測定其在600nm的OD值,繪制酵母生長曲線,與未調(diào)節(jié)pH(CK)所得生長曲線對比,觀察其耐受性[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母分離

2.1.1 自然發(fā)酵中通過YPD培養(yǎng)后的菌落生長情況 自然發(fā)酵中接種發(fā)酵液到Y(jié)PD培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出稀釋度在10-4～10-6各菌落之間的分離度較好,在稀釋度為10-7的培養(yǎng)基上很少有菌落出現(xiàn)。

圖2 基于26S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 26S rDNA gene sequence

2.1.2 WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基篩選結(jié)果 根據(jù)WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上和YPD培養(yǎng)基上的生長情況,在自然發(fā)酵前期存在的酵母主要是葡萄有孢漢遜酵母。它主要存在于成熟葡萄的漿果表面,不耐酒精,在自然發(fā)酵前期會大量存在[14]。在發(fā)酵前期未篩選到釀酒酵母,這與薛軍俠等[15]的研究結(jié)果一致。在發(fā)酵中期則主要包括葡萄有孢漢遜酵母、克魯維畢赤酵母和釀酒酵母;在發(fā)酵后期,則主要是釀酒酵母。從發(fā)酵中期和后期各挑選出兩株具有典型WL培養(yǎng)基形態(tài)特征和鏡檢特征的菌落,分別編號為C1、M1、P3、Z3,4℃斜面保藏待用。

2.1.3 釀酒酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析 對保存的4株菌株進行26S rDNA D1/D2區(qū)擴增,擴增目的片段長度500～600bp,擴增結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物純化結(jié)果Fig.1 Purification results of PCR products注:1為Marker:DL5000 Lander, 2～5分別為:菌株C1、M1、P3、Z3。

由圖1可以看出,四株野生酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)條帶大小均在600bp左右,符合預定目標。

四株野生菌株的基因序列的測序結(jié)果經(jīng)blast比對后的結(jié)果見表1。測序結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖2。

表1 四株酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)比對結(jié)果Table 1 Blast results of 26S rDNA D1/D2 region of 4 stains

從表1可以看出,所分離到的四株菌株與釀酒酵母菌株的最大相似度均為100%。從圖2構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,C1、M1、P3、Z3與釀酒酵母標準菌株ATCC 18824的同源性最近,因此將其均鑒定為釀酒酵母。

2.2 酵母耐受性研究

2.2.1 滲透脅迫耐受性 四株菌在不同滲透壓YPD平板上生長情況見圖3。

圖3 四株菌在不同滲透壓條件下生長情況Fig.3 Growth performance on different osmotic pressure of the 4 strains

從圖3可以看出當KCl濃度為0.8、1.2、1.6mol/L時，四株菌在不同稀釋度條件下均能生長,但也存在明顯的差異。當KCl濃度達到2.0mol/L時僅有菌液濃度為100可以長出少量菌落,當KCl濃度2.4mol/L時四株菌均不能生長。隨著滲透壓的升高,會引起細胞內(nèi)水分活度、細胞質(zhì)組成均發(fā)生顯著變化,酵母的細胞膜和菌體內(nèi)的酶受到破壞,從而影響酵母的生長和發(fā)酵[11]。從圖3可以看出菌株C1滲透壓耐受性最好,菌株Z3耐受性最差。

2.2.2 高溫耐受性 四株菌在42℃條件下均不能生長,在37℃時均可正常生長。四株菌在37℃下的生長情況見圖4。

圖4 四株菌在37℃下生長情況Fig.4 Growth performance on 37℃ of the 4 strains

從圖4中可以看出各菌株在濃度為100,10-1,10-2,10-3時生長并無明顯差異,當濃度梯度為10-4時各菌株生長狀況出現(xiàn)差異。菌株C1菌落生長最好,菌株M1生長最差。酵母適宜的生長溫度是22～30℃,溫度升高或降低都會影響酵母活性。特別當溫度升高時,酵母生長停止。高溫會破壞生物分子間的氫鍵及疏水鍵,而導致核酸及蛋白質(zhì)的變性進而影響細胞的代謝活動[16]。葡萄酒生產(chǎn)過程中,使用熱浸漬發(fā)酵能改善某些葡萄酒的結(jié)構(gòu)和香氣,加速反應的進程,減少冷卻耗能,提高代謝率,縮短發(fā)酵周期。選育優(yōu)良的耐高溫菌株是實現(xiàn)該工藝的前提[2]。

2.2.3 饑餓耐受性 四株菌在25℃條件下靜置5～10d后的生長情況見圖5。

圖5 四株菌饑餓耐受生長情況Fig.5 Growth performance of starvation tolerance of the 4 strains

從圖5中可以看出各菌株在無菌水中25℃條件下靜置10d依然可以在YPD平板上良好生長,四株菌都表現(xiàn)出良好的饑餓耐受性。隨著發(fā)酵過程的進行,營養(yǎng)物質(zhì)的消耗會影響微生物的發(fā)酵能力,釀酒酵母對營養(yǎng)饑餓耐受性是葡萄酒工藝生產(chǎn)所要求的良好性質(zhì)。一般而言,營養(yǎng)饑餓脅迫主要發(fā)生在發(fā)酵的后期[2]。

2.2.4 高糖耐受性 四株菌在不同濃度的葡萄糖YPD平板上生長情況見圖6。

從圖6可以看到隨著葡萄糖濃度的增加以及菌液稀釋度的不同,四株菌的生長發(fā)生了明顯的變化。當葡萄糖濃度達到30%時,菌液濃度為10-4,菌株P(guān)3未能生長出菌落,其他三菌株都長出了少量菌落。當葡萄糖濃度達到40%時菌株Z3僅在菌液濃度為100能生長,其他三株菌的濃度為10-2時仍能生長出少量菌落。當葡萄糖濃度50%時四株菌均不能生長。葡萄酒工業(yè)中,糖是酒精發(fā)酵的基質(zhì),也是酵母賴以生存的營養(yǎng)物質(zhì)。但是高濃度的糖對酵母具有抑制作用——葡萄糖阻遏和葡萄糖抑制作用。而且,高的滲透壓會導致酵母細胞水分流失,活性降低。此外,培養(yǎng)基中糖濃度較高時,系統(tǒng)粘度較高,CO2釋放緩慢，影響其生長和發(fā)酵的進行[2]。從圖6可以看出菌株M1和P3高糖耐受性相對最好,菌株Z3最差,但對于一般的12°干酒(20%含糖量)來說,四株菌均能耐受對應含糖量。

圖6 四株菌在不同濃度葡萄糖中生長情況Fig.6 Growth performance on different content of glucose of the 4 strains

2.2.5 酒精耐受性實驗 四株菌在不同濃度酒精的YPD液體培養(yǎng)基中生長曲線見圖7。

圖7 四株菌不同酒精濃度條件下生長曲線(n=3)Fig.7 Growth curves in different content of acohol of the 4 strains(n=3)

從圖7中可以看出,隨著乙醇濃度的增加,酵母菌株的延滯期均有所加長甚至出現(xiàn)生長停滯的現(xiàn)象。當乙醇濃度為12%時,雖然延滯期很長但菌株在30h后其OD600值均表現(xiàn)出不同程度的增長。其中菌株Z3增長速度最為緩慢,菌株M1增長最快。當乙醇濃度達到14%及以上時,四株菌生長均發(fā)生停滯。在實際的生產(chǎn)發(fā)酵過程中,隨著發(fā)酵的進行營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗,同時酒精的濃度逐漸升高。酵母對酒精的耐受性直接關(guān)系到發(fā)酵是否徹底、是否完全以及營養(yǎng)物質(zhì)的充分利用與否。

2.2.6 低pH耐受性實驗 四株菌在不同pHYPD液體培養(yǎng)基中生長曲線見圖8。

圖8 四株菌在不同pH條件下的生長曲線(n=3)Fig.8 Growth curves in different pH of the 4 strains(n=3)

從圖8可以看出,隨著pH的降低,四株酵母的生長都受到了不同程度的抑制,當pH為2時,四株酵母均無明顯的生長現(xiàn)象。當pH為2.5及以上時,四株酵母均可以生長,但與YPD相比,隨著pH的降低,酵母的生長受到了不同程度的影響,表現(xiàn)為遲滯期延長,最大OD600減小,其中尤以pH2.5的影響最大。葡萄汁的pH通常在2.75～4.25之間[17]。較低的pH可以抑制雜菌的生長,同時也是葡萄酒風味形成的原因之一。從圖8可以看出,四株菌均滿足葡萄酒生產(chǎn)時葡萄汁的pH要求。

3 結(jié)論

本研究通過鑒別WL營養(yǎng)培養(yǎng)基及YPD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征,成功分離到攀枝花葡萄在自然發(fā)酵中的釀酒酵母菌株,結(jié)合酵母26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對,確認篩選出的四株酵母均為釀酒酵母。從耐受性來看,四株酵母菌株對考察的脅迫條件的耐受性存在一定的差異:四株酵母菌均能耐受2.0mol/L KCl的滲透壓,不能耐受2.4mol/L KCl的滲透壓,其中菌株C1滲透壓耐受性最好,菌株Z3最差;四株酵母菌均能耐受37℃的高溫,均不能耐受42℃,其中菌株C1高溫耐受性最好,菌株M1最差;四株酵母菌均表現(xiàn)出良好的饑餓耐受性;四株酵母菌均能耐受40%的高糖濃度,其中耐受性最好的為M1,最差的為Z3。四株酵母菌均表現(xiàn)出良好的耐低pH性;四株釀酒酵母均能耐受12%的酒精濃度,不能耐受14%及以上的酒精濃度,其中菌株M1對酒精耐受性最好,菌株Z3最差。綜上所述,菌株C1滲透壓耐受性、高溫耐受性好于其他三株菌,同時具有優(yōu)良的饑餓耐受性、耐低酸性。菌株M1高糖耐受性、酒精耐受性好于其他三株菌,同時具有優(yōu)良的饑餓耐受性、耐低酸性。菌株C1和M1在實驗的四株菌中耐受性相對較好。

通過耐受性實驗選育出的菌株C1和M1為生產(chǎn)具有四川地域特色的葡萄酒提供了初步的實驗菌株。耐受性好的菌株并不意味著一定能生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的葡萄酒,下一步工作將對C1和M1進行發(fā)酵性能的研究,并采用真實葡萄進行發(fā)酵工藝的研究。

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Stress tolerances of four wild yeast strains

LIU Xing-yan,PAN Jun,GU Yi-hong,LEI Zhi,LAN Hao,AO Xiao-lin,LUO Chao

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Saccharomycescerevisiaeis critical for flavor formation during wine production. Native strains could keep regional characters of wine,avoid indentical variety and style. Four nativeS.cerevisiaestrains were successfully isolated from spontaneously fermenting must fromPanzhihuawith Wallerstein Laboratory Nutrient Agar(WL),and the strains were characterized with micro-morphological observation and 26S rDNA D1/D2sequencing. Stress tolerances of the 4 selectedS.cerevisiaestrains were studied,including responses to high osmotic pressure,high temperature,nutrient starvation,high concentrations of sugar and ethanol,and low pH. Differences were found in their tolerance ability,and strains C1and M1were comparatively better among these strains.

wine;Saccharomycescerevisiae;isolation;identification;tolerance

2014-04-02

劉興艷(1979-),女,碩士,副教授,研究方向:果品貯藏與加工。

四川省教育廳自然科學類重點項目——攀枝花葡萄酒野生酵母的篩選及發(fā)酵特性研究(12ZA122)。

TS261.1

A

1002-0306(2015)01-0149-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.023