大孔樹脂分離純化宣木瓜總皂苷

郭嬋元,楊小明,，*,馬海樂,劉偉民

(1.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

大孔樹脂分離純化宣木瓜總皂苷

郭嬋元1,楊小明1,2，*,馬海樂2,劉偉民2

(1.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

目的:采用大孔樹脂法分離純化宣木瓜皂苷。方法:通過比較6種大孔樹脂對宣木瓜皂苷的吸附量、解吸率,選出AB-8、D101和XAD-4三種樹脂研究吸附特性,確定純化宣木瓜皂苷效果最好的大孔樹脂并優(yōu)化純化條件。操作條件:1.25mg/mL宣木瓜皂苷溶液上柱,流速3.0mL/min,上樣量45mg;55%乙醇洗脫,流速2.0mL/min。結(jié)果:XAD-4樹脂對宣木瓜皂苷的最大吸附量為13.64mg/g,吸附時間為2.64h。經(jīng)XAD-4樹脂固定床純化僅一次后宣木瓜皂苷純度由10.01%提高到72.41%,回收率74.12%。結(jié)論:XAD-4樹脂固定床適合用于宣木瓜皂苷的分離純化,吸附率和解吸率較高,再生性能好。

宣木瓜皂苷,吸附,大孔樹脂,純化

宣木瓜學(xué)名為貼梗海棠(ChaenomelesspeciosaS.Nakai),又稱皺皮木瓜,為安徽著名特產(chǎn),因產(chǎn)于宣城而得名。新鮮木瓜可直接食用,有很高的營養(yǎng)保健價值。宣木瓜與甘枸杞、川杜仲、藏紅花并稱為我國四大名產(chǎn)中藥材[1],可去濕除痹,是治療久風(fēng)頑痹之藥[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明皂苷類物質(zhì)為宣木瓜中主要藥效成分[3],具有護(hù)肝降酶、抗炎、抗菌、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫等功能[4-6]。國內(nèi)通常采用乙醇溶劑浸提和超聲輔助回流的方法提取宣木瓜皂苷[7],為了制備較高純度的宣木瓜皂苷樣品,還需要進(jìn)一步的分離純化。

大孔樹脂分離技術(shù)是一種易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的分離純化方法,具有選擇性好、吸附容量大、再生處理方便及吸附迅速、解吸容易等優(yōu)點(diǎn)。本文擬研究大孔樹脂對宣木瓜皂苷的吸附特性[8-9],并對樹脂固定床分離純化宣木瓜皂苷的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

宣木瓜購于安徽省宣城市;D101、X-5、AB-8、XAD-7、XAD-4和DA201大孔樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所,純度≥95%(批號110709-200304);實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。

RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;VIS-7220分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司);TDL-40低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DHG-9140A電熱恒溫干燥箱 上海一恒科技有限公司;DZF-6051型低溫冷凍干燥機(jī) 上海一恒科技有限公司;HZQ-211氣浴恒溫振蕩器 上海一恒科技有限公司;超聲提取器KQ5200E 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 宣木瓜皂苷測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考張婷婷等的方法[10]。精密稱取105℃干燥恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5mg,以甲醇溶解定容至25.00mL。分別精密吸取上述溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于具塞試管,揮干溶劑,加新配制5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,于70℃水浴加熱15min,立即置冰水中冷卻,加冰醋酸4mL搖勻,放置15min后,在波長557nm處測定吸光度,隨行對照不加齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品。以吸光度y為縱坐標(biāo),濃度x為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 宣木瓜皂苷樣品的制備和含量測定 稱一定量宣木瓜干粉,以料液比1∶30g/mL加入70%乙醇,超聲提取60min(200W,60℃),過濾、揮去乙醇,加水復(fù)溶,以水飽和正丁醇反復(fù)萃取至正丁醇相無色,合并正丁醇相,揮去正丁醇得含宣木瓜皂苷的萃取物。

稱少量正丁醇萃取物,水溶解定容至100mL,甲醇稀釋10倍后,得宣木瓜皂苷樣品溶液,精密量取0.2mL并蒸干后,按1.2.1中的方法測吸光度,計(jì)算樣品含量。

1.2.3 大孔樹脂對宣木瓜皂苷的靜態(tài)吸附性能

1.2.3.1 靜態(tài)平衡吸附量的測定 準(zhǔn)確稱取處理好的樹脂0.30g于具塞三角瓶中,取一定濃度的宣木瓜皂苷溶液15mL,加入三角瓶中水浴振蕩(25℃,120r/min),至溶液中皂苷濃度不再變化。按下式計(jì)算各種樹脂的平衡吸附量qe。

式(1)

式中:C0,Ce分別為皂苷的起始濃度和平衡濃度(mg/mL);Vi為溶液體積(mL);W為樹脂干重(g)。

1.2.3.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 將1.2.3.1中充分吸附的樹脂放入具塞三角瓶中,加70%的乙醇溶液15mL,水浴振蕩至液相中皂苷濃度不再變化(25℃,120r/min),測定上清液中皂苷濃度,并按下式計(jì)算解吸率D。

式(2)

式中:C0,Ce,Vi同式(1);Cd為洗脫液中宣木瓜皂苷濃度(mg/mL);Vd為洗脫劑體積(mL)。

1.2.3.3 靜態(tài)等溫吸附實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取6份處理好的樹脂各0.30g,置于100mL具塞三角瓶內(nèi),分別加入等量不同濃度的樣品溶液,充分水浴振蕩至吸附平衡(25℃,120r/min),測定溶液中皂苷含量,按公式(1)計(jì)算樹脂的平衡吸附量。每個濃度重復(fù)3次。

1.2.4 大孔樹脂固定床動態(tài)吸附分離宣木瓜皂苷的工藝研究

1.2.4.1 上樣濃度對固定床穿透曲線的影響 將樹脂濕法裝入層析柱(Φ1.0cm×50cm)后,分別將濃度為1.25、0.63、0.30mg/mL的宣木瓜皂苷樣品以3.0mL/min的流速連續(xù)通過樹脂柱,(固定床出口濃度C=0.05 C0時停止上樣),分析流出液中皂苷濃度,考察上樣濃度對穿透曲線的影響,確定上樣濃度。

1.2.4.2 洗脫液組成對固定床解吸效果的影響 確定上樣濃度后,以3.0mL/min的流速上樣,待皂苷溶液穿透XAD-4樹脂固定床后,先以蒸餾水沖洗,去除水溶性強(qiáng)的雜質(zhì),再依次以30%、50%、70%、90%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫(3.0mL/min),每個梯度5BV,每個床體積接一個流分,分析各洗脫流分中皂苷濃度,考察洗脫液中乙醇濃度對固定床解吸率的影響,初步確定洗脫液中乙醇的濃度范圍。

1.2.4.3 固定床純化工藝正交實(shí)驗(yàn) 確定上樣濃度和洗脫液濃度范圍后,進(jìn)一步選擇上樣流速、洗脫劑中乙醇濃度和洗脫流速為實(shí)驗(yàn)因素,進(jìn)行正交化優(yōu)化,確定最佳工藝條件。

表1 正交因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4.4 固定床的再生性能 宣木瓜皂苷洗脫完成后,相繼用95%乙醇和5%稀鹽酸沖洗固定床(均為10BV,3mL/min),雙蒸水洗至中性后,用2%氫氧化鈉沖洗(10BV,3mL/min),雙蒸水洗至中性后,再按最佳工藝條件重復(fù)分離,計(jì)算再生后的樹脂固定床對宣木瓜皂苷的吸附率和解吸率。重復(fù)以上操作6次。

2 結(jié)果與討論

2.1 宣木瓜皂苷含量測定

按1.2.1中所述方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=0.0182x+0.0481(R2=0.9974),線性范圍為0.016～0.12mg/mL。用同樣方法測定宣木瓜皂苷樣品溶液的吸光度,代入方程可得樣品中皂苷含量為10.01%。

2.2 大孔樹脂對宣木瓜皂苷的靜態(tài)吸附性能

2.2.1 靜態(tài)平衡吸附量與解吸率 所選6種大孔樹脂對宣木瓜皂苷的吸附量、解吸率結(jié)果見表2。

表2 不同類型大孔樹脂對宣木瓜皂苷的平衡吸附量(25℃)Table 2 Equilibrium adsorption quantity for saponins on different resins(25℃)

由表可知,各種樹脂對宣木瓜皂苷的吸附量大小依次為:AB-8>XAD-4>D101>X-5>XAD-7>DA201,且都具有較高的解吸率。考慮到最優(yōu)樹脂應(yīng)有較大的吸附量,因此選取吸附量前三的樹脂對其靜態(tài)吸附熱力學(xué)和動力學(xué)行為作進(jìn)一步考察,以選出純化宣木瓜皂苷的最優(yōu)樹脂。

表4 宣木瓜皂苷在三種樹脂上的吸附動力學(xué)方程擬合參數(shù)Table 4 Fitting parameters of adsorption dynamics equation on three resins

2.2.2 初選樹脂對皂苷的靜態(tài)等溫吸附 25℃下AB-8、D101和XAD-4三種樹脂對宣木瓜皂苷的吸附等溫線見圖1。由圖可知,三種樹脂對宣木瓜皂苷均表現(xiàn)出較好的吸附能力。

圖1 三種樹脂在25℃時的吸附等溫線Fig.1 The isothermal adsorption line of three resins on 25℃

由表可知,用Freundlich和Langmuir等溫吸附方程描述宣木瓜皂苷在XAD-4樹脂上的吸附平衡,其相關(guān)性系數(shù)均在0.99以上,兩方程均能較貼切地描述宣木瓜皂苷在XAD-4上的吸附平衡,且前者比后者更好;而宣木瓜皂苷在AB-8和D101樹脂上的物理吸附平衡用兩等溫吸附方程描述均不夠貼切。宣木瓜皂苷在XAD-4、AB-8和D101三種樹脂上的最大飽和吸附量依次為13.64、15.02、13.11mg/g。

2.2.3 初選樹脂對皂苷的靜態(tài)動力學(xué)吸附 25℃時宣木瓜皂苷在三種樹脂上的吸附量qt隨時間的變化見圖2。由圖可見:XAD-4樹脂吸附2h已接近平衡,其他兩種樹脂都在4h后才達(dá)到平衡。

圖2 3種樹脂在25℃時的吸附動力學(xué)曲線Fig.2 Adsorption dynamics curve of three resins on 25℃

分別以一級動力學(xué)方程(公式3)和二級動力學(xué)方程(公式4)對吸附動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。其中,k1和k2分別為一級和二級動力學(xué)速率常數(shù)。

ln(qe-qt)=-k1t+lnqe

式(3)

式(4)

結(jié)果顯示:宣木瓜皂苷在三種樹脂上的吸附比較符合二級動力學(xué)特性,相關(guān)性系數(shù)均在0.99以上(見表3相關(guān)擬合參數(shù)),表明該吸附過程主要受顆粒內(nèi)擴(kuò)散控制。由表4知,XAD-4樹脂的吸附速率常數(shù)0.1786g/(mg·h)明顯大于樹脂D101和AB-8的速率常數(shù)(分別為0.03741g/(mg·h)和0.08548g/(mg·h)),即樹脂XAD-4達(dá)到動態(tài)吸附平衡所需時間最短。按XAD-4對宣木瓜皂苷的飽和吸附量計(jì)算,其達(dá)到飽和吸附的時間為2.64h,而AB-8和D101達(dá)到其飽和吸附的時間分別為5.71h和4.07h。為縮短操作時間、提高分離效率,選擇純化宣木瓜皂苷的最佳樹脂為XAD-4。

2.3 XAD-4樹脂固定床對皂苷的純化

2.3.1 上樣濃度對固定床穿透曲線的影響 上樣濃度對穿透曲線的影響見圖3,由圖知:達(dá)到穿透點(diǎn)前宣木瓜皂苷處理量隨上樣濃度的降低依次減少(分別為45.00、32.55、19.66mg),且濃度越高,穿透越提前,操作越省時。但上樣濃度過高,泄露率較大,致使藥液浪費(fèi)[12]。本實(shí)驗(yàn)選擇上樣濃度為1.25mg/mL。

圖3 上樣濃度對XAD-4樹脂固定床穿透曲線的影響Fig.3 Effect of concentration of saponins on its breakthrough curves注：圖中折線表示洗脫液中乙醇濃度； 曲線表示流分中宣木瓜皂苷濃度。

2.3.2 固定床的梯度洗脫 按1.2.4.2所述實(shí)驗(yàn)方法,考察洗脫液中乙醇濃度對洗脫效果的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度的乙醇溶液 對XAD-4樹脂固定床進(jìn)行梯度洗脫Fig.4 Gradient desorption of XAD-4 resin fixed bed on different concentration of ethanol solution

由圖可見,宣木瓜皂苷在蒸餾水中損失很少,可以采用蒸餾水預(yù)先沖洗的方法提高分離產(chǎn)品的純度,沖洗體積為10BV。而宣木瓜皂苷主要由30%和50%的乙醇洗脫。

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn)工藝優(yōu)化 以上樣流速、洗脫液中乙醇濃度和洗脫流速為影響因素做正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。將濃度為1.25mg/mL的樣品溶液以不同流速上樣,達(dá)到穿透點(diǎn)后,用10BV蒸餾水洗柱,然后用不同濃度乙醇溶液以不同流速洗脫。

考慮到上樣流速過小,會延長生產(chǎn)周期,而上樣流速過大,會使從上樣到樣品流出的時間過短,樹脂來不及吸附,因此本實(shí)驗(yàn)選擇了如表1中的幾個上樣流速。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5,方差分析結(jié)果見表6。

由表5可知,各因素中對宣木瓜皂苷解吸率的影響程度依次為:上樣流速>乙醇濃度>洗脫流速。由正交實(shí)驗(yàn)極差分析,可以得到最優(yōu)工藝參數(shù)為:上樣流速3mL/min;洗脫液為55%乙醇溶液,洗脫流速2.0mL/min。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of orthogonal design test

表6的方差分析表明,上樣流速、洗脫乙醇濃度和洗脫流速對解吸效果的影響具有顯著性。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),宣木瓜皂苷解吸率為85.3%,高于正交設(shè)計(jì)中各組的解吸率,說明確實(shí)是最佳解吸方案。用55%乙醇洗脫宣木瓜皂苷,其含量達(dá)到72.41%,相比樹脂純化前的10.01%有顯著提高,回收率達(dá)74.12%。

表6 方差分析結(jié)果Table 6 The results of variance analysis

注:F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99。

2.3.4 重復(fù)利用次數(shù)對XAD-4樹脂吸附和解吸率的影響 再生后的XAD-4樹脂固定床對宣木瓜皂苷的吸附率和解吸率結(jié)果見圖5。由圖可知,用1.2.4.4中所述方法再生的XAD-4樹脂固定床連續(xù)使用三次,對宣木瓜皂苷的吸附率和解吸率幾乎無影響,第四次吸附率與解吸率略有下降,但不很明顯,表明XAD-4樹脂有很好的再生性能。

3 結(jié)論

從6種樹脂中篩選出對宣木瓜皂苷吸附較理想的XAD-4樹脂。Freundlich和Langmuir等溫吸附方程均能較好地描述宣木瓜皂苷在XAD-4樹脂上的

圖5 XAD-4樹脂重復(fù)使用性結(jié)果Fig.5 The reusability results of XAD-4 resin

等溫吸附,前者更為貼切,在XAD-4樹脂上的動力學(xué)吸附符合二級吸附動力學(xué)方程,控速步驟以顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散控制為主。

采用XAD-4樹脂固定床對宣木瓜提取物中的皂苷進(jìn)行富集,最優(yōu)工藝為:宣木瓜皂苷溶液上樣濃度 1.25mg/mL,流速3.0mL/min,上樣量45mg;吸附后,先以10BV蒸餾水洗柱,再以55%乙醇為洗脫劑,流速2.0mL/min。經(jīng)XAD-4樹脂純化后,宣木瓜提取物中皂苷的含量由10.01%提高到達(dá)72.41%,回收率達(dá)74.12%。

再生的XAD-4樹脂固定床連續(xù)使用六次,對宣木瓜皂苷的吸附率和解吸率沒有很明顯的下降,即XAD-4樹脂有很好的再生性能。

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Separation and purification of saponins fromChaenomelesspeciosausing macroporous resin

GUO Chan-yuan1,YANG Xiao-ming1,2，*,MA Hai-le2,LIU Wei-min2

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Object:To separate and purify saponins fromChaenomelesspeciosausing macroporous resin. Methods:Six different macroporous adsorption resins were evaluated for the static adsorption and desorption capacity for saponins,the better resins were AB-8,D101 and XAD-4. The adsorption behavior of saponins on AB-8,D101 and XAD-4 resins were further investigated to determinate the macroporous resin used to purify saponins and select the suitable conditions. Experimental conditions of the fixed bed were determined as follows:saponins concentration was 1.25mg/mL,flow rate was 3.0mL/min,the amount of sample was 45mg. The elution solvent was 55% ethanol,flow rate was 2.0mL/min. Results:The results showed that the maximum adsorption capacity of XAD-4 was 13.64mg/g,adsorption time was 2.64h. Through only one cycle of treatment,the content of saponins was raised from 10.01% to 72.41% with an overall recovery of 74.12%. Conclusions:XAD-4 resin fixed bed is suitable to be used to separate and purify saponins for its higher adsorption and desorption rate and its excellent regenerability.

Chaenomelesspeciosasaponins;adsorption;macroporous resin;purification

2014-03-31

郭嬋元(1987-)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取與純化。

*通訊作者:楊小明(1963-)，女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物提取及活性。

鎮(zhèn)江市工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(GY2011015)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

TS255.1

A

1002-0306(2015)01-0140-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.021