萌芽黑豆中蛋白質(zhì)組分分子量分布及其抗氧化活性研究

來吉祥,何聰芬,方 云,趙 亞,魏少敏,,*

(1.江南大學(xué),化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.北京工商大學(xué)理學(xué)院,北京 100048;3.上海家化聯(lián)合股份有限公司,上海 200082)

萌芽黑豆中蛋白質(zhì)組分分子量分布及其抗氧化活性研究

來吉祥1,何聰芬2,方 云1,趙 亞3,魏少敏1,3,*

(1.江南大學(xué),化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.北京工商大學(xué)理學(xué)院,北京 100048;3.上海家化聯(lián)合股份有限公司,上海 200082)

本文目的是研究萌芽黑豆中不同蛋白質(zhì)組分的分子量分布,以及各組分的抗氧化活性。采用堿提酸沉法獲得萌芽黑豆中的蛋白質(zhì),通過硫酸銨鹽析法逐級(jí)分離各蛋白質(zhì)組分,SDS-PAGE法測定各蛋白質(zhì)組分分子量分布,并從清除自由基和抗人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷兩個(gè)方面研究了各蛋白質(zhì)組分的抗氧化活性。萌芽黑豆中蛋白質(zhì)組分可以集中分離為三個(gè)部分,其分子量分布為140.0～166.0、45.0～72.0、17.0～23.0ku;清除自由基和抗人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明分子量在17.0～23.0ku的蛋白質(zhì)組分具有最優(yōu)的抗氧化活性,說明低分子量的萌芽黑豆蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

萌芽黑豆,蛋白質(zhì),分子量分布,抗氧化活性

黑豆,又名黑大豆、櫓豆、烏豆,味甘性平,具有高蛋白、低熱量的特性。在常見的食用豆中,黑豆具有最為顯著的抗氧化生物活性[1]。研究發(fā)現(xiàn),黑豆在萌發(fā)的過程中,由于酶的作用,其中的蛋白質(zhì)、多糖和礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)成分會(huì)被釋放出來,增加人體吸收利用率[2];黃酮類物質(zhì)也發(fā)生了有益的轉(zhuǎn)化[3],皂苷和非糖基化的黃酮醇含量顯著增加[4-5];同時(shí),萌發(fā)過程能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分解為氨基酸,有利于提高黑豆的營養(yǎng)價(jià)值[6]。黑豆提取物具有強(qiáng)抗氧化功效[7],已有研究發(fā)現(xiàn),黑豆中的抗氧化活性成分主要是多酚類物質(zhì)[8]、花色苷[9]、酚酸、花青素、異黃酮[10]、肽[11-12]等,目前關(guān)于黑豆功效的研究也都是圍繞這些活性成分展開的。作者前期研究發(fā)現(xiàn):黑豆經(jīng)過萌發(fā)后,其蛋白質(zhì)含量和抗氧化活性均發(fā)生顯著變化,且兩者呈正相關(guān)變化,其中萌芽初期黑豆(芽長0.5cm)的蛋白質(zhì)含量最高,這一階段黑豆萌芽的抗氧化活性也最優(yōu)異[13],推測是由于萌芽過程促使黑豆中的蛋白質(zhì)發(fā)生了有益的轉(zhuǎn)化,生成小分子量的蛋白質(zhì),其生物活性也發(fā)生了變化,但目前關(guān)于黑豆蛋白質(zhì)抗氧化活性的研究還鮮見報(bào)道。因此,本研究采用硫酸銨鹽析法分級(jí)分離萌芽黑豆(芽長0.5cm)中的蛋白質(zhì),并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)分析各蛋白質(zhì)組分的分子量分布,采用清除自由基實(shí)驗(yàn)和抗人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗(yàn)對(duì)各蛋白質(zhì)組分的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),驗(yàn)證萌芽黑豆中蛋白質(zhì)的抗氧化活性,并研究其中抗氧化活性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)組分及其分子量分布,為黑豆及其萌芽中蛋白質(zhì)資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆(Soybean(Glycinemaxvar)) 產(chǎn)地河北石家莊,青仁黑豆,當(dāng)年新豆;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),水楊酸,H2O2(3%),噻唑藍(lán)(MTT),二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基,小牛血清 美國Gibco公司;維生素C,丙酮,苯酚,無水硫酸銨 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Spectra Max Plus 384連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;UV2300紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;4K15高速冷凍離心機(jī) Sigma公司;KQ-400KDB型超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;JHBE-50T型閃式提取器 西安太康生物科技有限公司;巧夫人智能型家用豆芽機(jī) 瑞安市威鵬家用電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑豆萌芽過程 選取優(yōu)質(zhì)的青仁黑豆,籽粒飽滿,色澤烏黑,無蟲蛀,無破損,豆長9～10mm,直徑約7mm,百粒重約30g左右。稱取10g黑豆干種子,用去離子水清洗表面灰塵及細(xì)菌,加入去離子水200mL,放置于30℃下浸泡16h,期間每4h換水1次。將泡發(fā)的黑豆種子用去離子水清洗干凈,均勻擺放在家用豆芽機(jī)中,置于黑暗處進(jìn)行萌發(fā),保持溫度在30℃左右。豆芽機(jī)可自動(dòng)噴淋,每60min噴淋一次,每次60s。每24h為豆芽機(jī)更換一次去離子水,并對(duì)豆芽機(jī)和豆芽進(jìn)行清洗。約36h后黑豆開始萌芽,48h后芽長達(dá)0.5cm,采收備用。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取及分離純化 參考文獻(xiàn)方法[14],采用超聲輔助水提法提取萌芽黑豆中的蛋白質(zhì),按照1∶30的料液比加入去離子水,采用閃式提取器,于40V電壓下粉粹3min,室溫在40kHz功率下超聲提取30min;參考文獻(xiàn),采用堿提酸沉法[15]分離蛋白質(zhì):取超聲后的萌芽黑豆提取液500mL,用2mol/L的NaOH調(diào)整混合物的pH至8.0,勻速攪拌15min,增加蛋白質(zhì)在堿性溶液中的溶解度,200目紗布過濾,5000r/min離心15min,取上清液,加入稀鹽酸調(diào)整上清液的pH至4.5,靜置20min,待蛋白質(zhì)充分沉淀后,5000r/min離心15min,用等體積丙酮洗滌沉淀,沉淀在室溫下自然干燥,即獲得萌芽黑豆蛋白質(zhì)干粉,備用。

1.2.3 硫酸銨鹽析法分級(jí)分離蛋白組分 參考文獻(xiàn)方法[16-18],取上述萌芽黑豆酸沉蛋白沉淀0.5g,加入25mL蒸餾水制成萌芽黑豆蛋白溶液,分6級(jí)調(diào)節(jié)硫酸銨的飽和度,分別為30%、45%、60%、75%、90%和100%,每一級(jí)分離過程中,邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨,直到達(dá)到相應(yīng)的飽和度,充分?jǐn)嚢韬?在4℃冰箱中靜置4h,然后在10000r/min條件下離心20min,沉淀即為分級(jí)分離的蛋白。將上清液重復(fù)上述操作,補(bǔ)加硫酸銨達(dá)到相應(yīng)的下一個(gè)飽和度,再次攪拌、靜置、離心得沉淀。以此類推,按級(jí)不斷增大硫酸銨的飽和度,直到100%,對(duì)萌芽黑豆水提液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分級(jí)分離。各分級(jí)分離的蛋白質(zhì)分別溶于5mL去離子水中,采用3500分子量的透析袋透析24h,去除硫酸銨,冷凍干燥獲得萌芽黑豆分級(jí)蛋白質(zhì)。每個(gè)樣品平行測定3次,取平均值作為各蛋白質(zhì)組分的含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)組分分子量分布測定 參考文獻(xiàn)方法[19],利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定蛋白質(zhì)分子量分布:配制含10%丙烯酰胺的分離膠,凝固后加入含5%丙烯酰胺的濃縮膠,將萌芽黑豆各分級(jí)蛋白質(zhì)組分加入樣品緩沖液中,煮沸5min,冷卻后各取20μL加入至十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。初始電流8mA,當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后將電流提高至11mA。電泳結(jié)束后將凝膠加入含有考馬斯亮藍(lán)R-250的染色液中60℃染色5min,轉(zhuǎn)移至脫色液中脫色。

1.2.5 各組分清除自由基抗氧化活性

1.2.5.1 清除羥基自由基(OH·)活性 采用水楊酸法[20]檢測萌芽黑豆蛋白質(zhì)組分清除OH·的活性。在10mL比色管中加入2mmol/L FeSO4溶液3mL、6mmol/L水楊酸溶液3mL、5mg/mL萌芽黑豆蛋白質(zhì)水溶液1mL,搖勻;接著加入1mmol/L H2O2溶液3mL,搖勻,啟動(dòng)反應(yīng);于37℃水浴保溫60min后取出,在510nm處測其吸光度;以維生素C作為陽性對(duì)照,樣品對(duì)OH·清除率的計(jì)算公式如下:

Y(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

式(1)

式中:Y為樣品對(duì)OH·清除率;A0為空白組吸光度值;A1為樣品組吸光度值;A2為樣品本底吸光度值。每個(gè)樣品平行測定3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

Y(%)=(1-V1/V0)×100

式(2)

1.2.5.3 清除DPPH自由基(DPPH·)活性 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,可用來評(píng)價(jià)樣品清除自由基的能力。以維生素C作為陽性對(duì)照,參考文獻(xiàn)[22-23]的方法,取3mL的5mg/mL萌芽黑豆蛋白質(zhì)水溶液于10mL試管中,加入3mL體積的2×10-4mol/L的DPPH溶液,快速混勻;向3mL DPPH 溶液中加入3mL無水乙醇,記錄吸光值為A0,即空白對(duì)照;室溫避光放置30min;用分光光度計(jì)測量其在517nm處的吸光值,記錄為A1,樣品對(duì)DPPH·清除率的計(jì)算公式如下:

Y(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

式(3)

式中:Y為樣品對(duì)DPPH·清除率,A0為空白組吸光度值,A1為樣品組吸光度值,A2為樣品本底吸光度值。每個(gè)樣品平行測定3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.6 抗H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗(yàn) 通過MTT法檢測萌芽黑豆蛋白質(zhì)組分抗H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷的活性。參考任德成等人[24]的實(shí)驗(yàn)方法,采用第3代人皮膚成纖維細(xì)胞,運(yùn)用紫外分光光度法,在570nm波長下檢測細(xì)胞的存活率。細(xì)胞分為三組:(1)H2O2預(yù)先作用組——將人皮膚成纖維細(xì)胞預(yù)先與濃度為800μmol/L的H2O2孵育4h,然后再與萌芽黑豆蛋白質(zhì)(1mg/mL)孵育12h;(2)同時(shí)作用組——將萌芽黑豆各蛋白質(zhì)組分(1mg/mL)與濃度為800μmol/L的H2O2同時(shí)作用于人皮膚成纖維細(xì)胞,孵育12h;(3)蛋白質(zhì)預(yù)先孵育組——將人皮膚成纖維細(xì)胞預(yù)先與萌芽黑豆蛋白質(zhì)(1mg/mL)孵育12h,然后再與濃度為800μmol/L的H2O2作用4h。

MTT法檢測細(xì)胞存活率 人皮膚成纖維細(xì)胞,在37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,采用第3代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),接種密度為5×104cells/mL,培養(yǎng)24h,細(xì)胞融合達(dá)到70%。用含有萌芽黑豆蛋白質(zhì)組分的成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,培養(yǎng)基為空白對(duì)照,細(xì)胞密度為5×104cells/mL,接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每孔200μL(1×104cells/孔)。在37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h,每孔加入MTT 20μL,培養(yǎng)4h后棄上清,然后每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)震蕩15min,使結(jié)晶充分溶解。置于酶聯(lián)免疫檢測儀上,以波長570nm測定各孔吸光度值。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下:

Y(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100

式(4)

式中:Y為細(xì)胞存活率,A0為培養(yǎng)基體系本底吸光度值,A1為樣品組吸光度值,A2為非氧化損傷組吸光度值。每1種蛋白質(zhì)組分設(shè)6個(gè)復(fù)孔,重復(fù)2次實(shí)驗(yàn),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS v19.0分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用組間單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,當(dāng)p<0.05時(shí),認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)組分分子量分布

萌芽黑豆蛋白質(zhì)組分的分子量分布如表1所示:

表1結(jié)果表明:萌芽黑豆中各蛋白質(zhì)組分的分子量主要集中分布在140.0～166.0、45.0～72.0、17.0～23.0ku三個(gè)范圍內(nèi)。隨著硫酸銨飽和度的升高,大分子量的蛋白質(zhì)首先沉淀出來,主要集中在140.0～166.0ku,含量約占總蛋白的9.8%;然后是分子量45.0～72.0ku的蛋白質(zhì),含量最多,約占總蛋白的35.4%;最后沉淀的是小分子量的蛋白質(zhì),17.0～23.0ku,含量約占總蛋白的27.7%。

表1 萌芽黑豆分級(jí)分離蛋白質(zhì)的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of proteins in germinal black soybeans

2.2 蛋白質(zhì)組分清除自由基活性

2.2.1 清除羥基自由基活性 萌芽黑豆中蛋白質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除活性如圖1所示:萌芽黑豆中的蛋白質(zhì)對(duì)羥基自由基具有清除活性,但不同分子量范圍蛋白質(zhì)的清除活性有顯著差異,其中小分子量的蛋白質(zhì)(17.0～23.0ku)對(duì)羥基自由基具有最優(yōu)異的清除活性,顯著高于其他分子量的蛋白質(zhì)(p<0.05)。

圖1 萌芽黑豆中蛋白質(zhì)組分清除羥基自由基活性Fig.1 OH· scavenging activities of proteins in germinal black soybeans

2.2.2 清除超氧陰離子自由基活性 萌芽黑豆中蛋白質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性如圖2所示:萌芽黑豆蛋白質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基具有清除活性,其中小分子量蛋白質(zhì)(17.0～23.0ku)的清除活性最佳,清除率可達(dá)70%以上,與其他分子量的蛋白質(zhì)相比具有顯著性差異(p<0.05)。

圖2 萌芽黑豆中蛋白質(zhì)組分清除超氧陰離子自由基活性Fig.· scavenging activities of proteins in germinal black soybeans

2.2.3 清除DPPH自由基活性 萌芽黑豆中蛋白質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除活性如圖3所示:萌芽黑豆蛋白質(zhì)可以清除DPPH自由基,其中小分子量蛋白質(zhì)(17.0～23.0ku)的清除活性最佳,顯著高于其他分子量的蛋白質(zhì)(p<0.05)。

圖3 萌芽黑豆中蛋白質(zhì)組分清除DPPH自由基活性Fig.3 DPPH· scavenging activities of proteins in germinal black soybeans

綜合考察萌芽黑豆中蛋白質(zhì)對(duì)羥基自由基,超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除活性研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)萌芽黑豆蛋白質(zhì)具有清除自由基活性,低分子量的黑豆蛋白質(zhì)(17.0～23.0ku)具有更強(qiáng)的抗氧化活性。推測可能是由于小分子量的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)簡單,具有更多的活性基團(tuán),易于與自由基接觸,發(fā)揮抗氧化活性。已有研究發(fā)現(xiàn),與大分子量多肽相比,小分子量的黑豆肽和大豆肽也具有更優(yōu)的清除自由基活性[25-26];相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),隨著分子量減小,大豆肽對(duì)DPPH自由基的清除效果明顯增高,其中分子量小于5000u的小肽具有最顯著的抗氧化活性[27];低分子量的大豆肽(5000～10000u)較其他分子量段的多肽具有更強(qiáng)的抗癌活性[28]。綜合分析可能有兩方面的原因:一方面與蛋白質(zhì)或多肽中特定的氨基酸組成有關(guān),特定的氨基酸殘基具有更好的電子供體;另一方面蛋白質(zhì)或多肽中特定的氨基酸序列也與抗氧化活性有密切關(guān)系[29]。

2.3 抵御H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷的作用

通過MTT法檢測萌芽黑豆蛋白質(zhì)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞損傷的作用結(jié)果如圖4所示:

圖4 萌芽黑豆蛋白質(zhì)對(duì)H2O2引起的 人皮膚成纖維細(xì)胞損傷的作用Fig.4 Effect of proteins of black soybean on the human skin fibroblast damnified by H2O2注:a.H2O2預(yù)先作用組,b.同時(shí)作用組,c.蛋白質(zhì)預(yù)先孵育組。

與空白對(duì)照相比,H2O2預(yù)先作用組中的細(xì)胞活力無顯著增加,但也沒有顯著下降。人皮膚成纖維細(xì)胞與H2O2預(yù)先孵育時(shí),已經(jīng)受到了氧化損傷,細(xì)胞存活率下降,再加入萌芽黑豆蛋白質(zhì),無法在短時(shí)間內(nèi)消除H2O2引起的氧化損傷。在同時(shí)作用組中1～6各組萌芽黑豆蛋白質(zhì)孵育的人皮膚成纖維細(xì)胞,細(xì)胞存活率與陰性對(duì)照接近,無顯著變化。這說明萌芽黑豆蛋白質(zhì)和H2O2一起作用于人皮膚成纖維細(xì)胞時(shí),細(xì)胞仍然遭受了H2O2的氧化損傷,萌芽黑豆蛋白質(zhì)清除了一部分自由基,但保護(hù)細(xì)胞的作用不強(qiáng)。在蛋白質(zhì)預(yù)先孵育組中細(xì)胞存活率顯著提高(p<0.05),說明使用萌芽黑豆蛋白質(zhì)預(yù)先孵育細(xì)胞能夠顯著抵抗H2O2引起的氧化損傷。分析原因,可能是因?yàn)槊妊亢诙沟鞍踪|(zhì)在孵育的過程中,促進(jìn)了人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)了細(xì)胞活力;然后再與H2O2作用時(shí),萌芽黑豆蛋白質(zhì)清除了H2O2產(chǎn)生的自由基,抵御了氧化損傷,使得整體細(xì)胞活力增強(qiáng),細(xì)胞存活率增高。

綜合分析H2O2預(yù)先作用組,同時(shí)作用組,蛋白質(zhì)預(yù)先孵育組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,參考肖健等人[30]的報(bào)道,對(duì)三組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較研究,結(jié)果表明:H2O2預(yù)先作用組和同時(shí)作用組中,細(xì)胞存活率與空白對(duì)照均無顯著差異,但是,同時(shí)作用組略優(yōu)于H2O2預(yù)先作用組;蛋白質(zhì)預(yù)先孵育組中細(xì)胞的存活率達(dá)到50%以上,其中,當(dāng)萌芽黑豆蛋白質(zhì)的分子量在17.0～23.0ku時(shí),細(xì)胞的存活率最高,可達(dá)68.5%±5.26%,超出空白對(duì)照組(53.5%),明顯優(yōu)于其他分子量范圍的蛋白質(zhì)(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,萌芽黑豆蛋白質(zhì)抵抗H2O2引起的人皮膚成纖維細(xì)胞損傷的作用包括兩個(gè)方面:一是直接的化學(xué)反應(yīng),通過直接清除自由基來進(jìn)行;二是萌芽黑豆蛋白質(zhì)促進(jìn)了人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖,增加了細(xì)胞活力。萌芽黑豆蛋白質(zhì)為人皮膚成纖維細(xì)胞的生長與增殖提供了營養(yǎng)和物質(zhì)基礎(chǔ),增強(qiáng)了細(xì)胞活力。如果增加萌芽黑豆蛋白質(zhì)的添加量,延長孵育時(shí)間,將可能會(huì)促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖,提高細(xì)胞存活率。

3 結(jié)論

本研究以萌芽黑豆(芽長0.5cm)中的蛋白質(zhì)為研究對(duì)象,通過清除自由基和抵御細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)萌芽黑豆中的蛋白質(zhì)具有抗氧化活性;通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)萌芽黑豆中各蛋白質(zhì)組分的分子量主要集中分布在140.0～166.0、45.0～72.0、17.0～23.0ku三個(gè)范圍內(nèi),其中17.0～23.0ku范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)組分具有最優(yōu)的清除自由基活性和抵御H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷的作用。研究發(fā)現(xiàn),萌芽黑豆蛋白質(zhì)抵御H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷的作用主要包括兩個(gè)方面:一是直接清除自由基,二是促進(jìn)細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞活力。通過對(duì)萌芽黑豆蛋白質(zhì)分子量分布及其各組分抗氧化活性的研究,為黑豆及其萌芽中蛋白質(zhì)資源的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

[1]Xu B J,Chang K C. Comparative study on antiproliferation properties and cellular antioxidant activities of commonly consumed food legumes against nine human cancer cell lines[J]. Food Chemistry,2012,134(3):1287-1296.

[2]王莘,王艷梅,蘇玉春,等. 黑大豆萌發(fā)期功能性營養(yǎng)成分測定與分析[J]. 食品工業(yè)科技,2004,25(4):132-133,88.

[3]孫肖青,孫筱林. 黑豆萌發(fā)期游離異黃酮苷元成分的測定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(8):110-111.

[4]Guajardo-Flores D,Garcia-Patino M,Serna-Guerrero D,etal. Characterization and quantification of saponins and flavonoids in sprouts,seed coats and cotyledons of germinated black beans[J]. Food Chemistry,2012,134(3):1312-1319.

[5]翟瑋瑋. 黑豆發(fā)芽條件及其異黃酮提取物特性研究[J].食品科學(xué),2008,29(9):186-189.

[6]翟瑋瑋,焦宇知. 黑豆發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)及γ-氨基丁酸的變化及發(fā)芽條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2009,30(19):51-54.

[7]王萌,阮美娟. 黑豆提取物抗氧化性的研究[J]. 食品科技,2007(3):123-125.

[8]張瑞芬,黃昉,徐志宏,等. 黑豆皮提取物抗氧化和延緩衰老作用研究[J]. 營養(yǎng)學(xué)報(bào),2007,29(2):160-162.

[9]王玉麗,任海偉,李志忠,等. 用清除DPPH自由基法評(píng)價(jià)藥黑豆色素的抗氧化能力[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(8):102-105.

[10]Xu B J,Chang K C. Antioxidant capacity of seed coat,dehulled bean,and whole black soybeans in relation to their distributions of total phenolics,phenolic acids,anthocyanins,and isoflavones[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(18):8365-8373.

[11]任海偉,王常青,宋育璇. 黑豆多肽分離及其抗氧化活性的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009(21):136-139.

[12]任海偉,王常青. 黑豆低聚肽的抗氧化活性評(píng)價(jià)及其氨基酸組成分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(9):46-50.

[13]Lai J X,Xin C,Zhao Y,etal. Study of Active Ingredients in Black Soybean Sprouts and Their Safety in Cosmetic Use[J]. Molecules,2012(17):11669-11679.

[14]李大婧,宋江峰,劉春泉,等. 超聲波輔助提取黑豆皮色素工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2009,25(2):273-279.

[15]李校堃,袁輝. 藥物蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:42-48.

[16]郭福旺,阮美娟,王朝臣,等. 大豆蛋白小分子肽的制備及其分離純化[J]. 食品工業(yè),2008(1):4-5.

[17]殷涌光,劉靜波. 大豆食品工藝學(xué)[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006.

[18]Agric J. Aggregation of Peptides during Hydrolysis as a Cause of Reduced Enzymatic Extractability of soybean Meal proteins[J].Food Chemistry,2002(50):4512-4519.

[19]張煜,王建英,王晶妍. 硫酸銨鹽析法分級(jí)分離大豆酸沉蛋白[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,39(6):99-100.

[20]劉駿. 結(jié)晶紫分光光度法測定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基[J]. 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001,24(2):53-55.

[21]王勇,慶偉霞,楊玉霞,等. 分光光度法測定二氫黃酮化合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用[J]. 化學(xué)研究,2013,24(5):441-443.

[22]Yildirim A,Mavi A,Kara A A. Determination of antioxidant and antimicrobial activities of Rumex crispus L. extracts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(8):4083-4089.

[23]趙進(jìn),來吉祥,何聰芬,等. 紅景天活性成分的提取工藝及其美容功效研究[J]. 日用化學(xué)工業(yè),2009,12(6):402-404.

[24]任德成,杜冠華,張均田. 總丹酚酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2003,17(5):333-337.

[25]劉恩岐,李華,巫永華,等. 黑豆肽的抗氧化活性與緩解體力疲勞作用[J]. 食品科學(xué),2013,34(11):273-277.

[26]張莉莉,嚴(yán)群芳,王恬. 大豆生物活性肽的分離及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué),2007,28(5):208-210.

[27]鄧成萍,薛文通,孫曉琳,等. 不同分子量段大豆多肽功能特性的研究[J]. 食品科學(xué),2006,27(5):109-112.

[28]葛錫娟,趙城彬,楊麗麗,等. 大豆抗癌肽的分離純化及分子量分布[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(3):99-101,105.

[29]陳敏,敖靜,李博. 分子量對(duì)酪蛋白多肽抗氧化活性的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(9):95-99.

[30]肖健,李校堃,郭建紅,等. 姜黃素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的雙重作用[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2005,10(12):1376-1379.

Study on molecular weight distribution and antioxidant activity of protein components in germinal black soybean

LAI Ji-xiang1,HE Cong-fen2,FANG Yun1,ZHAO Ya3,WEI Shao-min1,3,*

(1. School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. School of Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;3. Shanghai Jahwa United Co. Ltd.,Shanghai 200082,China)

Molecular weight distribution and antioxidant activities of each protein composition in germinal black soybean were studied. Protein components in germinal black soybean were extracted and separated by ammonium sulfate method. Molecular weight distribution of each protein component was measured using SDS-PAGE method,and antioxidant activity were studied by free radicals scavenging test and anti-H2O2-induced damaged skin fibroblast test. Molecular weight of proteins in germinal black soybean was concentrated in 140.0～166.0,45.0～72.0,17.0～23.0ku. Results of antioxidant activity tests showed that the protein component of 17.0～23.0ku molecular weight had the best antioxidant activity indicating that low molecular weight germinal black soybean protein had stronger antioxidant activity.

germinal black soybean;protein;molecular weight distribution;antioxidant activity

2014-02-18

來吉祥(1983-),男,博士研究生,研究方向:植物源化妝品功效添加劑研究。

*通訊作者:魏少敏(1952-)，男，博士，教授，主要從事精細(xì)化學(xué)品科學(xué)研究。

國家自然科學(xué)基金(21276113);國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD23B03)。

TS214.9

A

1002-0306(2015)01-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.001