堿不溶性酵母胞壁多糖苯酚硫酸測定法的研究

周麗明,張 勇

(上饒師范學院生命科學學院,江西上饒 334001)

周麗明,張 勇

(上饒師范學院生命科學學院,江西上饒 334001)

為了測定堿不溶性酵母胞壁多糖含量,采用硫酸溶液水解堿不溶性酵母胞壁多糖,苯酚-硫酸法測定水解液的糖含量。通過單因素和正交實驗對硫酸溶液水解堿不溶性酵母胞壁多糖的條件進行了優(yōu)化,優(yōu)化后的水解條件為:稱取堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入3mol/L H2SO4溶液20mL置于100℃水浴中水解90min。水解液定容至250mL,測定其糖含量。該方法的精密度RSD為0.30%,穩(wěn)定性RSD為0.67%,重現(xiàn)性RSD為0.29%,樣品的平均加標回收率為99.87%,RSD為1.16%,是測定堿不溶性酵母胞壁多糖含量的有效方法。

堿不溶性,酵母胞壁多糖,水解,苯酚-硫酸法

啤酒廢酵母是啤酒生產(chǎn)工藝過程中剩下的副產(chǎn)物,主要由大量的死細胞和弱細胞組成[1],每生產(chǎn)100t啤酒,產(chǎn)生約1.5t剩余酵母(含水75～80%)[2]。2012年我國啤酒產(chǎn)量數(shù)為4435萬t[3],可回收廢啤酒酵母60多萬噸(濕重)。目前,廢啤酒酵母的綜合利用集中在酵母細胞的氨基酸、肽、蛋白質(zhì)資源、酵母抽提物調(diào)味品、β-葡聚糖、甘露糖以及活性酶類如超氧化物歧化酶等產(chǎn)品的生產(chǎn)與研究[4]。受到多糖成為食品科學、天然藥物、生物化學與生命科學領(lǐng)域中的研究熱點[5]的影響,酵母多糖越來越受到科研工作者的重視。研究表明,酵母多糖具有增強免疫[6-9]、抗氧化[10]、抗誘變[11]、抗腫瘤[12]、抗輻射[13]、吸收毒素[14]、降血脂[15-16]等生物功能；在肉制品生產(chǎn)中可替代部分脂肪和淀粉[17]。

酵母細胞壁中存在堿不溶性葡聚糖、堿溶性葡聚糖、酸溶性葡聚糖、連接有蛋白質(zhì)的無定性的堿溶性甘露聚糖等多糖類物質(zhì),其中不溶性葡聚糖除因不溶使其在抗腫瘤等的臨床應(yīng)用上受到限制外,高度的粘性、持水性和熱穩(wěn)定性以及制備工藝簡單等方面的優(yōu)點,使其在食品、醫(yī)藥、化妝品、造紙和建筑材料等行業(yè)廣泛應(yīng)用[18]。堿不溶性酵母胞壁多糖的不溶解性造成了其測定的困難性。鑒于此,本實驗用硫酸溶液對其進行水解,苯酚-硫酸法測定水解液的糖含量。通過單因素和正交實驗優(yōu)化水解條件,以期建立高效、快速、可靠、能作為酵母多糖質(zhì)量控制方法的堿不溶性酵母胞壁多糖測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

廢啤酒干酵母 湖北金龍泉啤酒有限公司提供；葡萄糖、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、鹽酸、無水乙醇、丙酮、乙醚 分析純。

320-S型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；JJ-1型電動攪拌器 常州國華電器有限公司；DZT-6020型真空干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；722S型可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；HH·SY11-Ni2型電熱恒溫水浴鍋 北京長源實驗設(shè)備廠。

1.2 溶液的配制

標準葡萄糖溶液制備:取105℃干燥至恒重的D(+)葡萄糖,精密稱重,配成3.62mg/mL的標準儲備液。使用前用蒸餾水稀釋配制成標準葡萄糖使用液(0.0362mg/mL)。

80%苯酚:80g苯酚(分析純重蒸餾試劑)加20g水使之溶解,置冰箱中避光貯存。

6%苯酚:臨用前以80%苯酚配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 堿不溶性酵母胞壁多糖制備工藝[19]稱取100g廢啤酒干酵母,按料液比1∶10g/mL加入1mol/L的NaOH溶液,100℃攪拌處理1h,冷卻后用HCl調(diào)pH4.5,充分攪拌,3000r/min離心20min后棄上清液,沉淀即為酵母胞壁多糖粗品。將沉淀用200mL蒸餾水洗出,100℃水浴20min,3000r/min離心20min；沉淀用100mL95%乙醇洗出,用電動攪拌器攪拌15min后3000r/min離心20min；重復(fù)一次；沉淀用100mL丙酮洗出,攪拌15min后3000r/min離心20min；重復(fù)一次；然后沉淀用100mL無水乙醚洗出,攪拌15min,3000r/min離心20min,沉淀置于沸水浴中揮發(fā)殘余無水乙醚,最后置于37℃下真空烘干,即得堿不溶性酵母胞壁多糖。

1.3.2 標準曲線的制作 采用苯酚-硫酸法[20]。分別精密吸取標準葡萄糖使用液0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60及1.80mL于試管中,各以水補至2.00mL,另一試管加入2.00mL蒸餾水作為空白對照。各試管分別加入6%苯酚1.00mL,然后冷水浴中迅速加入濃硫酸5.00mL,搖勻,并于冷水浴中放置5min,再置沸水浴中加熱15min,取出冷卻至室溫后于490nm處測其吸光度,橫坐標為葡萄糖微克數(shù),縱坐標為吸光度值,得標準曲線。

1.3.3 堿不溶性酵母胞壁多糖含量測定 準確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,測其吸光度,根據(jù)回歸方程計算水解液的糖濃度,然后按式(1)計算堿不溶性酵母胞壁多糖的含量。

多糖含量(%)=水解液的糖濃度(mg/mL)×250mL/稱取的堿不溶性酵母胞壁多糖質(zhì)量(mg)×100

(1)

1.3.4 堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件單因素及正交實驗 水解時間篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后于100℃水浴中分別水解60、90、120、150、180min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標研究水解時間對多糖水解程度的影響。

水解所需H2SO4溶液濃度的篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL濃度分別為1、2、3、4、5mol/L的H2SO4溶液后于100℃水浴中水解90min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標研究H2SO4溶液濃度對多糖水解程度的影響。

水解所需H2SO4溶液體積的篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,分別加入10、15、20、25、30mL的3mol/L H2SO4溶液水解后于100℃水浴中水解90min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標研究H2SO4溶液體積對多糖水解程度的影響。

水解溫度的篩選:精確稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后分別于60、70、80、90、100℃水浴中水解90min,5000r/min離心20min后定容至250mL,然后按1.3.3操作。以多糖含量為考察指標研究水解溫度對多糖水解程度的影響。

在單因素實驗基礎(chǔ)上,確定水解時間、H2SO4溶液濃度、H2SO4溶液體積、水解溫度為實驗因素,以多糖含量為考察指標,根據(jù)正交表L9(34)進行正交實驗,優(yōu)化堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件。

1.3.5 精密度實驗 準確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,連續(xù)5次測定其吸光度。

1.3.6 穩(wěn)定性實驗 每間隔2h準確吸取同一多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,測其吸光度,連續(xù)實驗12h,觀測其穩(wěn)定性。

1.3.7 重現(xiàn)性實驗 取同一批堿不溶性酵母胞壁多糖樣品5份,每份10mg,各加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后于100℃水浴中水解90min,定容至250mL。然后準確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.3操作,測其吸光度并計算多糖含量。

1.3.8 回收率實驗 取同一批堿不溶性酵母胞壁多糖樣品6份,其中5份分別加入不同質(zhì)量的烘干后的葡萄糖,6份樣品均加入20mL 3mol/L H2SO4溶液于100℃水浴中水解90min,定容至250mL。然后準確吸取多糖水解液1.00mL,按1.3.2操作,測其吸光度并根據(jù)回歸方程計算水解液中的糖量,按式(2)計算加標回收率。

加標回收率(%)=(加標樣品總糖量-樣品中的糖量)/加入的葡萄糖質(zhì)量×100

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線

按1.3.2操作,制作標準曲線,見圖1。結(jié)果表明,葡萄糖含量在0～0.06516mg范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系,在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為:y=0.0057x+0.0008,r=0.9998。

2.2 堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件單因素實驗

2.2.1 堿不溶性酵母胞壁多糖水解時間的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表1。

表1 水解時間對堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 1 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

表2 H2SO4溶液濃度對堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 2 Effect of the content of H2SO4 solution on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

表3 H2SO4溶液體積對堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 3 Effect of the volume of H2SO4 solution on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Calibration curve of glucose

從表1中可以看出,在90min前,隨著水解時間的延長,不溶物逐漸減少,水解程度不斷增大,在90min的時候水解程度達到最佳；90min后,硫酸可能使水解生成的糖部分碳化,致使多糖含量減少,水解3h后糖類幾乎全部碳化；也有可能是生成了腐黑物[21]。所以確定水解時間為90min。

2.2.2 堿不溶性酵母胞壁多糖水解所需H2SO4溶液濃度的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表2。從表2中可以看出,隨著硫酸溶液濃度從1mol/L增至3mol/L,堿不溶性酵母胞壁多糖水解程度增大,不溶物減少,多糖含量增加；但當硫酸溶液濃度增至4mol/L及以上時,造成糖類碳化或生成了腐黑物,多糖含量下降。所以確定水解所需硫酸溶液濃度為3mol/L。

2.2.3 堿不溶性酵母胞壁多糖水解所需H2SO4溶液體積的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表3。從表3中可以看出,隨著硫酸溶液用量從10mL增至20mL,堿不溶性酵母胞壁多糖水解程度增大,不溶物逐漸減少,多糖含量增加；但當硫酸溶液用量超過20mL時,造成糖類碳化或生成了腐黑物,多糖含量下降。所以確定水解所需硫酸溶液用量為20mL。

2.2.4 堿不溶性酵母胞壁多糖水解溫度的篩選 堿不溶性酵母胞壁多糖水解后的溶液狀況和多糖含量見表4。從表4中可以看出,隨著水解溫度的升高,堿不溶性酵母胞壁多糖水解逐漸完全,多糖含量增加,且溶液顏色呈無色,說明無碳化和腐黑物生成。所以100℃水浴條件下水解堿不溶性酵母胞壁多糖最適宜。

表4 水解溫度對堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響Table 4 Effect of hydrolysis temperature on the hydrolysis of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

2.3 堿不溶性酵母胞壁多糖水解條件正交實驗

由表5可以看出,各因素對堿不溶性酵母胞壁多糖水解的影響程度依次為H2SO4溶液濃度>水解時間>H2SO4溶液體積>水解溫度。直觀分析最佳水解條件為:稱取制備的堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液于100℃水浴中水解90min。按此條件進行驗證實驗,測得制備的堿不溶性酵母胞壁多糖含量為83.21%,高于所有正交實驗組合。因此確定此條件為最佳水解條件。

表5 正交實驗結(jié)果Table 5 Results of L9(34)orthogonal array design tests

2.4 精密度實驗

連續(xù)5次測定的吸光度見表6。結(jié)果顯示,水解液經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后的吸光度平均值為0.1806,相對標準偏差(RSD)為0.30%(n=5),表明精密度好。

表6 精密度實驗結(jié)果(n=5)Table 6 Precision of the method(n=5)

2.5 穩(wěn)定性實驗

實驗結(jié)果見表7。結(jié)果顯示,相對標準偏差(RSD)為0.67%(n=7),說明水解液在12h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表7 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 7 Stability of the method

2.6 重現(xiàn)性實驗

重現(xiàn)性實驗結(jié)果見表8。結(jié)果顯示,堿不溶性酵母胞壁多糖中多糖含量的平均值為83.10%,相對標準偏差(RSD)為0.29%(n=5),重現(xiàn)性良好。

表8 重現(xiàn)性實驗結(jié)果(n=5)Table 8 Reproducibility of the method(n=5)

2.7 回收率實驗

實驗結(jié)果見表9。結(jié)果顯示,加標回收率的平均值為99.87%,相對標準偏差(RSD)為1.16%(n=5),說明測試結(jié)果準確度高。因此用本方法測定堿不溶性酵母胞壁多糖可靠。

表9 樣品測定結(jié)果和回收率(n=5)Table 9 Average spike recovery of the method(n=5)

3 結(jié)論

本實驗通過硫酸溶液水解堿不溶性酵母胞壁多糖,水解條件為:準確稱取堿不溶性酵母胞壁多糖10mg,加入20mL 3mol/L H2SO4溶液后于100℃水浴中水解90min,然后定容至250mL。準確吸取水解液1.0mL,按苯酚-硫酸法操作,測其吸光度,根據(jù)回歸方程和式(1)計算堿不溶性酵母胞壁多糖含量。本方法準確率高,穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性好,結(jié)果可靠,操作簡便,水解時間較文獻[21]縮短了很多,是測定堿不溶性酵母胞壁多糖含量的有效方法。

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Study on the phenol-sulfuric acid determination methodof alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides

ZHOU Li-ming,ZHANG Yong

(College of Life Science,Shangrao Normal University,Shangrao 334001,China)

To determine the concent of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides,the solution of H2SO4was used to hydrolysis the alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides,then the saccharide of the hydrolytic solution was determined by phenol-sulfuric acid method. The hydrolysis condition was optimized by single factor and orthogonal experiments. The optimized hydrolysis condition was as follows:10mg alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides were hydrolyzed for 90min at 100℃ with 20mL 3mol/L H2SO4solution. Then the solution was volumed to 250mL and the content of saccharide was determined. The RSD of precision was 0.30%. The RSD of stability was 0.67%. The RSD of reproducibility was 0.29%. The average spike recovery was 99.87%,with 1.16% RSD. The method was effective for determination of alkali-insoluble yeast cell wall polysaccharides.

alkali-insoluble;yeast cell wall polysaccharides;hydrolysis;phenol-sulfuric acid method

2014-04-08

周麗明(1980-)，女，碩士，講師，研究方向:生物活性物質(zhì)。

TS261.9

A

1002-0306(2015)03-0311-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.057