重慶皺皮木瓜果渣總黃酮提取工藝優(yōu)化研究

韋正鑫,劉世堯,卞京軍,蔡 娟,潘雪珍,張 丹,白志川

(西南大學(xué)園藝園林學(xué)院,重慶北碚 400715)

重慶皺皮木瓜果渣總黃酮提取工藝優(yōu)化研究

韋正鑫1,劉世堯2，*,卞京軍2,蔡 娟2,潘雪珍2,張 丹2,白志川2，*

(西南大學(xué)園藝園林學(xué)院,重慶北碚 400715)

利用重慶皺皮木瓜果渣進(jìn)行總黃酮提取工藝優(yōu)化研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,考察乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取方法等因素對(duì)皺皮木瓜果渣中總黃酮提取效果的影響,并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳提取條件。影響皺皮木瓜果渣總黃酮提取的因素大小順序?yàn)?提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比,其中溫度對(duì)總黃酮得率影響較明顯。最佳提取工藝:濃度50%乙醇為提取溶劑,提取溫度60℃,料液比1∶30(g·mL-1),提取時(shí)間80min；在最佳工藝條件下,皺皮木瓜果渣中總黃酮得率約為0.527%。本實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化工藝簡(jiǎn)便準(zhǔn)確易行。

皺皮木瓜果渣,總黃酮,提取工藝

皺皮木瓜(ChaenomelesSpeciosa)又名貼梗海棠,屬薔薇科(Rosaceae)木瓜屬(Chaenomeles)植物,為多年生落葉灌木,主產(chǎn)湖北、四川、山東、安徽、浙江等省區(qū)[1-2]。皺皮木瓜中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),主要包括蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、齊墩果酸以及黃酮類化合物、鞣質(zhì)、纖維素等化學(xué)成分[3]。其中黃酮類化合物又稱總黃酮,是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物,現(xiàn)在則泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接的一系列化合物,總黃酮一般不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑。近年來發(fā)現(xiàn)皺皮木瓜中含有的總黃酮作用廣泛,在相關(guān)報(bào)道[4-5]中提及到它的食用性,它具有顯著地抗氧化及抗自由基、降壓調(diào)血脂、抗癌防癌、抑菌、消炎、鎮(zhèn)痛和松弛胃腸平滑肌等功能[6-7]。我國(guó)木瓜種類繁多,資源豐富,發(fā)掘并利用皺皮木瓜生物資源活性物質(zhì)很有研究?jī)r(jià)值。

目前對(duì)總黃酮提取工藝已有相關(guān)研究[8-10],對(duì)不同種的木瓜材料,總黃酮的含量在6.66～40.839mg/g,得率在0.45%～1.348%[2,5,7],而皺皮木瓜也因不同品種間差異總黃酮含量跨度大,但一般在8.42mg/g以上[4]。本實(shí)驗(yàn)考慮安全、環(huán)保等因素，選擇乙醇作為皺皮木瓜總黃酮的提取溶劑[11],利用皺皮木瓜果渣進(jìn)行總黃酮提取工藝優(yōu)化研究,延長(zhǎng)深加工鏈,提高皺皮木瓜鮮果附加值,現(xiàn)未見相關(guān)報(bào)道,為后續(xù)研究提供參考。因此為進(jìn)一步探索皺皮木瓜果渣中總黃酮物質(zhì)提取的方法,確定各提取條件的適宜水平,利用對(duì)照品建立一元線性回歸方程、回歸直線,并采用單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行結(jié)合,對(duì)皺皮木瓜果渣中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。這為皺皮木瓜果渣中總黃酮提取提供了方法依據(jù)和理論基礎(chǔ),也為皺皮木瓜的開發(fā)利用開辟新的途徑,提高皺皮木瓜產(chǎn)品的附加值,促進(jìn)木瓜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,以期為規(guī)?；a(chǎn)提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皺皮木瓜果實(shí)樣品:采樣于重慶市綦江縣石壕鎮(zhèn),其原植物標(biāo)本經(jīng)西南大學(xué)園藝園林學(xué)院白志川教授鑒定為薔薇科蘋果亞科木瓜屬皺皮木瓜(ChaenomelesSpeciosa(sweet)Nakai),成熟新鮮果實(shí)采樣后洗凈切片榨汁,所得榨汁后殘留的果渣置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱,45℃干燥至恒重備用。

乙醇、醋酸鈉、冰醋酸、三氯化鋁等(均為分析純) 北京化學(xué)試劑廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,生產(chǎn)批號(hào)100080-200707) 購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

萬分之一電子天平 瑞士 Mettler Toledo公司；Molgene 210a型超純水機(jī) 上海摩爾科學(xué)儀器有限公司；DU730型核酸蛋白質(zhì)分析儀 美國(guó)Beckman Coulter公司；TA2003A型臺(tái)式離心機(jī) 上海哈菲爾分析儀器有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JA2003A千分之一電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ZN-04B小型粉碎機(jī) 北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；KQ-250DB型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 總黃酮含量的測(cè)定

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品68mg,用無水乙醇定容至100mL,超聲得到質(zhì)量濃度為0.68mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.0078,0.0157,0.0313,0.0625,0.125,0.25mL于10mL比色管中,各加入0.1mol·L-1AlCl32.0mL,NaAc-HAc緩沖溶液(pH5.2)1.0mL,用濃度為50%乙醇溶液定容至10.0mL,搖勻放于40℃的溫水浴中顯色10min后,在波長(zhǎng)406nm處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁溶液的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 皺皮木瓜果渣中總黃酮含量的測(cè)定 皺皮木瓜果渣總黃酮含量測(cè)定應(yīng)用三氯化鋁比色法[12-13]。精確移取皺皮木瓜果渣總黃酮提取供試液1.0mL于10mL比色管中,按照1. 2.1節(jié)方法測(cè)定吸光度以計(jì)算其中總黃酮含量。

1.2.3 總黃酮得率的計(jì)算公式 皺皮木瓜樣品中總黃酮質(zhì)量濃度與吸光度在一定條件下遵從朗伯-比耳定律,以蘆丁為基準(zhǔn)物,參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮得率。

式中:Y為總黃酮得率(%)；ρ1為吸光度按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出得顯色溶液中黃酮質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；V1為顯色時(shí)溶液的定容體積(mL)；V2為顯色時(shí)移取的提取液的體積(mL)；V為提取液的總體積(mL)；m為稱取樣品的質(zhì)量(g)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 單因素水平設(shè)置 實(shí)驗(yàn)水平設(shè)置如下,乙醇濃度:45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%；料液比:1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g·mL-1；提取溫度:30、40、50、60、70、80℃；提取時(shí)間:10、20、30、40、50、60、70、80min；提取方法:索式、回流、浸提、滲漉[14-16]、240W功率超聲。

1.3.1.2 單因素下皺皮木瓜果渣總黃酮的提取方法 取干燥的皺皮木瓜果渣,粉碎過80目篩后準(zhǔn)確稱量1.000g,置于50mL的燒瓶中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平要求按照不同提取方法進(jìn)行總黃酮提取,經(jīng)3000r/min離心10min得到提取上清液,對(duì)殘?jiān)恋碓僖淮芜M(jìn)行提取,合并兩次上清液,即得供試液。按照1.2.1節(jié)方法,準(zhǔn)確稱量干燥粉碎的皺皮木瓜果渣1.000g,置于50mL的燒瓶中進(jìn)行總黃酮提取,每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù),并按1.2.3節(jié)中總黃酮測(cè)定方法測(cè)定吸光度,參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及公式,計(jì)算總黃酮得率。

索式提取法:精密稱取木瓜果渣粉末1.000g,加入50mL 50%乙醇索式提取2h,濾過,用50%定容乙醇于50mL容量瓶中；超聲提取法:精密稱取木瓜果渣粉末1.000g,加入50%乙醇50mL超聲提取2h,過濾殘?jiān)偌尤?0%乙醇50mL超聲提取2h,合并兩次濾液,定容于100mL的容量瓶中；回流提取法:精密稱取木瓜果渣粉末1.000g用50mL 50%乙醇回流2h,最后定容到50mL的容量瓶中；浸提提取:精密稱取木瓜果渣粉末1.000g用50mL 50%乙醇進(jìn)行浸提2h,最后定容到50mL的容量瓶中；滲漉提取:精密稱取木瓜果渣粉末1.000g用50mL50%乙醇進(jìn)行滲漉2h,最后用50%定容乙醇于50mL容量瓶中。

一直以來，無論是市場(chǎng)營(yíng)銷學(xué)理論界還是教科書，都把市場(chǎng)營(yíng)銷分為傳統(tǒng)和現(xiàn)代兩大觀念，作為市場(chǎng)營(yíng)銷學(xué)的經(jīng)典理論被廣泛應(yīng)用。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),由于實(shí)際操作中總黃酮提取受乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取溫度(D)四個(gè)因素交叉影響,為優(yōu)化皺皮木瓜果渣中總黃酮的提取工藝,考察各因素對(duì)總提取效果的影響并確定最優(yōu)工藝條件,我們選用四因素、三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)(表1)。影響皺皮木瓜皮渣中總黃酮得率的主要因素作為考察因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),以總黃酮得率(Y)為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),每個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)重復(fù)2次,各實(shí)驗(yàn)處理見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度A的關(guān)系,得到線性曲線,如圖1所示。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程Y=44.608X+0.0218,R2=0.9979,表明當(dāng)溶液質(zhì)量濃度在0～0.017mg·mL-1范圍內(nèi),溶液質(zhì)量濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。皺皮木瓜果渣中總黃酮A為0.004,通過回歸方程計(jì)算得到皺皮木瓜中總黃酮的濃度約為0.217mg·mL-1,總黃酮含量為8.68mg/g。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響 在料液比1∶30、提取溫度60℃、提取時(shí)間80min、240W功率超聲提取兩次條件下,考察濃乙醇濃度對(duì)皺皮木瓜果渣中總黃酮得率的影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,皺皮木瓜總黃酮得率隨著乙醇濃度在45%～50%范圍內(nèi)增加而升高,在50%～80%范圍內(nèi)增加而降低,在濃度45%～55%有最大值。因此,選定45%、50%、55%是乙醇濃度對(duì)總黃酮得率較敏感的3個(gè)水平。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取的影響 濃度50%乙醇為提取劑、提取溫度60℃、提取時(shí)間80min、240W功率超聲提取兩次條件下,考察料液比對(duì)皺皮木瓜果渣中總黃酮得率的影響。由圖3可知,隨著提取劑使用量增大總黃酮得率隨之升高,當(dāng)料液比達(dá)到1∶25后,繼續(xù)增大提取劑使用量得率變化不大。從減少試劑用量和保證提取效率綜合考慮,選定1∶20、1∶25、1∶30(g·mL-1)是料液比對(duì)總黃酮得率較敏感的3個(gè)水平。

圖3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig. 3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

2.2.3 提取溫度對(duì)總黃酮提取的影響 濃度50%乙醇為提取劑、料液比為1∶30(g·mL-1)、提取時(shí)間80min、240W功率超聲提取兩次,考察30、40、50、60、70、80℃不同提取溫度條件對(duì)皺皮木瓜果渣中總黃酮得率的影響。如圖4所示,在30～60℃的溫度范圍內(nèi),得率隨提取溫度的升高而增大；當(dāng)溫度高于60℃后進(jìn)一步升高溫度,得率反而降低。考慮提取溫度影響及節(jié)約能源,選定50、60、70℃是提取溫度對(duì)總黃酮得率較敏感的3個(gè)水平。

圖4 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

2.2.5 提取方法對(duì)總黃酮提取的影響 分別進(jìn)行索式、回流、浸提、滲漉、240W功率超聲提取,考察不同提取方法對(duì)皺皮木瓜果渣中總黃酮得率的影響。由圖6可知,采用5種不同方法對(duì)皺皮木瓜總黃酮進(jìn)行提取,其中超聲得率最高也最方便,所以采用超聲提取為效果好且最簡(jiǎn)單易操作的方法。

圖6 提取方法對(duì)總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of extraction methods effects on the yield of flavonoids

2.3 實(shí)驗(yàn)因素對(duì)總黃酮提取率的影響

正交實(shí)驗(yàn)所得皺皮木瓜皮渣中總黃酮得率(Y)結(jié)果見表2。

表2 L9(43)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和直觀分析Table 2 L9(43)orthogonal experiment results and intuitive analysis

從表2,表3可以清楚直觀的看出,實(shí)驗(yàn)的4個(gè)因素中,綜合極差R大小順序及方差分析各因素對(duì)總黃酮提取影響顯著性大小,得出影響皺皮木瓜果渣總黃酮提取大小順序是:提取溫度(D)>乙醇濃度(A)>提取時(shí)間(C)>料液比(B),其中顯著性分析顯示,提取溫度對(duì)總黃酮得率影響顯著,這表明皺皮木瓜果渣總黃酮提取中溫度控制需更加穩(wěn)定。從表2中K值可以得出,皺皮木瓜果渣中總黃酮提取的最優(yōu)組合:A2B3C3D2,即采用50%的乙醇溶液,以1∶30(g·mL-1)的料液比在60℃的水浴中240W超聲80min。

表3 正交結(jié)果方差分析Table 3 Orthogonal the results of variance analysis

2.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取干燥的皺皮木瓜果渣,粉碎過80目篩后準(zhǔn)確稱量1.000g 3份,按最佳工藝在濃度50%的乙醇溶液,提取溫度為60℃,料液比為1∶30(g·mL-1),240W功率超聲提取時(shí)間80min條件下提取兩次后進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定,平行測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4 Repetitive experimental results(n=3)

從表4可以看出,最佳工藝提取技術(shù)較穩(wěn)定,測(cè)定皺皮木瓜果渣中總黃酮的平均得率為0.527%,高于正交組合的提取率,科學(xué)可行,達(dá)到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)要求。根據(jù)表4可知1.000g皺皮木瓜果渣中總黃酮提取量約為5.267mg。

2.5 最優(yōu)提取條件確定

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出4因素影響的主次為:提取時(shí)間,乙醇濃度,提取時(shí)間,料液比。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素,時(shí)間因素,消耗能源方面,確定最優(yōu)提取條件為濃度50%的乙醇,以1∶30(g·mL-1)料液比在60℃的水浴中240W功率超聲提取80min,提取次數(shù)兩次。

3 結(jié)論

本文就皺皮木瓜果渣總黃酮提取工藝進(jìn)行了單因素的實(shí)驗(yàn)探索,并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明:影響皺皮木瓜果渣總黃酮提取的因素大小順序?yàn)?提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比,其中溫度對(duì)總黃酮得率影響較明顯。皺皮木瓜果渣中總黃酮提取的最優(yōu)組合:A2B3C3D2,即為濃度50%乙醇為提取溶劑、提取溫度60℃,料液比1∶30(g·mL-1),提取時(shí)間80min；在最優(yōu)提取條件下,皺皮木瓜果渣中總黃酮得率約為0.527%。綜合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明本實(shí)驗(yàn)采用的工藝條件操作簡(jiǎn)單,效果準(zhǔn)確。由于本實(shí)驗(yàn)為初步探究,這為皺皮木瓜資源在我國(guó)的開發(fā)利用和發(fā)展提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但旨得到皺皮木瓜果渣中總黃酮更精確提取條件,需設(shè)計(jì)各因素水平梯度范圍以研究其對(duì)總黃酮提取的影響。本研究在保健食品、疾病防治、醫(yī)療保健等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景,更具有理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

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Study on flavonoids extraction technology fromChaenomelesSpeciosapomace of Chongqing

WEI Zheng-xin1,LIU Shi-yao2,*,BIAN Jing-jun2,CAI Juan2,PAN Xue-zhen2,ZHANG Dan2,BAI Zhi-Chuan2,*

(Southwest university Institute of Gardening,Beibei 400715,China)

To optimize the extraction process conditions for total flavonoids from theChaenomelesSpeciosapomace of Chongqing. On the basis of the single-factor test,effects of solid-liquid atio,ethanol concentration,extraction time,extraction temperature and extraction times on the extraction rate were studied by taking the content of total flavonoids as the index. The influence degree of four factors on the extraction rate of total flavonoids was in the order of extraction temperature>ethanol concentration>extraction time>solid-liquid ratio.Among them,temperature had relatively significant impacts on the yield rate of total flavonoids fromChaenomelesSpeciosapomace. The best extraction technology:concentration of 50% ethanol as xtraction solvent,60℃ extraction temperature,1∶30(g·mL-1)solid-liquid ratio,80min extracting time. Under this condition,the yield was 0.527%. This method was simple convenient and accurate for the detection of total flavonoids.

ChaenomelesSpeciosapomace;flavonoid;extraction technology

2014-05-19

韋正鑫(1990-)，女，碩士，研究方向：植物化學(xué)。

*通訊作者:白志川(1956-)，女，博士，教授，研究方向：藥用植物。 劉世堯(1979-)，男，碩士，副教授，研究方向：植物資源學(xué)與中藥材質(zhì)量控制方向。

重慶科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目( CSTC，2009AC1180)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)03-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.042