響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉多糖提取工藝

李穎暢,王亞麗,齊鳳元,張 笑,李作偉

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉多糖提取工藝

李穎暢1，2，3,王亞麗1，2，3,齊鳳元1，2，3,張 笑1，2，3,李作偉1，2，3

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

植物多糖是一種重要的生物活性物質(zhì),具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和防治心血管疾病等作用。對(duì)藍(lán)莓葉多糖進(jìn)行有效的開發(fā)利用,對(duì)提高藍(lán)莓葉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要意義。本文采用熱水浸提,醇沉的方法提取藍(lán)莓葉多糖,通過響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉多糖提取工藝,硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:提取時(shí)間為4.2h,提取溫度為85℃,料液比為1∶35(g/mL),5倍體積乙醇醇沉6h時(shí),提取藍(lán)莓葉多糖的能力最佳。在此工藝條件下得到藍(lán)莓葉多糖的提取量為29.2mg/g。本實(shí)驗(yàn)從藍(lán)莓葉中提取多糖,為今后進(jìn)一步研究與開發(fā)藍(lán)莓葉資源提供了理論依據(jù)。

藍(lán)莓葉多糖,提取,醇沉,響應(yīng)面法

藍(lán)莓,又稱烏飯樹、越桔、藍(lán)漿果等,屬杜鵑花科越桔屬植物[1]。我國(guó)藍(lán)莓葉資源豐富,分布于全國(guó)各地。藍(lán)莓葉,一般為橢圓形至長(zhǎng)圓形,全綠,藥食兩用。藍(lán)莓葉中含有多糖類、多酚類化合物、氨基酸、脂肪酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、有機(jī)酸、維生素、礦質(zhì)元素、甾醇和萜類等[2-3]。多糖是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的物質(zhì),近年來越來越多的植物多糖被用于藥物和功能食品上,植物多糖具有抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤和抗病毒等生物活性[4-7]。目前對(duì)藍(lán)莓葉的研究大多集中在藍(lán)莓葉多酚的提取、生物活性等研究上[8-14],對(duì)藍(lán)莓葉多糖的研究還鮮有報(bào)道。本文主要從提取時(shí)間,提取溫度,料液比等方面探索了藍(lán)莓葉多糖提取的最佳工藝條件,并從醇沉?xí)r乙醇的加入量,醇沉?xí)r間方面探索了醇沉分離多糖的最佳提取工藝,為藍(lán)莓葉多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為進(jìn)一步研究開發(fā)藍(lán)莓葉高附加值產(chǎn)品以及對(duì)藍(lán)莓葉資源的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓葉 采于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)發(fā)展研究院；葡萄糖(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸(優(yōu)級(jí)純),硫酸含量98% 錦州市古城化學(xué)試劑廠；苯酚(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇(分析純) 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

萬能高速粉碎機(jī) 歐凱萊芙(香港)實(shí)業(yè)公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水真空泵 上海申光儀器儀表有限公司；TD5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；101B-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海申光儀器儀表有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度儀(SHIMADZU) 島津儀器(蘇州)有限公司；FA2004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量的測(cè)定 多糖含量的測(cè)定采用硫酸苯酚比色法[15]。多糖濃度根據(jù)回歸曲線方程計(jì)算,多糖提取量根據(jù)以下公式計(jì)算。

多糖提取量(mg/g)=C×V×n/(1000m)

其中：C是藍(lán)莓葉多糖濃度(μg/mL),V是提取樣品體積(mL),n是稀釋倍數(shù),m藍(lán)莓葉多糖的質(zhì)量(g)。

1.2.2 藍(lán)莓葉多糖提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 提取時(shí)間的確定 稱取藍(lán)莓葉干燥粉末2g,在料液比為1∶40(g/mL),提取溫度80℃,醇沉?xí)r加入乙醇的倍數(shù)為4倍,醇沉?xí)r間為靜置過夜的條件下,考察提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5h對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響。

1.2.2.2 提取溫度的確定 稱取藍(lán)莓葉干燥粉末2g,在料液比為1∶40(g/mL),提取時(shí)間4h,醇沉?xí)r加入乙醇的倍數(shù)為4倍,醇沉?xí)r間為靜置過夜的條件下,考察溫度分別為60、70、80、90、100℃對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響。

1.2.2.3 料液比的確定 稱取藍(lán)莓葉干燥粉末2g,在提取時(shí)間4h,提取溫度80℃,醇沉?xí)r加入乙醇的倍數(shù)為4倍,醇沉?xí)r間為靜置過夜條件下,考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響。

1.2.3 藍(lán)莓葉多糖提取條件的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),因素水平表見表1,以藍(lán)莓葉多糖提取量為指標(biāo),通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件。

1.2.4 藍(lán)莓葉多糖醇沉工藝

1.2.4.1 醇沉?xí)r間的確定 稱取藍(lán)莓葉干燥粉末2g,在料液比為1∶40(g/mL),熱水提取時(shí)間4h,提取溫度80℃,醇沉加乙醇倍數(shù)為4倍的條件下,醇沉?xí)r間分別為2、4、6、8、10h,離心去除上層清液得粗多糖,以藍(lán)莓葉多糖提取量為指標(biāo),確定最佳的醇沉?xí)r間。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4.2 醇沉?xí)r乙醇加入量的確定 稱取藍(lán)莓葉干燥粉末樣2g,在料液比為1∶40(g/mL),熱水提取時(shí)間4h,提取溫度80℃的條件下,向處理后的濃縮液中分別加入2、3、4、5、6倍量的無水乙醇,醇沉?xí)r間為靜置過夜,離心除去上層清液得到粗多糖,以藍(lán)莓葉多糖提取量為指標(biāo),確定最佳的乙醇加入量。

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取藍(lán)莓樣品2g,在提取時(shí)間4.2h、提取溫度85℃、料液比1∶35(g/mL)；5倍體積乙醇醇沉,醇沉?xí)r間為6h條件下,對(duì)藍(lán)莓葉多糖進(jìn)行提取。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1得到回歸方程為y=0.0396x-0.0052(R2=0.9992),吸光度與葡萄糖濃度具有良好的線性關(guān)系,因此,可用于藍(lán)莓葉多糖含量測(cè)定。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響

從圖2可以看出,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖提取量升高,提取時(shí)間為1h時(shí),多糖提取量只有16.6mg/g；在提取時(shí)間為4h,多糖提取量達(dá)到最大值,此時(shí)的多糖提取量已經(jīng)達(dá)到23.3mg/g。當(dāng)多糖提取時(shí)間為5h時(shí),多糖提取量略有降低,但和提取時(shí)間為4h多糖提取量差異不顯著。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),熱水致使藍(lán)莓葉原料中大分子多糖分解,導(dǎo)致多糖提取量略有下降。此外,提取時(shí)間過長(zhǎng)還會(huì)使溶解的雜質(zhì)增多,使多糖的純度降低,因此,藍(lán)莓葉多糖的最佳提取時(shí)間為4h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide yield

2.3 提取溫度對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響

從圖3可以看出,隨著提取溫度的提高,多糖提取量呈現(xiàn)先升高然后降低的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度為60℃時(shí),多糖提取量為10.5mg/g；當(dāng)提取溫度為80℃時(shí),多糖提取量達(dá)到23.9mg/g,此時(shí)藍(lán)莓葉多糖的提取量最高。超過80℃后,藍(lán)莓葉多糖的提取量略有下降,當(dāng)提取溫度為100℃時(shí),多糖提取量只為19.9mg/g?？赡苁且?yàn)檩^高溫度破壞了部分浸出的多糖,蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的析出也將增加,從而使多糖的提取量略有降低。因此,藍(lán)莓葉多糖的最佳提取溫度為80℃。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

2.4 料液比對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響

從圖4可以看出,當(dāng)料液比為1∶20(g/mL)時(shí),多糖提取量為11.9mg/g,隨提取液用量的增加,多糖提取量逐漸增加。當(dāng)料液比為1∶40(g/mL)時(shí),多糖提取量最高,當(dāng)再增大提取液的用量時(shí),多糖提取率逐漸下降,當(dāng)料液比為1∶60(g/mL)時(shí),多糖提取量只為19.1mg/g。這是因?yàn)楫?dāng)溶劑體積過少時(shí),不利于多糖的徹底溶解。當(dāng)溶劑用量越多,隨之?dāng)U散到溶劑里的多糖就越多,并且會(huì)使其他雜質(zhì)同時(shí)溶出,從而影響藍(lán)莓葉多糖的溶出。所以,從提取效率和減少溶劑回收難度等角度考慮,提取藍(lán)莓葉多糖的最佳料液比為1∶40(g/mL)。

圖4 料液比對(duì)多糖提取量的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on polysaccharide yield

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉多糖提取工藝

2.5.1 藍(lán)莓葉多糖提取工藝參數(shù)的優(yōu)化 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件,采用Box-Behnken Design 建立數(shù)學(xué)模型,以提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)為自變量,以多糖提取量為因變量共設(shè)立了15個(gè)處理組。因素編碼及水平見表2,由Box-Behnken Design設(shè)計(jì)方案所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析,經(jīng)回歸擬和后得到回歸方程:

Y=24.30+1.04X1+0.64X2+0.20X3-0.42X1X2-0.15X1X3-0.80X2X3-0.087X12+1.66X22+0.89X32。對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),從表3可以看出,一次項(xiàng)提取時(shí)間X1、提取溫度X2對(duì)藍(lán)莓葉多糖的提取量有顯著影響；二次項(xiàng)中的交互作用項(xiàng)提取溫度與料液比X2X3、平方項(xiàng)提取溫度X22、料液比X32對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響顯著；其它對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量的影響不顯著。從F值可以看出,對(duì)于該模型來說,而對(duì)多糖提取量的影響趨勢(shì)為X1>X2>X3,即提取時(shí)間的影響最大,料液比的影響最小。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of Box-Behnken

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for each term of developed quadratic regression model

注:*.差異顯著(p<0.05)。2.5.2 響應(yīng)面分析和優(yōu)化 響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,圖5～圖7為提取時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)在其中一個(gè)固定時(shí),另外兩個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓葉多糖含量的交互影響曲面圖。比較響應(yīng)面優(yōu)化圖5可以看出,相對(duì)提取溫度,提取時(shí)間(X1)對(duì)藍(lán)莓葉多糖含量的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,等高線密集；提取溫度次之,表現(xiàn)為曲線較為平滑；從圖6可以看出,相對(duì)料液比,提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量影響顯著,等高線密集,料液比對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量影響不顯著,等高線稀疏。從圖7可以看出,提取溫度對(duì)藍(lán)莓葉多糖提取量影響顯著,料液比的影響小,曲線平緩,等高線稀疏。選擇合適的提取溫度、料液比以及提取時(shí)間,可獲得較高的多糖提取量。對(duì)多糖提取量影響的3個(gè)因素中,從大到小依次為:提取時(shí)間(X1)>提取溫度(X2)>料液比(X3)。

圖5 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Extraction time and extraction temperature on the polysaccharide of response surface diagram

圖6 提取時(shí)間和料液比對(duì)多糖的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Extraction time and solid-liquid ratio on the polysaccharide of response surface diagram

圖7 提取溫度和料液比對(duì)多糖的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Extraction temperature and liquid materials on the polysaccharide of response surface diagram

從上述回歸模型中求得最佳提取條件為提取時(shí)間4.2h、提取溫度85℃、料液比1∶35(g/mL),藍(lán)莓葉多糖提取量的理論值為28.3mg/g。由于以上最佳條件未包括在響應(yīng)面優(yōu)化的15組實(shí)驗(yàn)中,需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在最佳提取條件下,藍(lán)莓葉多糖的提取量為27.9mg/g,與預(yù)測(cè)值相差不大,說明該方程與實(shí)際情況擬合很好,充分驗(yàn)證了所建模型的正確性,說明響應(yīng)面法適用于藍(lán)莓葉多糖物質(zhì)提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.6 醇沉工藝條件的確定

2.6.1 醇沉?xí)r乙醇加入量的確定 從圖8可以看出,當(dāng)乙醇的加入量為2倍體積時(shí),多糖提取量為18.6mg/g,隨著乙醇加入倍數(shù)的增加,藍(lán)莓葉多糖提取量提高；當(dāng)乙醇的加入量為5倍體積時(shí),多糖提取量為25.1mg/g,多糖提取量達(dá)到最高,之后又下降。說明一定倍數(shù)的乙醇能夠使多糖的溶解度降低,有利于多糖的沉淀；高濃度醇會(huì)導(dǎo)致一些雜質(zhì)的沉淀和多糖的溶出,致使沉淀物中多糖純度下降。因此選擇乙醇加入量為5倍體積。

圖8 醇沉倍數(shù)對(duì)多糖提取量的影響Fig.8 Effect of the ethanol folds on polysaccharides yield

2.6.2 醇沉?xí)r間的確定 從圖9可以看出,當(dāng)醇沉?xí)r間為2h時(shí),多糖提取量為19.3mg/g。隨著醇沉?xí)r間的延長(zhǎng),多糖充分沉淀,多糖提取量呈上升的趨勢(shì),當(dāng)醇沉?xí)r間為6h時(shí),多糖提取量為26.6mg/g,但再經(jīng)過一段時(shí)間,提取量反而下降,當(dāng)醇沉?xí)r間為10h時(shí),多糖提取量降為23.7mg/g。這可能是因?yàn)榇汲習(xí)r間過長(zhǎng),致使沉淀出的多糖分解成單糖或其他物質(zhì),使測(cè)得到的多糖的有效成分降低,從而致使吸光度下降。所以,選擇醇沉?xí)r間為6h。

圖9 醇沉?xí)r間對(duì)多糖提取率的影響Fig.9 The effect of the ethanol-precipitation time on polysaccharides yield

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)回歸方程為y=0.0396x-0.0052(R2=0.9992)和計(jì)算公式多糖提取量(mg/g)=C×V×n/(1000m),得出藍(lán)莓葉提取量為28.8、29.7、29.1mg/g,平均值為29.2mg/g。

3 結(jié)論

3.1 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件,采用Box-Behnken Design建立了提取時(shí)間X1、提取溫度X2和料液比X3與藍(lán)莓葉多糖含量之間數(shù)學(xué)模型,

Y=24.30+1.04X1+0.64X2+0.20X3-0.42X1X2-0.15X1X3-0.80X2X3-0.087X12+1.66X22+0.89X32,回歸分析表明,相關(guān)系數(shù)R2=0.9405,p<0.01,表明擬合程度好,有實(shí)際應(yīng)用意義；通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn),各因素對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)?提取時(shí)間>提取溫度>料液比。

3.2 利用模型的響應(yīng)面對(duì)影響藍(lán)莓葉多糖含量的關(guān)鍵因子及其相互作用進(jìn)行探討,優(yōu)化出藍(lán)莓葉多糖提取工藝的最佳條件為:提取時(shí)間4.2h、提取溫度85℃、料液比1∶35(g/mL)。藍(lán)莓葉多糖含量的預(yù)測(cè)值為28.3mg/g,驗(yàn)證值為27.9mg/g。

3.3 藍(lán)莓葉多糖提取的優(yōu)化醇沉工藝條件為5倍體積乙醇醇沉,醇沉?xí)r間為6h。

3.4 在優(yōu)化后的提取條件和醇沉條件下藍(lán)莓葉多糖的提取量為29.2.mg/g。

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Optimization of extraction process of polysaccharides fromBlueberry leaves by response surface methodology

LI Ying-chang1，2，3,WANG Ya-li1，2，3,QI Feng-yuan1，2，3,ZHANG Xiao1，2，3,LI Zuo-wei1，2，3

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China;2.Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;3.Engineering and Technology Research Centerof Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

Polysaccharide is a kind of important biological active substance. Therefore,it is significant to effectively develop and utilize the polysaccharide from blueberry leaves and improve the economic and social benefits of blueberry leaves. In this paper,polysaccharide was extracted by the method of hot water immersed extraction and ethanol precipitation. Extraction process of water-soluble polysaccharides from blueberry leaves was optimized by response surface methodology. The content of polysaccharide was determined by sulfuric acid to phenol method. The results showed that the extraction time was 4.2h,extraction temperature was 85℃ and the ratio of material to liquid was 1∶35(g/mL). Polysaccharide was precipitated with 5 folds volume of ethanol for 6h. The proportion of the extraction of polysaccharide from blueberry leaves under this industrial process conditions was 29.2mg/g.

polysaccharide from blueberry leaves；extraction；ethanol precipitation；Box-Behnken design

2014-06-13

李穎暢(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：農(nóng)、水產(chǎn)品貯藏加工與質(zhì)量安全控制。

國(guó)家自然基金(31201308)。

TS254.4

B

1002-0306(2015)03-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.039