杜仲雄花茶多糖的響應(yīng)面優(yōu)化提取及其抗氧化活性評價(jià)

朱麗蓉,吳萍萍,楊大偉,董娟娥,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100；2.山西省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院,山西太原 030012；3.平利縣古仙湖生態(tài)養(yǎng)殖有限公司,陜西平利 725500)

杜仲雄花茶多糖的響應(yīng)面優(yōu)化提取及其抗氧化活性評價(jià)

朱麗蓉1,吳萍萍2,楊大偉3,董娟娥1,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100；2.山西省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院,山西太原 030012；3.平利縣古仙湖生態(tài)養(yǎng)殖有限公司,陜西平利 725500)

為了尋找杜仲雄花茶多糖的提取工藝,考察多糖的抗氧化活性,采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),并用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,以DPPH·清除率、·OH清除率和還原力等指標(biāo)評價(jià)杜仲雄花茶多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明:杜仲雄花茶多糖的提取工藝參數(shù)為:提取溫度90℃、提取時(shí)間4.5h、液料比15∶1。在此工藝條件下,多糖提取得率為3.48%。以合成抗氧化劑BHT為對照,1mg/mL杜仲雄花茶多糖對DPPH·的清除率為52.5%,還原力為72.73%,對·OH的清除率為63.1%。杜仲雄花茶具有一定的抗氧化活性。

杜仲,多糖,抗氧化,提取,響應(yīng)面

多糖(polysaccharides)是由10個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物[1],廣泛存在于真菌、藻類和高等植物中的一類生物活性物質(zhì)[2]。近年研究表明,天然活性多糖具有廣泛的藥理活性,包括免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]和抗病毒作用[7]等,又因其毒性較低,國內(nèi)外關(guān)于它的研究得到迅速發(fā)展,一些多糖方面的藥物也得到了開發(fā),如香菇多糖等[8]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)為杜仲科、杜仲屬的落葉喬木,其皮和葉皆可入藥[9]。具有降血壓、抗衰老、抗癌、抗菌、鎮(zhèn)痛、消炎、利尿、鎮(zhèn)靜、安神、抗病毒以及增強(qiáng)機(jī)體非特異免疫力等作用,對細(xì)胞免疫有雙向調(diào)節(jié)功效[10]。杜仲多糖是杜仲重要的活性成分,具有抗補(bǔ)體效應(yīng)[11]、抗肝纖維化作用[12]、提高免疫作用[13]、毒性保護(hù)作用[14]等。杜仲為雌雄異株植物,杜仲雄花產(chǎn)量很高,據(jù)統(tǒng)計(jì)每年約有30000t的產(chǎn)花量[15]。我們對杜仲雄花中的生物活性成分和營養(yǎng)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究[16],并將杜仲雄花加工成雄花茶,進(jìn)一步對雄花茶的護(hù)綠工藝和干燥工藝等進(jìn)行了研究[15,17]。有關(guān)杜仲雄花茶多糖及其生理活性研究鮮見報(bào)道。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了杜仲雄花茶多糖的提取工藝,并對其抗氧化活性進(jìn)行了評價(jià),為杜仲雄花的綜合利用及新產(chǎn)品的開發(fā)提供了基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲雄花于2013年3月中下旬(初花期)采自西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院校區(qū)杜仲樹林。在雄株花蕾形成后及時(shí)采收,避免花粉散落。按照文獻(xiàn)方法制成杜仲雄花茶[15,17]。粉碎過20目篩成杜仲雄花茶粉末,冷藏備用。

DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 美國Sigma公司；Folin-Ciocalteu’s reagent(2N) 上海荔達(dá)生物技術(shù)有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；鐵氰化鉀、磷酸、三氯乙酸、FeSO4、硫代巴比妥酸、乙醇等 均為分析純。

UV-1800紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；AG204分析天平 METTLER TOLEDO；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；101A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TGL-16離心機(jī) 湘潭湘儀儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲雄花茶多糖提取 取50℃下烘干至恒重的杜仲雄花茶粉末300g,用95%乙醇-水溶液浸提24h脫脂和除去低聚糖,真空抽濾,濾渣于低溫下(30℃)真空烘至恒重。取2g濾渣,按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定的量加入蒸餾水,以設(shè)定的提取條件浸提,用水提醇沉法得到杜仲雄花茶多糖。將多糖用丙酮洗3次脫色,得灰白色的杜仲雄花多糖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取葡萄糖對照品配制成1mg/mL的水溶液。分別將對照品溶液稀釋成0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。于標(biāo)準(zhǔn)液中加入DNS試劑[18],充分混勻,90℃水浴中顯色10min,流水冷卻,在490nm測吸光度。以濃度為因變量,吸光度為自變量計(jì)算得回歸方程:

C=1.0183A-0.0109(R2=0.9931),其中,A為吸光度,C為樣品中葡萄糖的質(zhì)量濃度。

1.2.3 多糖水解 按照文獻(xiàn)方法[18],取提取的多糖,熱水溶解,加入5mL的HCl(6mol/L),沸水浴加熱15min,冷卻后用NaOH(6mol/L)調(diào)pH至中性。

1.2.4 多糖的含量測定 分別取多糖水溶液和多糖水解溶液2mL,各加入2mL DNS試劑和1mL蒸餾水,以2mL DNS試劑中加入3mL蒸餾水為對照,在90℃水浴中顯色10min,測定樣品還原性單糖量(a)和總糖量(b),用總糖含量減去還原性單糖量表示多糖量。多糖的含量計(jì)算公式為:

1.2.5 多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn) 分別以液料比、提取時(shí)間、提取溫度為單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素對杜仲雄花茶多糖提取率的影響。在提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)中,提取時(shí)間為4h,液料比為15∶1,溫度分別設(shè)置為50、60、70、80、90、100℃。在提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)中,提取溫度為90℃,液料比為15∶1,時(shí)間分別設(shè)置為1、2、3、4、5、6h。在料液比單因素實(shí)驗(yàn)中,提取時(shí)間為4h,提取溫度為90℃,液料比分別設(shè)置為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化多糖提取工藝 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以多糖提取得率為響應(yīng)值,采用Design Expert軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案,優(yōu)化杜仲雄花茶多糖提取工藝。實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in the response surface analysis

1.2.7 杜仲雄花茶多糖的抗氧化活性評價(jià)

1.2.7.1 DPPH自由基清除活性測定 采用Sun等[19]的方法。取杜仲雄花茶多糖配制成不同質(zhì)量濃度的溶液,加入2mL 2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液,混勻。室溫避光放置30min,517nm波長處測定吸光度(A),以2mL水代替多糖溶液為對照。清除率的計(jì)算公式為:

式中:A0為對照溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.2.7.2 羥自由基清除活性測定 采用Takeshi 等[20]的方法。將300μL的FeSO4(10mmol/L)、300μL的EDTA(10mmol/L)和300μL的2-Deoxyribose(10mmol/L)與1.5mL 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)混合均勻,分別與不同質(zhì)量濃度杜仲雄花茶多糖溶液混合,加入300μL的H2O2(10mmol/L),在37℃下培養(yǎng)4h。再加入1mL硫代巴比妥酸溶液(10g/L),混勻后在沸水浴中培養(yǎng)10min。冷卻至室溫后,于3000r/min離心5min,取上清,在532nm處測吸光度。對照以蒸餾水代替多糖樣品。清除率計(jì)算公式為:

式中:A0為對照溶液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.2.7.3 還原力測定 采用Ryszard[21]的方法。取多糖樣品溶液,加入2.5mL0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2.5mL鐵氰化鉀溶液(10g/L),50℃水浴中放置20min。迅速冷卻后,加入2.5mL三氯乙酸溶液(100g/L),混勻,于3000r/min離心20min。取2.5mL上清液,加入2.5mL蒸餾水和0.5mL三氯化鐵(1g/L),反應(yīng)10min,于700nm測吸光度。對照以蒸餾水代替杜仲雄花茶多糖樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲雄花茶多糖提取工藝單因素考察

2.1.1 提取溫度對多糖提取得率的影響 提取溫度對多糖提取得率的影響結(jié)果見圖1。隨著提取溫度的升高,杜仲雄花茶多糖得率逐漸增大,60～80℃時(shí),多糖得率急劇增加,80℃時(shí)多糖得率增加為60℃時(shí)的2.15倍；90℃時(shí),多糖得率比80℃提高了0.1%,而90～100℃之間,多糖得率基本不變。故90℃左右為杜仲雄花茶多糖提取的適宜溫度。

圖1 提取溫度對杜仲雄花茶得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from E. male flower

2.1.2 提取時(shí)間對多糖得率的影響 提取時(shí)間對多糖提取得率的影響結(jié)果見圖2。隨著提取時(shí)間的增加,杜仲雄花茶多糖得率逐漸增加。當(dāng)提取時(shí)間在4～5h時(shí),多糖得率已接近6h時(shí)的3.76%。考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本,選4h為多糖的提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對杜仲雄花茶多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from E. male flower

2.1.3 液料比對多糖得率的影響 液料比對多糖提取得率的影響結(jié)果見圖3。隨著液料比的提高,杜仲雄花茶多糖得率提高,液料比為10∶1～20∶1時(shí),杜仲雄花茶多糖提取得率由3.21%到3.67%逐漸增大,液料比為25∶1時(shí)提取得率已不再增加,考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本,選15∶1為多糖的提取液料比。

圖3 液料比對杜仲雄花茶多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction yield of polysaccharides from E. male flower

2.2 提取工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

在提取溫度、提取時(shí)間和液料比的不同組合條件下提取,計(jì)算多糖得率,見表2。

對表2數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件處理和分析,獲得杜仲雄花茶多糖提取率對提取溫度、時(shí)間和液料比的二次多元回歸方程:Y=3.53-0.07X1+0.26X2+0.19X3+0.10X1X2+0.04X1X3-0.01X2X3-0.31X12-0.30X22-0.10X32對方程的各項(xiàng)回歸系數(shù)及顯著性進(jìn)行檢驗(yàn),見表3。

表2 杜仲雄花茶多糖提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 3 The regression coefficient and significance of each term in the fitted regression model

根據(jù)回歸方程得響應(yīng)面圖(圖4),觀察擬合響應(yīng)面的形狀,分析提取溫度、時(shí)間和液料比對多糖得率的影響。多糖得率隨提取溫度的提高和提取時(shí)間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,提取溫度和提取時(shí)間的等高線形狀趨于圓形,表明其交互作用不大(圖4)。多糖得率隨提取溫度和液料比的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,提取溫度和液料比的等高線形狀趨于橢圓形,表明其交互作用顯著；液料比軸向等高線變化密集,溫度軸向等高線變化相對稀疏,故溫度對響應(yīng)值的影響較液料比大(圖4)。多糖得率隨提取時(shí)間和液料比的提高也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,提取時(shí)間和液料比的等高線形狀趨于橢圓形,表明其交互作用顯著,且液料比軸向等高線變化相對密集,提取時(shí)間等高線變化相對稀疏,故提取時(shí)間對響應(yīng)值的影響較液料比大(圖4)。提取溫度、時(shí)間和液料比的增大均可提高多糖提取得率,但溫度過高或時(shí)間過長均會(huì)增加多糖降解,溶劑用量的增大使得后續(xù)的濃縮量和生產(chǎn)成本加大。因此,選擇適當(dāng)?shù)奶崛l件有助于提高多糖的提取效率。

圖4 各因素交互影響杜仲雄花茶多糖提取得率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface for the effect of crossinteraction among factors on the yield of crude polysaccharides from E. male flower

2.3 杜仲雄花茶多糖提取條件的驗(yàn)證

由模型方程計(jì)算可得,在提取溫度為88.89℃、提取時(shí)間為4.45h、液料比為15.02∶1時(shí),杜仲雄花茶多糖理論最大理論得率為3.58%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作優(yōu)化條件為提取溫度90℃、提取時(shí)間4.5h和液料比為15∶1時(shí),杜仲雄花茶多糖平均提取得率為3.48%,與模型方程預(yù)測值的誤差為2.9%,說明得到的提取參數(shù)可靠。

2.4 杜仲雄花茶多糖抗氧化活性評價(jià)

2.4.1 對DPPH·的清除作用 杜仲雄花茶多糖對DPPH·有一定的清除作用(圖5),量效關(guān)系顯著,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著杜仲雄花茶多糖濃度的增加,對DPPH·清除率顯著增加。當(dāng)質(zhì)量濃度在0.2～0.6mg/mL時(shí),對DPPH·清除率隨著質(zhì)量濃度的增加快速增加；當(dāng)質(zhì)量濃度在0.8～1mg/mL時(shí),隨著質(zhì)量濃度增加,多糖對DPPH·清除率增加緩慢；該多糖的IC50值為0.814mg/mL;以合成的抗氧化劑BHT為對照,當(dāng)質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí),杜仲雄花茶多糖對DPPH·的清除率可達(dá)到52.5%。

圖5 杜仲雄花茶多糖和BHT對DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effect of polysaccharides from E. male flower and BHT on DPPH·

2.4.2 對·OH的清除作用 在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)杜仲雄花茶多糖和BHT對·OH的清除率隨其質(zhì)量濃度的升高而上升(圖6)。多糖質(zhì)量濃度低于0.4mg/mL時(shí),對·OH的清除率較低；而質(zhì)量濃度增加到0.8mg/mL時(shí),清除率上升至59%；在質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí),對·OH的清除率為可達(dá)到63.1%;多糖對·OH清除的IC50值為0.725mg/mL。

圖6 杜仲雄花茶多糖和BHT對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide from E. male flower and BHT on ·OH

2.4.3 杜仲雄花茶多糖還原力 植物提取物還原力的大小與其抗氧化能力有關(guān),還原力已成為衡量物質(zhì)抗氧化活性的重要指標(biāo)之一。杜仲雄花茶多糖表現(xiàn)較好的還原力(圖7),隨著質(zhì)量濃度的增加,量效關(guān)系顯著。當(dāng)質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí),杜仲雄花茶多糖的還原力可達(dá)到BHT的72.73%。

圖7 杜仲雄花茶多糖和BHT的還原力Fig.7 Reducing power of polysaccharide from E. male flower and BHT

3 結(jié)論

利用Design Expert 8.0設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),采用響應(yīng)面法優(yōu)化了杜仲雄花茶多糖的提取工藝。杜仲雄花茶多糖提取的工藝為:提取溫度90℃、提取時(shí)間4.5h、液料比15∶1,在此條件下多糖提取得率可達(dá)到3.48%。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以BHT作為標(biāo)準(zhǔn),1mg/mL杜仲雄花茶多糖對DPPH·清除率為52.5%,對·OH的清除率為63.1%,還原力為72.73%。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),杜仲雄花茶多糖抗氧化能力隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng),呈現(xiàn)出量效關(guān)系。說明杜仲雄花茶具有一定的抗氧化效果。

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Study on the optimization of extracting polysaccharidesfromEucommiamale flowers tea byresponse surface methodology and the antioxidant evaluation

ZHU Li-rong1,WU Ping-ping2,YANG Da-wei3,DONG Juan-e1,*

(1.College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling 712100,China；2.Investigation and Planning Institute of Shanxi Forestry,Taiyuan 030012,China；3.Pingli Guxianhu ecological breeding Co.,Ltd.,Pingli 725500,China)

The optimum extraction process of polysaccharides fromEucommiamale flowers tea and its antioxidant activity were explored. The process was designed by Design Expert 8.0,and the extraction conditions were optimized by response surface methodology(RSM).The antioxidant activities were examined from the aspects of scavenging rate of DPPH and hydroxyl free radicals,reducing power,respectively. The results indicated that the optimum extraction conditions were:extraction temperature 90℃,extraction time 4.5h,ratio of solvent to material 15∶1. Under these conditions,the yield of polysaccharides had 3.48%.Compared with BHT,the rate of scavenging DPPH radicals was 52.5%,the reducing power reached to 72.73%,and the rate of scavenging hydroxyl radical was 63.1% when theEucommiamale flower polysaccharide concentration was 1mg/mL. The above results indicated that theEucommiamale flower polysaccharides had antioxidant effectsinvitro.

Eucommia;polysaccharides;antioxidant;extraction;RSM

2014-05-15

朱麗蓉(1990-)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離與開發(fā)利用。

*通訊作者:董娟娥(1968-)，女，博士，教授，主要從事藥用植物學(xué)和天然產(chǎn)物開發(fā)利用的教學(xué)和研究工作。

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)重大項(xiàng)目(201204603)；工信部萬畝中藥材基地建設(shè)項(xiàng)目(萬畝杜仲林建設(shè))。

TS272.5

B

1002-0306(2015)03-0199-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.033