高核糖核酸啤酒酵母菌QH633菌體制備工藝優(yōu)化

張子健,江建梅,舒 媛,吳 振

(唐山拓普生物科技有限公司,唐山市生物工程技術(shù)研究中心,河北唐山 063000)

高核糖核酸啤酒酵母菌QH633菌體制備工藝優(yōu)化

張子健,江建梅,舒 媛,吳 振

(唐山拓普生物科技有限公司,唐山市生物工程技術(shù)研究中心,河北唐山 063000)

本文主要通過在搖床發(fā)酵條件下對啤酒酵母菌QH633的接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間進行單因素實驗,優(yōu)選最適參數(shù)范圍,再通過響應面分析法對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為:發(fā)酵溫度28℃,接種量10.50%,轉(zhuǎn)速為203r/min,發(fā)酵時間16.5h,在此條件下,QH633的RNA含量為12.66%,與理論預測值基本符合,與初始發(fā)酵條件時的9.38%相比,增加了34.97%。

高核糖核酸酵母,工藝優(yōu)化,響應面分析法,RNA含量

高呈味核苷酸酵母抽提物(Yeast Extract,簡稱YE),由于其低鹽、純天然、呈味性能優(yōu)良等特點,逐漸被食品調(diào)味行業(yè)所青睞[1-2],該產(chǎn)品的制備要求原料具有較高的核糖核酸(RNA)含量。因此,如何提高酵母細胞中的RNA含量成為酵母深加工行業(yè)研究的熱門。

近些年來,國內(nèi)外專家學者對提高酵母菌體的RNA含量做了很多研究,也取得了一定的進展[3-8],但是由于其研究目的大多以RNA提取為主,專門針對高呈味核苷酸YE開發(fā)的研究較少；且研究內(nèi)容主要集中在產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母等,這些菌株雖然RNA含量較高,但是并非對人體和動物完全無毒副作用[9-12],而啤酒酵母,屬于釀酒酵母屬,被廣泛認為是安全無公害的。本文主要針對高核糖核苷酸啤酒酵母的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,旨在為酵母的深加工提供可行性依據(jù),為啤酒酵母的綜合利用及新產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:QH633(經(jīng)由唐山拓普生物科技有限公司誘變選育而得)。

材料:硫酸銨、葡萄糖、氯化鈉,磷酸二氫鉀、鹽酸、高氯酸,氯仿(均為分析純)；酵母抽提物(唐山拓普生物科技有限公司自主生產(chǎn))。

儀器:高壓蒸汽滅菌鍋BXM-30R 上海博訊；潔凈工作臺 上海博訊；高速冷凍離心機 賽默飛；全溫振蕩培養(yǎng)箱 榮華RH-Q；數(shù)顯恒溫水浴鍋 金怡HH-8；數(shù)顯鼓風干燥箱 嘉程GC101；紫外可見分光光度計 尤尼柯UV-2102C；電子天平；旋渦混合器。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 經(jīng)前期正交實驗,確定培養(yǎng)基的最佳配方為:葡萄糖2%,硫酸銨2.50%,酵母浸膏0.50%,磷酸二氫鉀0.15%,氯化鈉1.0%,pH5.0。

1.2.2 菌體制備工藝中參數(shù)的優(yōu)化

1.2.2.1 接種量優(yōu)化 按照接種量為5%、10%、15%、20%對QH633進行接種,在28℃下,150r/min振蕩培養(yǎng)22h后,測定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最適接種量。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度優(yōu)化 選取15、20、25、30℃四個不同的溫度,以1.2.2.1所得的最適接種量接種,150r/min振蕩培養(yǎng)22h,測定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最適溫度。

1.2.2.3 發(fā)酵轉(zhuǎn)速優(yōu)化 在最適接種量、最適溫度下,轉(zhuǎn)速分別設為100、150、200、250r/min,振蕩培養(yǎng)22h,測定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

1.2.2.4 發(fā)酵時間優(yōu)化 在最適接種量、最適溫度和最適轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)12、14、16、18、20、22h測定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最佳發(fā)酵時間。

1.2.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗中挑選最適范圍,通過響應面分析法對QH633的培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化,以RNA含量為測定指標,確定QH633的最佳培養(yǎng)工藝。

表1 Box-Behnken因素水平編碼表Table 1 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 啤酒酵母RNA含量和核酸總量測定方法 使用高氯酸法[9],經(jīng)過改良。將發(fā)酵好的酵母菌離心,稀釋至3mL,并測定其固形物含量w,稱取1.000±0.002g菌懸液到大試管中,加入10%的高氯酸5mL,置于100℃的水浴鍋中加熱30min,然后置于冰水中冷卻,以10000r/min離心20min。取上層的清液2mL,加入400μL氯仿,劇烈震蕩2min,10000r/min離心10min,吸取1mL上清液,加入到經(jīng)高溫滅菌的無菌水試管中稀釋至10-2梯度,旋渦混勻,以10%高氯酸為空白,在260nm下測核酸的吸光度。

酵母RNA含量(%)=(OD260/0.024×上清液體積×6)/(m×w)×100

核酸總量(mg/100mL)=(OD260/0.024×上清液體積×6×3)/1000

式中:0.024是濃度為1μg/mL的RNA溶液的OD值。

1.2.3.2 菌數(shù)的測定方法 將酵母懸液在600nm下測定吸光度值,OD600nm可反映菌株生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每次實驗重復三次,單因素實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理,響應面實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件進行回歸和方差分析。p<0.05為差異顯著,p<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量

由圖1可知,QH633的RNA含量先隨接種量的提高而增加,接種量為10%時,QH633的RNA含量達到最大值,為10.07%,隨接種量繼續(xù)提高,RNA含量反而降低,接種量20%時RNA含量僅為8.73%。此外,接種量為10%時,QH633菌數(shù)較為適中,發(fā)酵液的核酸總量較高,為8.49mg/100mL,因此,接種量控制在10%進行接種發(fā)酵,其效果最佳。

圖1 QH633接種量優(yōu)化Fig.1 Inoculation quantity optimization for QH633

2.2 溫度

由圖2可知,在15℃和20℃時進行發(fā)酵,QH633的RNA含量分別為10.42%和11.15%,但是其菌體濃度太低,核酸總量僅為1.95mg/100mL和2.79mg/100mL,不利于工業(yè)上的應用生產(chǎn)；25℃進行發(fā)酵時,菌體RNA含量達到10.27%,菌體量增加明顯,核酸總量較高,為8.63mg/100mL；而30℃時的QH633的RNA含量僅為8.72%,這有可能是因為溫度為30℃時,酵母細胞衰老加速,開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[10]。因此,25℃為最佳的發(fā)酵溫度。但是,由于在工業(yè)生產(chǎn)中普遍采用28℃和30℃作為酵母菌發(fā)酵的溫度,本研究中28℃時的RNA含量為10.07%(見2.1),更為接近最佳溫度,為更好地為工業(yè)化生產(chǎn)服務,本文不再對溫度進行優(yōu)化,均采用28℃為最適發(fā)酵溫度。

圖2 QH633溫度優(yōu)化Fig.2 Temperature optimization for QH633

2.3 轉(zhuǎn)速

由圖3可知,QH633的RNA含量先隨轉(zhuǎn)速的提高而增加,轉(zhuǎn)速控制在200r/min時,QH633的RNA含量最高,為10.80%,這是由于轉(zhuǎn)速提升使得搖瓶中的溶氧量增加,菌體分裂增殖迅速,且可以避免產(chǎn)生對酵母生長不利的乙醇。從而促進了菌體中RNA的合成,而轉(zhuǎn)速為250r/min時,RNA含量降為10.16%,這有可能是因為轉(zhuǎn)速過大,菌體間碰撞過于劇烈,導致細胞破損,RNA含量降低[7]。此外,轉(zhuǎn)速控制在200r/min時,QH633菌數(shù)較為適中,核酸總量較高,為8.92mg/100mL,因此200r/min為發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速。

圖3 QH633轉(zhuǎn)速優(yōu)化Fig.3 Rotation rate optimization for QH633

2.4 時間

由圖4可知,隨著發(fā)酵時間的增加,QH633的RNA含量也逐漸增加,發(fā)酵16h時,QH633的RNA含量最高,為12.11%,隨著發(fā)酵不斷進行,RNA含量不斷降低,到22h時,RNA含量降為10.72%。這可能是由于在對數(shù)生長期菌體進行有絲分裂,RNA成雙倍出現(xiàn)在單個細胞中,此時的RNA含量最高,隨后細胞分裂,菌體數(shù)量增加,RNA含量則因分母的增加而降低,因此,發(fā)酵時間應嚴格控制在菌體對數(shù)生長期內(nèi)[13]。此外,發(fā)酵16h時,QH633菌數(shù)較為適中,核酸總量較高,為8.15mg/100mL,因此16h為發(fā)酵的最佳時間。

圖4 QH633時間優(yōu)化Fig.4 Time optimization for QH633

2.5 響應面分析

參照文獻[14-15],利用Design Expert 8.0軟件,采用中心組合實驗Box-Behnken設計方案,進行3因素3水平的響應曲面工藝優(yōu)化實驗,因素水平編碼表見表1。實驗共設17個實驗點,包括12個析因點和5個中心點,結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,經(jīng)回歸擬合后,各因素與響應值的回歸方程為:

Y=12.53+0.18A+0.087B+0.49C-0.21AB-0.10AC+0.060BC-0.78A2-0.61B2-1.99C2

其中：Y-RNA含量(%)；A-接種量(%)；B-轉(zhuǎn)速(r/min)；C-時間(h)。

表2 Box-Behnken設計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 方差分析表Table 3 ANOVA analysis for regression equation

根據(jù)方差分析和回歸方程,得到三維響應曲面圖(圖5～7)。考察所擬合的響應曲面的形狀,分析接種量、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間對RNA含量的影響。

通過模型預測,QH633菌體富集RNA的最優(yōu)工藝為:接種量為10.50%,轉(zhuǎn)速203r/min,發(fā)酵時間16.5h,RNA含量預測值為12.57%。用優(yōu)化后的條件進行了三次驗證性實驗,以保證預測值不偏離實際值,RNA含量平均為12.66%,實驗值與預測值吻合良好,這表明模型能較好的預測實際RNA含量。

圖5 轉(zhuǎn)速和接種量對RNA含量影響的響應曲線Fig.5 Response curve of rotation rate and inoculation quantity on the content of RNA

圖6 時間和接種量對RNA含量影響的響應曲線Fig.6 Response curve of time and inoculation quantity on the content of RNA

圖7 時間和轉(zhuǎn)速對RNA含量影響的響應曲線Fig.7 Response curve of time and rotation rate on the content of RNA

3 結(jié)論

通過單因素實驗和Box-Behnken中心組合設計

原理以及響應面分析法對啤酒酵母的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,擬合了接種量、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間這3個因素對RNA含量的回歸模型,經(jīng)檢驗證明該模型合理可靠,能較好的預測啤酒酵母的RNA含量,由該模型確定的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度28℃,接種量10.5%、轉(zhuǎn)速203r/min、發(fā)酵時間16.5h。通過模型系數(shù)顯著性檢驗,得到的因素主效應關系為發(fā)酵時間>接種量>轉(zhuǎn)速。經(jīng)三次驗證實驗,RNA含量可達12.66%,相較初始發(fā)酵條件下的RNA含量9.38%,增加了34.97%。

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Optimization of cell preparation technology forhigh RNA content Beer Yeast QH633

ZHANG Zi-jian,JIANG Jian-mei,SHU Yuan,WU Zhen

(Tangshan TOP Bio-technology co.,ltd.,Tangshan Engineering Research Centre for Biological,Tangshan 063000,China)

In this paper,we studied the inoculation quantity,the fermentation temperature,the rotation rate and the fermentation time,as the single factor for QH633 fermentation experiment in shaking flask fermentation conditions. Then we selected the optimal parameters,and optimizated the fermentation process through the response surface analysis. The optimal fermentation conditions as follows:fermentation temperature 28℃,inoculation quantity 10.50%(v/v),revolution speed 203r/min,fermentation time 16.5h. Under this condition,the RNA content of QH633 was 12.66%,consistented with the predicted value,and compared with 9.38% of the initial fermentation conditions,increased by 34.97%.

high RNA content yeast;process optimization;response surface analysis;RNA content

2014-05-27

張子健(1984-)，女，碩士，工程師，研究方向：食品微生物。

國家國際科技合作專項項目(2012DFA30390)資助。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0178-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.028