金黃色葡萄球菌五種腸毒素基因PCRDHPLC檢測方法的建立

陳 彬,王 穎,鄭 晶,黃曉蓉,林 杰,彭華毅,邵碧英,*

(1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,福建福州 350001；2.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350001；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

陳 彬1,2,王 穎1,3,鄭 晶1,2,黃曉蓉1,2,林 杰1,2,彭華毅1,2,邵碧英1,2,*

(1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,福建福州 350001；2.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350001；3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

本文設(shè)計(jì)合成了5種腸毒素基因的特異性引物,對PCR的退火溫度、DNA模板量進(jìn)行優(yōu)化,建立了5種腸毒素基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性高效液相色譜(PCR-DHPLC)檢測方法,并測定方法的靈敏度和特異性。結(jié)果表明建立的PCR-DHPLC檢測方法的特異性很好,靈敏度可達(dá)到100cfu/mL。PCR-DHPLC方法具有快速、準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn),在進(jìn)出口食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測上有很好的應(yīng)用價(jià)值。

金黃色葡萄球菌,腸毒素,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),變性高效液相色譜(DHPLC)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是葡萄球菌屬的一種,在自然界中廣泛存在,主要存在于人和動物的鼻腔、咽喉及頭發(fā),有30%～80%的人群攜帶該病原菌[1-3],由其產(chǎn)生的腸毒素可通過污染食品而導(dǎo)致食物中毒。因此,該菌也是進(jìn)出口食品中要求檢測的常見的微生物項(xiàng)目。傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌腸毒素基因型有5種,分別是SEA、SEB、SEC、SED和SEE[4]。人在進(jìn)食攜帶該腸毒素污染的食物1～5h,會出現(xiàn)急性腸胃炎的癥狀,表現(xiàn)為惡心、嘔吐和腹瀉等。近年來,在中國發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒病例中,由金黃色葡萄球菌引起的中毒事件占20%～25%,名列第四位[5-6],國際上已將葡萄球菌腸毒素的檢測列入食品檢驗(yàn)法規(guī)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)具有快速、靈敏等特點(diǎn),在葡萄球菌腸毒素基因的檢測上已有報(bào)道,但多采用凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物,步驟繁瑣,易造成污染。變性高效液相色譜(DHPLC)是一種新型高通量篩選DNA序列的新技術(shù),可用于PCR產(chǎn)物的快速分析。DHPLC具有全自動、高通量的特點(diǎn),一次可同時(shí)分析數(shù)百個樣本。Franciosa等[7]、Hurtle等[8]與曹際娟等[9]均報(bào)道了利用DHPLC技術(shù)對細(xì)菌進(jìn)行檢測的研究,

但尚未見將DHPLC技術(shù)應(yīng)用于葡萄球菌腸毒素檢測的報(bào)道。本文選取金黃色葡萄球菌5種腸毒素基因,擬建立5種腸毒素基因的PCR-DHPLC檢測方法,為進(jìn)出口食品中金黃色葡萄球菌腸毒素的快速、高通量檢測提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株共5株,分別是金黃色葡萄球菌產(chǎn)SEA菌(ICQQ22024)、金黃色葡萄球菌產(chǎn)SEC菌(ICQQ22028)、金黃色葡萄球菌產(chǎn)SED菌(ICQQ22003),中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；金黃色葡萄球菌產(chǎn)SEB菌(F0137)和金黃色葡萄球菌產(chǎn)SEE菌(T43),本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與設(shè)備

dNTP、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker Ⅰ、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；TEAA、DNA標(biāo)樣 北京市表觀生物技術(shù)有限公司；變性高效液相色譜儀 美國Transgenomic公司。

1.3 引物

根據(jù)基因序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)中收錄的5種葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)基因和特異基因femA的序列,并在美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)上進(jìn)行序列比對后篩選各自的特異性擴(kuò)增片段,利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物,委托上海生工公司合成以下引物(表1)。引物用TE溶液(pH8.0)稀釋至濃度為10μmol/L,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)菌DNA的提取

各取5株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉,分別溶解于7.5% 氯化鈉肉湯中,于(36±1)℃培養(yǎng)18～24h,將培養(yǎng)物劃線接種到Baird-Parker平板,(36±1)℃培養(yǎng)18～24h。挑取平板上典型單菌落接種到5mL BHI培養(yǎng)液中,在臺式恒溫振蕩器(36±1)℃振蕩培養(yǎng)12h。取50株非金黃色葡萄球菌的甘油保存液100μL,接種于4mL營養(yǎng)肉湯,(36±1)℃培養(yǎng)18～24h。各取1mL菌懸液,按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取DNA,經(jīng)10倍稀釋后,于核酸蛋白儀上測定濃度和純度,并用TE溶液(pH8.0)稀釋至50ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR反應(yīng)條件中退火溫度的優(yōu)化

通常情況下,退火溫度為引物Tm值減5℃,也即55℃,表1所列的六對引物的Tm值平均在60℃,而且Taq DNA 聚合酶在50℃時(shí)效率最高,因此,選擇在55℃上下范圍內(nèi),進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化。以常用的反應(yīng)體系為基礎(chǔ),使用梯度PCR儀對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系:2×Taq PCR MasterMix 10μL,引物各0.5μL,DNA模板50ng,ddH2O 補(bǔ)至20μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s,51～58℃退火40s,72℃延伸1min,35個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后,取10μL PCR產(chǎn)物,經(jīng)20mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測,選出最佳退火溫度。

1.6 PCR反應(yīng)體系中DNA模板量的優(yōu)化

以常用的反應(yīng)體系為基礎(chǔ),將模板DNA量分別設(shè)置為0、10、20、30、40、50、60、70ng共8個濃度梯度,用1.5中優(yōu)化好的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后,取10μL PCR產(chǎn)物電泳、成像拍照,篩選出最合適的模板DNA用量。

1.7 PCR-DHPLC檢測方法的建立

PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件同1.5,取優(yōu)化后的退火溫度與DNA模板量,參照1.5中的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測。洗脫液由緩沖液A(0.1mol/L的TEAA,加250μL乙腈)及緩沖液B(0.1mol/L的TEAA,含25%的乙腈)組成,以0.9mL/min的流速在50℃柱溫下自動洗脫DNA分子,跑樣時(shí)間是20min,以標(biāo)準(zhǔn)分子量為參照,根據(jù)峰對應(yīng)的堿基對大小判斷PCR產(chǎn)物是否正確。

1.8 PCR-DHPLC檢測方法的特異性測定

取50株非金黃色葡萄球菌的甘油保存液100μL,接種于4mL營養(yǎng)肉湯,36±1℃培養(yǎng)18～24h。各取1mL菌懸液,按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取DNA。以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA作為陽性對照,以ddH2O作為空白對照,用建立的PCR-DHPLC方法檢測50株非金黃色葡萄球菌的腸毒素基因,以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.9 PCR-DHPLC檢測方法的靈敏度測定

接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株于BHI培養(yǎng)液中,(36±1)℃搖床培養(yǎng)12h,將培養(yǎng)后菌懸液分別進(jìn)行10倍系列稀釋,選擇合適的稀釋度,各吸取1mL稀釋液于菌落計(jì)數(shù)片中經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。同時(shí),各取1mL稀釋液,用試劑盒法提取DNA。DNA提取完畢,分別取2μL DNA模板按照上述確定的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測。

1.10 PCR-DHPLC檢測方法的實(shí)際應(yīng)用

將建立的PCR-DHPLC檢測方法用于本實(shí)驗(yàn)室近年來從食品樣品中分離到的金黃色葡萄球菌的檢測。吸取甘油保存的菌液50μL于BHI培養(yǎng)液,36±1℃搖床培養(yǎng)12h。吸取1mL菌懸液,12000r/min離心2min,棄上清。若沉淀太少,再取1mL菌懸液進(jìn)行離心操作。用試劑盒法提取DNA,進(jìn)行PCR-DHPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 5對引物PCR退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

圖1 5對引物PCR擴(kuò)增退火溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimization results of annealing temperature of five primers in PCR procedure注：M.DNA Marker I；A. SEA基因；B. SEB基因； C. SEC基因；D. SED基因；E. SEE基因； 1～8. 退火溫度分別為51、52、53、54、55、56、57、58℃。

分別對合成擴(kuò)增5種腸毒素基因的5對引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,共選取了8個溫度,結(jié)果如圖1所示。隨著退火溫度的逐步升高,不同的引物目的條帶的亮度變化不同。對于SEA基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度稍有增強(qiáng)；對于SEB基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度稍有減弱；對于SEC基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度稍有增強(qiáng),但在51～54℃時(shí),有雜帶的出現(xiàn),而從55℃開始不再有雜帶；對于SED基因,隨著溫度的升高,目的條帶亮度差異不明顯；對于SEE基因,隨著溫度的升高,目的條帶的亮度稍有減弱趨勢。綜合考慮到既能保證各對引物都得到較好的擴(kuò)增,又減少非特異條帶的產(chǎn)生,選取55℃為適宜的退火溫度。

2.2 DNA模板用量的優(yōu)化結(jié)果

對DNA模板用量進(jìn)行優(yōu)化,電泳結(jié)果如圖2所示。隨著DNA模板用量的逐漸增加,5對引物的目的條帶的亮度變化程度相差不大。當(dāng)DNA模板量為0時(shí),沒有出現(xiàn)任何條帶,與預(yù)期結(jié)果相符；當(dāng)DNA模板量從10ng到70ng逐漸增加時(shí),預(yù)期目條帶的亮度逐漸變亮,但整體上條帶變亮的趨勢并不明顯。因此,從10ng到70ng均可作為合適的DNA模板用量。既能保證PCR有效擴(kuò)增,又能節(jié)約DNA模板,因此選取居中的50ng為適宜的DNA模板用量。

圖2 DNA模板用量的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 The optimization results of DNA amount注：M.DNA Marker I；A.SEA基因；B.SEB基因； C.SEC基因；D.SED基因；E.SEE基因； 1～8.DNA模板的量分別為0、10、20、30、40、50、60、70ng。

表2 PCR-DHPLC檢測法特異性測定結(jié)果Table 2 The specific detection results of PCR-DHPLC method

注:“-”-無吸收峰出現(xiàn)。2.3 5種腸毒素基因的PCR-DHPLC檢測結(jié)果

本文除了5型腸毒素基因外,還增加了金黃色葡萄球菌特有的femA基因,以檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌DNA的提取效果、并避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。將femA基因和5種腸毒素基因分別進(jìn)行PCR-DHPLC法檢測,圖譜的橫坐標(biāo)表示出峰時(shí)間(min),各PCR產(chǎn)物均為單一峰,且堿基數(shù)多的出峰時(shí)間長,出峰位置與預(yù)期的吻合(圖3)。金黃色葡萄球菌特異基因femA基因峰(132bp)位于102bp峰和174bp峰之間,靠近102bp峰；產(chǎn)SEA標(biāo)準(zhǔn)菌株陽性峰(218bp)基本位于174bp峰和257bp峰的中間；產(chǎn)SEB標(biāo)準(zhǔn)菌株陽性峰(477bp)位于458bp峰和582bp峰之間,靠近458bp峰；產(chǎn)SEC標(biāo)準(zhǔn)菌株陽性峰(282bp)基本位于267bp峰和298bp峰之間；產(chǎn)SED標(biāo)準(zhǔn)菌株陽性峰(330bp)基本位于298bp峰和434bp峰之間,靠近298bp峰；產(chǎn)SEE標(biāo)準(zhǔn)菌株陽性峰(400bp)基本位于298bp峰和434bp峰之間,靠近434bp峰(圖8)。檢測結(jié)果表明經(jīng)優(yōu)化后建立的PCR-DHPLC檢測方法不僅適用于5種腸毒素基因,也適用于金黃色葡萄球菌特有的femA基因。

圖3 5種葡萄球菌腸毒素基因 及femA基因PCR-DHPLC檢測結(jié)果Fig.3 The PCR-DHPLC results of five enterotoxins genes and femA gene注1.Wave DNA sizing control(80、102、 174、257、267、298、434、458和587bp)； 2. SEA；3. SEB；4. SEC；5. SED；6. SEE；7.femA基因。

2.4 PCR-DHPLC法的特異性測定結(jié)果

用建立的PCR-DHPLC法檢測本實(shí)驗(yàn)室保存的50株非金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株的特異性檢測結(jié)果見表2,測定的結(jié)果只有金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)預(yù)期峰,而非目標(biāo)菌株均未出現(xiàn)任何峰。以大腸埃希氏菌、沙門氏菌測定結(jié)果為例如圖4,只有金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的條帶,而大腸埃希氏菌、沙門氏菌菌株以及ddH2O均沒有出現(xiàn)任何條帶。測定結(jié)果表明建立的PCR-DHPLC方法的特異性很好。

圖4 特異性實(shí)驗(yàn)DHPLC觀察結(jié)果Fig.4 The specific experimental DHPLC results注:1.Wave DNA sizing control(80、102、174、 257、267、298、434、458、587bp)； 2.金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；3.ddH2O； 4.大腸埃希氏菌(ATCC 25922)；5.沙門氏菌(ATCC 13076)。

2.5 PCR-DHPLC法的靈敏度測定結(jié)果

5種葡萄球菌腸毒素PCR-DHPLC檢測靈敏度的測定結(jié)果如圖4所示。隨著菌含量的逐漸減少,DHPLC檢測結(jié)果顯示的特異峰面積越來越小。SEA最低能檢測到53cfu/mL,SEB能檢測到36cfu/mL,SEC能檢測到45cfu/mL,SED能檢測到32cfu/mL,SEE能檢測到41cfu/mL。即對于5種腸毒素基因,PCR-DHPLC的靈敏度均可達(dá)到100cfu/mL。

圖5 5種腸毒素基因PCR-DHPLC 檢測方法的靈敏度測定結(jié)果Fig.5 The sensitivity detection results of PCR-DHPLC method of five enterotoxins genes注：A. SEA；B. SEB；C. SEC；D. SED；E. SEE； 1. Wave DNA sizing control；A2～5分別為: 103、102、53、5cfu/mL；B2～5分別為: 103、102、36、3cfu/mL；C2～5分別為: 103、102、45、4cfu/mL；D2～5分別為: 103、102、32、3cfu/mL；E2～5分別為: 103、102、41、4cfu/mL。

2.6 PCR-DHPLC檢測方法的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果

將建立的PCR-DHPLC方法用于本實(shí)驗(yàn)室近幾年從食品樣品中分離的金黃色葡萄球菌的檢測,共檢測了80株金黃色葡萄球菌,樣品菌株來源于多種食品樣品,主要有水產(chǎn)品:蝦、蟹、蜆子、干貝及各種魚類；肉及肉制品:牛肉和雞肉制品；果蔬類:冷凍菜、毛豆和食用菌；糧食及其制品等。檢測結(jié)果顯示,80株金黃色葡萄球菌中有47株含有腸毒素基因,陽性率為58.75%,腸毒素基因型分布情況見表3。只含1種腸毒素基因的有33株,其中只含SEA基因的有20株,只含SEB基因的有3株,只含SEC基因的有9株,只含SEE基因的有1株。同時(shí)含有2種腸毒素基因的有13株,其中含SEA、SEC基因的有4株,含SEA、SEE基因的有1株,含SEB、SEC基因的有7株,含SEC、SED基因的有1株。同時(shí)含有3種腸毒素基因(SEA、SEB和SEC)的菌株僅有1株。3 結(jié)論與討論

表3 80株金黃色葡萄球菌腸毒素基因分布情況Table 3 The enterotoxin gene distribution of eighty strains Staphylococcus aureus

應(yīng)用本文建立的PCR-DHPLC方法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素,從對樣品進(jìn)行增菌,取增菌液提取DNA,到采用PCR-DHPLC方法檢測,只需2d時(shí)間就可出結(jié)果。而傳統(tǒng)的檢測方法采用細(xì)菌分離培養(yǎng)方法,對金黃色葡萄球菌的檢測就需3～6d,而且檢測靈敏度不高,易導(dǎo)致漏檢,如果對檢出的金黃色葡萄球菌是否產(chǎn)腸毒素還要花費(fèi)數(shù)天以上時(shí)間,耗時(shí)更長。另外,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DHPLC方法代替瓊脂糖凝膠電泳,不僅可以省掉點(diǎn)樣、電泳、染色和觀察等較為繁瑣的步驟,還可以避免接觸凝膠電泳中潛在的致癌物質(zhì)-溴化乙錠,只需將PCR反應(yīng)管放入自動進(jìn)樣器,設(shè)定好程序,便能自動完成數(shù)百個樣品的檢測,在業(yè)務(wù)量大的情況下,該方法的應(yīng)用,可達(dá)到高通量檢測的目的,而且大大縮短檢測周期。

本文以SEA～SEE為研究對象,建立的金黃色葡萄球菌腸毒素的PCR-DHPLC檢測方法,靈敏度高、特異性強(qiáng),克服其它方法的局限性,達(dá)到快速、簡便、準(zhǔn)確、高通量的目的。能夠應(yīng)用于金黃色葡萄球菌腸毒素基因的檢測及分型,對預(yù)防和診斷由腸毒素引起的食物中毒,保障食品衛(wèi)生安全具有十分重要的意義。

[1]張鳳笑,石磊. PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌中的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品科技,2008,24(10):1042-1047.

[2]任艷芳,路燕,龐晶晶,等. 一起由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒[J]. 首都公共衛(wèi)生,2011,5(2):90-91.

[3]鄧澤靜,李毅,洪程基,等. 食品中金黃色葡萄球菌污染狀況及其毒素檢測[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,23(2):92-96.

[4]王營,于宏偉,郭潤芳,等. 金黃色葡萄球菌腸毒素基因分布的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(5):84-88.

[5]張嚴(yán)峻,張俊彥,梅玲玲,等. 金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分型和分布[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(6):682-684.

[6]衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于2007年全國食物中毒報(bào)告情況的通報(bào)[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志,2008,20(3):285-288.

[7]Franciosa G,Pourshaban M,De Luca A,etal. Identification of type A,B,E,and F botulinum neurotoxln genes and of botulinum neurotoxigenic clostridia by denaturing high-performance liquid chromatography[J]. Appl Environ Microbiol,2004,70:4170-4176.

[8]Hurtle W,Shoemaker D,Henchal E,etal. Denaturing HPLC for identifying bacteria[J]. Biotechniques,2002,33(2):386-391.

[9]曹際娟,徐君怡. 變性高效液相色譜高通量檢測動物源性飼料中沙門氏菌和志賀氏菌[J]. 飼料工業(yè),2008,29:50-53.

Development of PCR-DHPLC detection method forfive types of Staphylococcal enterotoxin genes

CHEN Bin1,2,WANG Ying1,3,ZHENG Jing1,2,HUANG Xiao-rong1,2,LIN Jie1,2,PENG Hua-yi1,2,SHAO Bi-ying1,2,*

(1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Fuzhou 350001,China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research,Fuzhou 350001,China；3.College of Food Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Five pairs of primers were designed and synthesized for five Staphylococcal enterotoxins genes(SEA,SEB,SEC,SED,SEE). The PCR-DHPLC detection methods for five Staphylococcal enterotoxins genes were established after optimizing of the annealing temperature and DNA template amount. The sensitivity and specificity of the detection method were then determined. The results showed that the PCR-DHPLC method could detect specifically of Staphylococcal enterotoxins genes with detection limit of 100cfu/mL. The PCR-DHPLC detection method had some advantages,such as rapid,accuracy and high throughput. The PCR-DHPLC method had fine application value to detecting Staphylococcal enterotoxins in import and export foods.

Staphylococcusaureus；enterotoxin；PCR；DHPLC

2014-04-29

陳彬(1969-)，女，學(xué)士，高級工程師，研究方向：食品微生物檢測。

*通訊作者:邵碧英(1973-)，女，博士，研究員，研究方向：食品微生物檢測。

福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012J01062) ；福建局科技項(xiàng)目(FK2012-25)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.027