海帶源降亞硝酸鹽和膽固醇益生乳酸菌的篩選與鑒定

儲(chǔ) 炫,郭麗瓊,葉志偉,曹 旅,劉英麗,林俊芳,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642；2.北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

海帶源降亞硝酸鹽和膽固醇益生乳酸菌的篩選與鑒定

儲(chǔ) 炫1,郭麗瓊1,葉志偉1,曹 旅1,劉英麗2,林俊芳1,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642；2.北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

海帶是天然的保健食品,本研究以淡干海帶為原料,從中篩選出具有較強(qiáng)的降亞硝酸鹽和膽固醇能力的優(yōu)良菌株。采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定菌株在MRS液體培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的含量,鄰苯二甲醛法測(cè)定菌株在MRS液體培養(yǎng)基中膽固醇的含量,再對(duì)篩出的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:從淡干海帶中分離出的27株菌株中,有7株菌株具有很強(qiáng)的降解亞硝酸鹽能力,降解率均達(dá)到97%以上。進(jìn)一步對(duì)這7株菌株降解膽固醇的能力進(jìn)行篩選,結(jié)果表明其中3個(gè)菌株降解膽固醇能力較強(qiáng)分別為:55.02%(La-3)、61.21%(La-10)、56.85%(La-15)；經(jīng)過(guò)形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA基因序列相似性分析,結(jié)果顯示這7株菌株均為植物乳桿菌。本文結(jié)果還表明了相同的植物乳桿菌其降解膽固醇的能力存在差異,顯示了物種的多樣性。

乳酸菌,亞硝酸鹽,膽固醇,海帶

亞硝酸鹽是一種國(guó)家食品衛(wèi)生法允許使用的食品添加劑,主要用于肉制品中,在肉制品中起護(hù)色、防腐和改善口感的作用[1]。但是過(guò)量使用亞硝酸鹽,可能會(huì)導(dǎo)致中毒[2],甚至?xí)a(chǎn)生亞硝胺等致癌物[3]。膽固醇是維持人體正常新陳代謝不可缺少的原料,但是膽固醇含量過(guò)高,會(huì)對(duì)人體造成危害。血脂中膽固醇含量過(guò)高,會(huì)引發(fā)冠心病[4-5]、動(dòng)脈粥樣硬化[6]等疾病。

乳酸菌是指可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱,它廣泛存在于人類、動(dòng)物腸道以及環(huán)境中[7]。乳酸菌可以改善腸道菌群結(jié)構(gòu),能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[8]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、減少某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[9]、降低膽固醇[10]等功能。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于乳酸菌的篩選主要放在降膽固醇、降亞硝酸鹽、產(chǎn)γ-氨基丁酸或產(chǎn)對(duì)羥苯乙胺等等,采用的原材料都是來(lái)自發(fā)酵產(chǎn)品如酸奶、奶酪、泡菜、臘腸、咸魚(yú)等等,而目前未有報(bào)道對(duì)未加工的原材料中的益生乳酸菌進(jìn)行篩選,本文以淡干海帶為原料,旨在從中分離篩選出具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽還原酶能力并且能夠降解膽固醇能力的優(yōu)良菌株,為以后海產(chǎn)品的加工利用提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

干海帶 市售。

1.2 培養(yǎng)基

菌株分離、活化:添加1.6%溴甲酚紫MRS固體培養(yǎng)基,pH6.5；加亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基,改良MRS液體培養(yǎng)基(蒸餾水用0.6mol/L KH2PO4代替)[11]；菌種生化鑒定培養(yǎng)基[12]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化 本實(shí)驗(yàn)采用添加1.6%溴甲酚紫MRS固體培養(yǎng)基,按照文獻(xiàn)[13]中平板稀釋法進(jìn)行乳酸菌分離純化。

表1 菌株在MRS培養(yǎng)基中對(duì)亞硝酸鹽的降解率(%)Table 1 The tested strains’ degradability of nitrite sodium in MRS medium(%)

注:不同字母表示不同菌株間在5%水平下有顯著性差異,n=3。1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選 本實(shí)驗(yàn)中初篩采用添加亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基,復(fù)篩采用改良MRS液體培養(yǎng)基,空白對(duì)照采用普通的MRS液體培養(yǎng)基,按照龔鋼明文中的方法[11]篩選海帶中降解亞硝酸鹽的乳酸菌。

1.3.3 發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量的測(cè)定 將篩選的菌株按1%(v/v)接種量接入含有約150μg/mL亞硝酸鹽的液體MRS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h,采用鹽酸萘乙二胺法[14]測(cè)定MRS液體培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的含量,其中空白采用普通MRS培養(yǎng)基,按照相同的處理。

1.3.4 降解膽固醇乳酸菌的篩選 將篩選的菌株按1%(v/v)接種量接種于加有1%的1g/100mL的膽固醇于MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h。參考田建軍文中的方法[15],采用鄰苯二甲醛法測(cè)定MRS培養(yǎng)基中膽固醇含量,其中空白采用普通MRS培養(yǎng)基,按照相同的處理。

1.3.5 菌種鑒定

1.3.5.1 生理生化鑒定 按照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[12]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16],對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)特征的觀察以及生理生化鑒定。

1.3.5.2 16S rDNA基因序列分子生物學(xué)鑒定 基因組DNA的提取參考文獻(xiàn)[17]。16S rDNA基因擴(kuò)增引物為27f:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1495r:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′[18]。由美吉測(cè)序有限公司測(cè)序。將該菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),從而得到相關(guān)菌株的序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

對(duì)所采集的海帶樣品打漿后經(jīng)梯度稀釋,在MRS平板培養(yǎng)后,初步分離純化出能使溴甲酚紫由紫色變黃色的菌株,經(jīng)過(guò)革蘭氏染色,接觸酶反應(yīng),挑選保存革蘭氏陽(yáng)性、接觸酶陰性菌株 27株,編號(hào)為L(zhǎng)a-1～La-27。

2.2 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

2.2.1 降解亞硝酸鹽菌株的初篩 亞硝酸鹽在酸性條件下,與對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)生成重氮鹽,該重氮鹽再與鹽酸萘乙二胺進(jìn)行偶合反應(yīng),生成紫紅色的偶氮化合物,其顏色的深淺與亞硝酸鹽含量成正比[19]。培養(yǎng)基中相同的亞硝酸鹽經(jīng)不同乳酸菌的降解作用后,殘留的亞硝酸鈉越少,其紅色越淺。在測(cè)定過(guò)程中,通過(guò)顯色反應(yīng),看出菌株La-2,La-4,La-12,La-18,La-22,La-25,La-27所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中呈粉紅色,CK管(只添加150μg/mL亞硝酸鹽的液體MRS培養(yǎng)基,沒(méi)有接種乳酸菌)呈紫紅色,而其他的菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng),呈黃色(肉眼下觀察和MRS培養(yǎng)基的顏色幾乎相同),結(jié)合表1中的數(shù)據(jù)可以看出,對(duì)照CK培養(yǎng)液中亞硝酸鹽幾乎沒(méi)有降解,而接種乳酸菌的培養(yǎng)液中,亞硝酸鹽都被不同程度的降解了,表明不同菌株降解亞硝酸鹽的能力不同。選擇亞硝酸鹽的降解率均大于97%的菌株作為進(jìn)一步研究材料,去除掉降解率小于97%的菌株La-2、La-4、La-12、La-18、La-22、La-25、La-27。然而,乳酸菌可以產(chǎn)酸,使培養(yǎng)液中pH降低,從而對(duì)亞硝酸鹽也產(chǎn)生一定的降解作用。故初篩不能判斷乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽降解作用的具體機(jī)理。

表2 菌株在pH>6.0環(huán)境中對(duì)亞硝酸鹽的降解率(%)Table 2 Nitrite degradation ability of the strains under the condition of pH above 6.0(%)

注:**表示沒(méi)有降解作用,同行不同字母表示同一菌株不同時(shí)間在5%水平下顯著性差異,n=3。

表3 菌株在MRS培養(yǎng)基中對(duì)膽固醇的降解率(%)Table 3 Cholesterol degradation ability of the strains in MRS medium(%)

注:不同字母表示不同菌株間在5%水平下有顯著性差異,n=3。2.2.2 降解亞硝酸鹽菌株的復(fù)篩 在亞硝酸鹽降解菌復(fù)篩中,為了排除乳酸菌產(chǎn)酸對(duì)亞硝酸鹽降解作用的影響,所以要控制培養(yǎng)液的pH,采用改良的MRS培養(yǎng)基,對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選,篩選出降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)的菌株,結(jié)果如表2。

乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解分為2個(gè)階段,即:酶降解和酸降解。在pH4.5以上,亞硝酸鹽的降解以酶降解為主；當(dāng)pH<4.0后,亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主[20]。在亞硝酸鹽降解菌的復(fù)篩中,采用緩沖體系使培養(yǎng)基中的pH均在6.0以上,在測(cè)定過(guò)程中,由顯色反應(yīng)可以看出,在12h時(shí),樣品主要呈紫紅色,在24h時(shí),樣品主要呈紅色,在36h時(shí),樣品顏色出現(xiàn)差異,有水粉紅色、粉紅色、微紅色和黃色等,在48h后樣品幾乎都變成黃色,結(jié)合表2可知,在0～36h內(nèi),亞硝酸鹽的降解率明顯增加,在36～72h內(nèi),亞硝酸鹽的降解率增幅很小,趨于穩(wěn)定,在60h后,培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量幾乎為零,故選擇36h內(nèi)降解亞硝酸鹽能力>97%的菌株La-1、La-3、La-7、La-10、La-11、La-15和La-16作為實(shí)驗(yàn)菌株。由此可見(jiàn),乳酸菌可通過(guò)亞硝酸鈉誘導(dǎo)產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶來(lái)降解亞硝酸鹽。

2.3 降解膽固醇菌株的篩選

由表3知,不同的菌株對(duì)膽固醇的降解能力不同,其中,La-3,La-10,La-15降解膽固醇的能力在24h達(dá)到50%以上,較其他菌株能力更強(qiáng)。

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株La-1,La-3,La-7,La-10,La-11,La-15,La-16在添加溴甲酚紫的MRS 固體平板上直徑為1～1.5mm,黃色,不透明,圓形,表面光滑,邊緣整齊。革蘭氏染色:在100×油鏡下觀察為單個(gè)或呈鏈狀排列,革蘭氏染色陽(yáng)性,無(wú)芽孢。其在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)如圖1所示。

表4 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 4 The result of physiology and biochemistry identification

圖1 菌落在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)Fig.1 The cytologic morphology in light microscope

注:微弱是指肉眼看不出變化,但通過(guò)測(cè)OD,有吸光度,但是吸光度很小；“+”:表示陽(yáng)性,”-“表示陰性。2.4.2 生理生化特征 據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化結(jié)果,參照乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[15],初步判定菌株La-1,La-3,La-7,La-10,La-11,La-15,La-16屬于乳桿菌(Lactobacillus)與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)相接近。

2.4.3 16S rDNA鑒定 采用文獻(xiàn)[17]中的方法提取菌株的DNA,再利用引物27f、1495r對(duì)菌株La-1,La-3,La-7,La-10,La-11,La-15,La-16的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖2),得到大小約1500bp的片段。擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果在GenBank上登錄,經(jīng)BLAST比對(duì),結(jié)果顯示菌株La-1,La-3,La-7,La-10,La-11,La-15,La-16的16S rDNA與植物乳桿菌同源性最高,達(dá)99%?？沙醪酱_認(rèn)La-1,La-3,La-7,La-10,La-11,La-15,La-16均為植物乳桿菌。

圖2 PCR擴(kuò)增圖Fig.2 PCR amplification plot

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從海帶中分離得到的27株菌株中,其降解亞硝酸鹽的能力存在差異。這是因?yàn)闂U菌產(chǎn)酸能力比球菌強(qiáng),在沒(méi)有控制pH的條件下,培養(yǎng)時(shí)間相同,桿菌降解亞硝酸鹽能力較強(qiáng)。其次,亞硝酸鈉對(duì)乳酸菌有一定的毒性,不同的乳酸菌在相同的條件下對(duì)亞硝酸鈉的適應(yīng)力不同,抵抗力不同,并且亞硝酸鈉對(duì)其誘導(dǎo)產(chǎn)生的正向突變效果不同[21];再次,乳酸菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶的類型尚不清楚,可能導(dǎo)致降解亞硝酸的能力有差異,這和何婷婷的研究結(jié)果相似,不同類型的亞硝酸鹽還原酶在基因和蛋白序列方面存在顯著差異；同種類型的亞硝酸鹽還原酶,當(dāng)存在于不同種類微生物中時(shí),其序列也會(huì)表現(xiàn)出不同[22]。

本實(shí)驗(yàn)菌種體外降膽固醇能力的測(cè)定是采用鄰苯二甲醛法[14]。該方法的原理是膽固醇及其酯在硫酸作用下與鄰苯二甲醛產(chǎn)生紫紅色物質(zhì),此物質(zhì)在550nm波長(zhǎng)處有最大吸收。在測(cè)定過(guò)程中,采用MRS為空白對(duì)照,以添加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液并接種乳酸菌的MRS和只添加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液的MRS為樣品,進(jìn)行相同的處理,加入濃硫酸和鄰苯二甲醛顯色10min后,空白對(duì)照無(wú)色,而樣品呈紫紅色,顏色深淺不一樣。同時(shí),該實(shí)驗(yàn)也采用硫酸鐵銨法[23]測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株體外降膽固醇能力。在測(cè)定過(guò)程中,采用MRS為空白對(duì)照,以添加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液并接種乳酸菌的MRS和只添加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液的MRS為樣品,進(jìn)行相同的處理,加入硫酸鐵銨工作液混勻靜置30min后,空白對(duì)照和樣品均呈現(xiàn)棕黃色,在560nm下測(cè)定吸光值,發(fā)現(xiàn)用空白對(duì)照調(diào)零,測(cè)得的樣品的吸光度均為負(fù)值。如果直接采用文獻(xiàn)中的以無(wú)水乙醇做空白,按照相同的方法,測(cè)得的MRS培養(yǎng)基中也含有膽固醇,很明顯這是不科學(xué)的,因此,作者認(rèn)為采用硫酸鐵銨法測(cè)定膽固醇的方法誤差較大,不能客觀顯示乳酸菌降解膽固醇的能力。

本實(shí)驗(yàn)中7株菌株鑒定結(jié)果雖然都屬于植物乳桿菌,但是其降解膽固醇的能力卻有明顯的差異。通過(guò)對(duì)這7株菌株的序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)它們的核酸序列相似性為79%,說(shuō)明它們?cè)诨蚪M水平存在差異,因此其相應(yīng)的生理功能也會(huì)有差異?？赡茉蚴?在進(jìn)化的過(guò)程中,由于基因的轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致某些決定菌株間功能多樣性基因的丟失和關(guān)鍵基因的重組[24]；菌株基因組中各自的rRNA、tRNA和GC含量可能存在差異,這些物質(zhì)的高低直接影響著某些基因的失活和消除[25]；乳酸菌具有的蛋白酶水解系統(tǒng),可以操縱蛋白質(zhì)和多肽降解及氨基酸肽運(yùn)輸?shù)穆窂絒26];移動(dòng)遺傳因子可通過(guò)選擇性的基因丟失或者插入序列可以促進(jìn)基因重組,從而使某些關(guān)鍵的基因集相似度變高,菌株之間的差異性就變小[27]；菌株之間對(duì)于脂類代謝途徑可能存在差異[28]。乳酸菌的基因組不同,其遺傳和代謝功能也會(huì)有所不同,乳酸菌自身基因組的退化,也會(huì)導(dǎo)致及其自身生物合成能力的降低[29]。對(duì)菌株的進(jìn)一步確定,需要采用其他的分子生物學(xué)技術(shù)如DNA-DNA同源性(或雜交)分析法、DNA指紋圖譜技術(shù)等[30]。

4 結(jié)論

4.1 本文以干海帶為原料,從中分離出27株乳酸菌。采用鹽酸萘乙二胺法,篩選出7株對(duì)亞硝酸鹽降解率均達(dá)到97%以上的菌株La-1、La-3、La-7、La-10、La-11、La-15、La-16。

4.2 采用鄰苯二甲醛法從高降解亞硝酸鹽的菌株中篩選出3株降解膽固醇能力較強(qiáng)的菌株,其降解率分別為:55.02%(La-3)、61.21%(La-10)、56.85%(La-15)。

4.3 通過(guò)生理生化鑒定和16S rDNA鑒定這7株菌株均屬于乳桿菌屬,并且與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)相接近。

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Screening and identification of lactic acid bacteria withdegrading nitrite and cholesterol fromLaminariajaponica

CHU Xuan1,GUO Li-qiong1,YE Zhi-wei1,CAO Lv1,LIU Ying-li2,LIN Jun-fang1,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China；2. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Laminariajaponicais a kind of natural healthy food. In this paper,the lactic acid bacteria with higher degradation of nitrite and cholesterol were screened from light driedL.japonica. The method of Spectrophotometric hydrochloride naphthylethylenediamine was used to determinate nitrite degradation;and the method of Spectrophotometric Ortho-phthalaldehyde was used to determinate cholesterol degradation in MRS liquid medium. 7 strains with more than 97% degradation rates of nitrite were screened from 27 strains isolated from the light driedL.Japonica. Through determining their ability of cholesterol degradation,3 strains La-3,La-10,La-15 were screened out with higher cholesterol removal,which were 55.02%,61.21%,56.85%,respectively. According to their characteristics,physiology and biochemistry and 16S rDNA gene sequence similarity analysis,the 7 strains wereLactobacillusplantarum. The result indicated that the sameL.plantarumhad difference in degradation of cholesterol,showing species diversity.

lactic acid bacteria；nitrite；cholesterol；Laminariajaponica

2014-04-08

儲(chǔ)炫(1989-),女,碩士,研究方向:生物工程。

*通訊作者:林俊芳(1962-),男,博士，教授,主要從事食品生物工程技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272217)；廣東省攻關(guān)項(xiàng)目(2010B011000016,2012B020316004)。

TS203.1

A

1002-0306(2015)03-0163-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.025