梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2的理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)研究

高呈琳，張小爽，陳 健

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2的理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)研究

高呈琳，張小爽，陳 健

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

以梭柄松苞菇子實(shí)體為原料,采用超聲輔助水提醇沉法,經(jīng)脫色、脫蛋白、DEAE-52離子交換柱層析、葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析分離純化得到梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2,用高效凝膠滲透色譜(GPC)結(jié)合葡聚糖凝膠Sephadex G-100的分離結(jié)果鑒定其分子量分布及純度,利用碘-碘化鉀、苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍(lán)G-250法、硫酸-咔唑法對(duì)其淀粉含量、總糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量進(jìn)行測定；經(jīng)紫外光譜分析、紅外光譜分析、GC分析其官能團(tuán)特征及單糖組成。結(jié)果表明,CVP-Ⅱ2為非淀粉白色絮狀均一多糖,其總糖、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量分別為:總糖含量為86.76%,不含蛋白質(zhì),糖醛酸含量為12.93%；其重均相對(duì)分子量Mw為11252u；紅外光譜顯示CVP-Ⅱ2具有多糖的特征吸收峰且為吡喃型糖環(huán)構(gòu)型；單糖組成結(jié)果顯示CVP-Ⅱ2含巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩爾比為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.63∶29.36∶5.02。

梭柄松苞菇,多糖,分離純化,理化性質(zhì),結(jié)構(gòu)

梭柄松苞菇(Catathelasmaventricosum(Peck)Sing)[1],屬真菌界、傘菌目、白蘑科、松苞菇屬。又名梭柄乳頭蘑、老人頭菌、松苞菇(云南)、紗羅包、羅漢菌(四川)、松杉苞。該菌多生長于海拔1200米以上,松、杉木、油杉等針闊葉林中陰濕疏松的地上,尤其在有稀疏陽光照射、且有落葉覆蓋的緩坡上更為常見,單生至群生,對(duì)生長環(huán)境非常挑剔,人工無法培植,主要分布于黑龍江、四川、貴州、云南、西藏等地區(qū)。蛋白質(zhì)含量豐富,氨基酸品種齊全,并且含有豐富的礦物質(zhì)及維生素,對(duì)梭柄松苞菇的藥用療效,《本草綱目》及《滇南本草》記載梭柄松苞菇 “氣味辛、平、無毒、性溫,主治心脾暴痛。高秀君[2]、Liu Yun-tao[3-5]、劉蒙蒙等[6]、李張等[7]均對(duì)梭柄松苞菇多糖的各種活性進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)得到的梭柄松苞菇多糖具有較好的降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化等各種功能活性,并且有少量的結(jié)構(gòu)研究,其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)分析以及構(gòu)效關(guān)系上研究甚少。本文論述超聲輔助提取得到的梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2的提取、分離純化、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等方面的系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梭柄松苞菇 購于廣州一德路干貨市場；葡萄糖、單糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白、半乳糖醛酸、考馬斯亮藍(lán)G-250 美國sigma公司生產(chǎn)；WhatmenDEAE-52 廣州展晨生物科技有限公司進(jìn)口分裝；D354FD樹脂 廣州市廣聯(lián)津化工有限公司生產(chǎn)；苯酚、濃硫酸、95%乙醇、正丁醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、疊氮化鈉、三氟乙酸、甲醇、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、鄰苯二甲酸氫鉀、濃磷酸、四硼酸鈉、咔唑、碘、碘化鉀 均為國產(chǎn)分析純；磷酸二氫鉀,化學(xué)純；Sephadex G-100 Pharmacia公司。

AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DHB-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DSA-129粉碎機(jī),美的有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 河南省鞏義予華儀器有限公司；KQ-250V超生波清洗器 昆山市超生儀器有限公司；KDC-4低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司；UV-5000分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；98-1-B調(diào)溫電熱套 天津市泰斯儀器有限公司；BT-200恒流泵、DBS-100自動(dòng)部分收集器 上海滬西儀器廠；Waters2410示差檢測器、717plus自動(dòng)進(jìn)樣器、1525HPLC泵 美國Waters公司；DE-310冷凍干燥器,德國威思公司；HHS恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AGLIENT6890T氣相色譜系統(tǒng) 美國AGLIENT公司；Vector33傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruck公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖制備分離純化工藝 梭柄松苞菇子實(shí)體→粉碎過20目篩→超聲輔助熱水浸提→離心→減壓濃縮→D354FD樹脂脫色→醇沉→離心→Sevage法脫蛋白→醇沉→離心→沉淀溶解→DEAE-52離子交換柱層析(規(guī)格為2.6×30cm的Z型層析柱,平衡后7s/滴。)→0.05mol/L NaCl洗脫→收集組分→減壓濃縮→透析→冷凍干燥→得到CVP-Ⅱ→CVP-Ⅱ復(fù)溶→Sephadex G-100凝膠柱層析(規(guī)格為2.6×30cm的Z型層析柱,平衡后15s/滴。)→CVP-Ⅱ2純品[8]。

1.2.2 梭柄松苞菇子實(shí)體多糖CVP-Ⅱ2的相對(duì)分子質(zhì)量測定及純度鑒定 CVP-Ⅱ2的均一程度和相對(duì)分子質(zhì)量用高效凝膠滲透色譜測定。色譜條件:TSK-GEL G-4000PWXL柱(7.8mm×300mm)與TSK-GEL G-2500PWXL柱(7.8mm×300mm)串聯(lián)；流動(dòng)相為0.02mol/L KH2PO4溶液,pH6.0；流速為0.6mL/min；柱溫為35℃；檢測器:示差檢測器。

1.2.3 紫外掃描圖掃描 稱取梭柄松苞菇精制多糖CVP-Ⅱ24mg,將其配制成4mL的多糖溶液,以蒸餾水為對(duì)照,于190～500nm處掃描。

1.2.4 總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[9]

1.2.5 淀粉的測定 采用碘-碘化鉀法[10]

1.2.6 糖醛酸的測定 采用硫酸-咔唑法[11]

1.2.7 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[12]

1.2.8 紅外光譜掃描 取梭柄松苞菇精制多糖CVP-Ⅱ2約2mg與KBr混合研細(xì)后,在4000～500cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描[13-14]。

1.2.9 單糖組成分析 多糖CVP-Ⅱ2的水解:取柄松苞菇精制多糖CVP-Ⅱ2TAPⅠ10mg,置于5mL安培管中,加4mL 2mol/L三氟乙酸,酒精噴燈封口,110℃水解6h,將水解液減壓蒸干,然后加甲醇溶解,再減壓蒸干,重復(fù)多次以除盡殘余的三氟乙酸[15-16]。

水解物的衍生化:分別向水解物、單糖標(biāo)準(zhǔn)品中加入鹽酸羥胺10mg、吡啶1mL,90℃水浴反應(yīng)30min并振蕩,冷卻至室溫,加入醋酸酐1mL,繼續(xù)于90℃水浴保持30min,生成具有揮發(fā)性的糖腈乙酸酯衍生物。

氣相色譜分析:將按照上述方法制備的產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析,根據(jù)匹配單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分析結(jié)果,并根據(jù)氣相色譜各峰的面積比計(jì)算出單糖重量百分比[4-5]。色譜條件:采用Aglient 6890N氣相色譜儀、DB-1701毛細(xì)管柱(30m×0.25m,0.25μm)及氫火焰離子化檢測器；高純氮作載氣,流速為1mL/min。程序升溫:柱初始溫度為180℃,以2℃/min升至220℃,保持1min,以5℃/min升至250℃,保持2min；進(jìn)樣口溫度為250℃,汽化室溫度為250℃,檢測器溫度為300℃,吹掃流速為4.0mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel和Oringe軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CVP-Ⅱ2純度鑒定及其相對(duì)分子質(zhì)量測定

梭柄松苞菇多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析,以0.05mol/L的NaCl溶液洗脫得到CVP-Ⅱ,得率為30.00%,該組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析用蒸餾水洗脫,得到組分CVP-Ⅱ2,得率為12%。圖1為梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析用蒸餾水洗脫,苯酚硫酸法跟蹤檢測得到CVP-Ⅱ2的洗脫曲線,只出現(xiàn)單一對(duì)稱峰,初步判定CVP-Ⅱ2為均一多糖。

圖1 得到CVP-Ⅱ2的葡聚糖凝膠 Sephadex G-100洗脫曲線 Fig.1 Elution curve of CVP-Ⅱ2 on Sephadex G-100 chromatography

圖2為梭柄松苞菇子實(shí)體多糖CVP-Ⅱ2的GPC圖譜。由圖2可知,CVP-Ⅱ2經(jīng)凝膠滲透色譜得到的是單一對(duì)稱峰,與葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層洗結(jié)果一致,所以CVP-Ⅱ2為單一組分。CVP-Ⅱ2峰位分子量為6935u,數(shù)均相對(duì)分子量為Mn為9201u,重均相對(duì)分子量Mw為11252u,Z均相對(duì)分子量為13947u,分散系數(shù)為1.24。

圖2 CVP-Ⅱ2的GPC圖譜Fig.2 Gel chromatogram of CVP-Ⅱ2

2.2 CVP-Ⅱ2紫外光譜掃描

圖3為CVP-Ⅱ2紫外掃描光譜圖。由圖3可知,CVP-Ⅱ2在260、280nm處均沒有明顯特征吸收峰,說明CVP-Ⅱ2中不含蛋白質(zhì)及核酸,或者兩種組分含量很少。

圖3 CVP-Ⅱ2的紫外掃描光譜圖Fig.3 UV spectrum of CVP-Ⅱ2

2.3 CVP-Ⅱ2理化性質(zhì)分析

由表1可知,CVP-Ⅱ2為白色棉絮狀,不發(fā)生碘-碘化鉀反應(yīng),屬于非淀粉多糖；苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.4491x-0.0044,R2=0.9994,測得總糖含量為86.76%,考馬斯亮藍(lán)G-250標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.0659x+0.0359,R2=0.9922,測得的結(jié)果為反應(yīng)呈陰性,結(jié)合紫外掃描光譜圖,CVP-Ⅱ2中不含蛋白,硫酸-咔唑反應(yīng)呈陽性,且測得糖醛酸含量為12.93%。

2.4 CVP-Ⅱ2的紅外掃描光譜

圖4為梭柄松苞菇純化多糖CVP-Ⅱ2的紅外光譜圖。由圖4可知,CVP-Ⅱ2在波數(shù)3396cm-1處的強(qiáng)吸收峰是糖類分子間或分子內(nèi)的O-H伸縮振動(dòng)峰,在波數(shù)2927cm-1處存在的吸收峰為次甲基或甲基的C-H振動(dòng)吸收峰,在波數(shù)1420、1364、1280cm-1處的吸收峰為羧基的C-O伸縮振動(dòng)峰,這三組糖類的特征峰可以判斷CVP-Ⅱ2為多糖[13-14]；在波長1643cm-1處明顯吸收峰是羰基C=O的伸縮振動(dòng)峰,加之1200～1000cm-1的C-O伸縮振動(dòng),再次印證CVP-Ⅱ2中含有糖醛酸,同時(shí)與2.3中所測得的結(jié)果一致,說明CVP-Ⅱ2是一種酸性雜多糖[13-14]；同時(shí),在1200～1000cm-1的幾組吸收峰及917、764cm-1處的吸收峰表示CVP-Ⅱ2的糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型。

表1 CVP-Ⅱ2的理化性質(zhì)Table 1 The physio-chemical properties of CVP-Ⅱ2

注:“-”表示未檢測出。

圖4 CVP-Ⅱ2的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum diagram of CVP-Ⅱ2

2.5 CVP-Ⅱ2的單糖組成分析

圖5為單糖標(biāo)準(zhǔn)品糖腈乙酸酯衍生化后的氣相色譜圖。由圖5可知鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的保留時(shí)間依次為8.667、9.674、10.012、10.795、16.087、17.207、18.010min。

圖5 各標(biāo)準(zhǔn)品的GC色譜圖Fig.5 GC diagram of standard mixture

圖6為CVP-Ⅱ2經(jīng)糖腈乙酸酯衍生化后進(jìn)行氣相色譜分析。將CVP-Ⅱ2的水解產(chǎn)物的氣相色譜圖各單糖的保留時(shí)間與單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比,可知CVP-Ⅱ2含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。依據(jù)面積歸一化法,峰面積之比等于所含物質(zhì)質(zhì)量之比,可得出各個(gè)單糖質(zhì)量百分比大致為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.48∶29.36∶5.02,根據(jù)各物質(zhì)的質(zhì)量與其摩爾質(zhì)量之比得到的即為各物質(zhì)的物質(zhì)的量,即得到各單糖的物質(zhì)的量之比為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.63∶29.36∶5.02?？梢奀VP-Ⅱ2中甘露糖含量最少,占2.71%；其次是巖藻糖和半乳糖,葡萄糖含量最高,占總質(zhì)量的79.65%。

圖6 CVP-Ⅱ2GC色譜圖Fig.6 GC diagram of CVP-Ⅱ2

3 結(jié)論與討論

經(jīng)采用超聲輔助水提,經(jīng)脫色、脫蛋白、DEAE-52離子交換柱層析、葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析分離純化得到梭柄松苞菇多糖CVP-Ⅱ2,高效凝膠滲透色譜(GPC)和葡聚糖凝膠Sephadex G-100鑒定CVP-Ⅱ2為均一多糖,其重均相對(duì)分子量Mw為11252u；其狀態(tài)及顏色為白色棉絮狀,碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性,證明不含淀粉,苯酚-硫酸法測得其總糖含量為86.76%,考馬斯亮藍(lán)G-250法及紫外掃描光譜分析顯示CVP-Ⅱ2不含蛋白,硫酸-咔唑法顯示其糖醛酸含量為12.93%；紅外光譜分析顯示為CVP-Ⅱ2含有多糖的特征吸收峰,且為吡喃型糖環(huán)構(gòu)型；單糖組成分析顯示CVP-Ⅱ2由巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖四種單糖組成,且其摩爾比為:甘露糖∶巖藻糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶1.63∶29.36∶5.02。CVP-Ⅱ2主要由葡萄糖組成,質(zhì)量占79.65%。

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Physico-chemical and structural characterization ofpolysaccharide CVP-Ⅱ2fromCatathelasmaventricosum

GAO Cheng-lin,ZHANG Xiao-shuang,CHEN Jian

(College of Light Industry and Food Science South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Polysaccaride CVP-Ⅱ2fromCatathelasmaventricosumfruiting bodies was extracted by water with ultrasonic-assisted and alcohol precipitating,and then was purified by decoloration,deproteinization with sevage method and DEAE-52 ion-exchange column choromatography and Sephadex G-100 column choromatography. It was identified as homogeneous component by means of gel permeation chromatography and Sephadex G-100 gel column chromatography. The contents of total sugar,protein,uronic acid and starch were determined by phenol-sulphuric acid,Coomassie brilliant blue staining,Sulfuric acid-carbazole method,law of iodine-potassium iodide. Its structure was analyzed by the method of IR,GC. The result showed that the weight average relative molecular mass of CVP-Ⅱ2was 11252u relatively. It was white and flocculent appearance with no starch. The contents of total sugar,protein,uronic acid was 86.76%,0,12.93%,respectively,CVP-Ⅱ2contained the characteristic absorption peak of polysaccharide and configuration was Pyran type,Monosaccharide composition of CVP-Ⅱ2was fucose,mannose,glucose and galactoside,and the mole ratios was:Man∶Fuc∶Glu∶Gla=1∶1.63∶29.36∶5.02.

Catathelasmaventricosum;polysaccaride;isolation and purification;structure

2014-05-04

高呈琳(1989-),女,在讀碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物分離純化。

*通訊作者:陳健(1967-),男,博士,副教授,主要從事食品化學(xué),天然產(chǎn)物化學(xué),多糖生物技術(shù)等方面的研究。

TS201.1

A

1002-0306(2015)03-0133-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.019