X射線對嗜熱乳桿菌產(chǎn)L乳酸的選育研究

吳慶華,陳積紅,張 珍,李文建,胡 偉,魏子昊,劉 敬,王曙陽

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學(xué)院近代物理研究所,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室,甘肅蘭州 730000)

吳慶華1,2,3,陳積紅2,3,*,張 珍1,李文建2,3,胡 偉2,3,魏子昊1,劉 敬2,3,王曙陽2,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學(xué)院近代物理研究所,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室,甘肅蘭州 730000)

為了獲得更適于工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)L-乳酸菌株,提高生產(chǎn)效率。本文以X射線對嗜熱乳桿菌(Lactobacillusthermophilus)進(jìn)行誘變處理,通過碳酸鈣-溴甲酚紫平板初篩結(jié)合搖瓶復(fù)篩的方法,最終獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的突變菌株。結(jié)果表明:經(jīng)X射線誘變得到的突變菌株SR7,平均發(fā)酵產(chǎn)酸量為22g/L,比原菌株產(chǎn)量提高了15.04%,且經(jīng)過多次重復(fù)實驗表明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

嗜熱乳桿菌,L-乳酸,誘變育種

乳酸(Lactic acid),又名2-羥基丙酸(2-hydroxypropanoic acid),是一種重要的天然有機酸[1]。根據(jù)其構(gòu)型和旋光性,可分為D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸[2]。由于人體只具有L-乳酸脫氫酶,所以只有L-乳酸能被人體完全代謝,而D-乳酸或DL-乳酸的攝入過量則有可能引起代謝紊亂甚至導(dǎo)致中毒[3]。因此,L-乳酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品等領(lǐng)域[4]。特別是高光學(xué)純度的L-乳酸,可作為生物降解材料聚乳酸的前體。所以,從健康和環(huán)保的角度考慮,L-乳酸的制備及應(yīng)用研究,已引起世界廣泛重視,應(yīng)用前景廣闊,市場需求量巨大[5-6]。

目前,在工業(yè)上,L-乳酸的生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵[7]。其中,細(xì)菌類嗜熱乳桿菌屬于同型乳酸發(fā)酵菌株,具有發(fā)酵溫度高和需氧量低等特點,極大的減少了發(fā)酵過程中其他微生物的污染以及生產(chǎn)成本[8]。然而,從自然界中獲得的野生型菌種往往不能達(dá)到工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)要求,需要經(jīng)過誘變技術(shù)進(jìn)一步人工的改造。如魯明波[9]等人利用紫外線處理鼠李糖乳桿菌,篩選獲得一株比原始菌株產(chǎn)L-乳酸提高了18.1g/L的高產(chǎn)突變株。蔡聰[10]等人通過等離子體誘變凝結(jié)芽孢桿菌,篩選得到了穩(wěn)定高產(chǎn)L-乳酸突變株等。

而X射線作為一種短波長的電磁輻射,具有精度可調(diào),操作簡便等特點,被廣泛應(yīng)用于生物體的輻照效應(yīng)研究[11]。例如,羅水忠[12]、陳亮[13]等人都以X射線對菌種進(jìn)行誘變選育,效果顯著。但該技術(shù)在產(chǎn)L-乳酸細(xì)菌類中應(yīng)用很少見報道。

因此,本研究以X射線為誘變手段對嗜熱乳桿菌進(jìn)行誘變選育,以期望得到穩(wěn)定高產(chǎn)L-乳酸的突變菌株,降低生產(chǎn)成本,利于工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

嗜熱乳桿菌(Lactobacillusthermophilus) 由中國科學(xué)院近代物理研究所生物物理室提供。

SW-CJ-1Cμ型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；TE101-L天平、BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；756PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；PB-21酸度計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHP-9082型電熱恒溫箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋渦混合器 上?？等A生化儀器制造有限公司。

培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基[14](g/L):葡萄糖20g,蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g,檸檬酸鈉5g,吐溫-80 1mL,乙酸鈉5g,K2HPO42g,MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·4H2O 0.25g,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,pH6.2～6.4(用冰醋酸調(diào)pH)；篩選平板(碳酸鈣-溴甲酚紫):MRS培養(yǎng)基中添加0.25%的碳酸鈣和0.01%溴甲酚紫；種子培養(yǎng)基(液體MRS):MRS培養(yǎng)基中不加瓊脂；發(fā)酵培養(yǎng)基[15](g/L):種子培養(yǎng)基中葡萄糖50g,CaCO350g,pH6.8。以上培養(yǎng)基滅菌條件均為115℃,20min[16]。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的測定 將斜面保存的嗜熱乳桿菌接種一兩環(huán)于種子培養(yǎng)基中,50℃下靜置培養(yǎng)。每2h取樣,測定OD600,至24h。以時間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo)作圖,得到原始菌株的生長曲線[17]。

1.2.2 X射線誘變 X射線誘變[17]:取活化后的菌種,用生理鹽水將菌濃度調(diào)整到10-8個/mL,用振蕩器制成均勻的菌懸液。將制備好的菌懸液吸取1mL于輻照小皿,輻射計量為0.98Gy/min,以0、12.5、25、50、75、100、125、150Gy下進(jìn)行X射線輻照。將輻照好的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋,吸取0.1mL涂于篩選平板上,50℃培養(yǎng)24h后計算每皿菌落數(shù),繪制致死曲線。進(jìn)行突變菌株初步篩選,挑取單菌落進(jìn)行后期發(fā)酵測定實驗。

1.2.3 菌種篩選 初篩:將經(jīng)X射線誘變處理的菌懸液適當(dāng)稀釋,吸取0.1mL涂布于篩選平板上,50℃培養(yǎng)24h,篩選平板上將出現(xiàn)乳白色菌落,并且在菌落周圍出現(xiàn)黃色變色圈。將變色圈大的菌落挑取培養(yǎng),然后稀釋涂布成單菌落,測定變色圈直徑和菌落直徑之比(即HC值),并進(jìn)行編號[18]。

復(fù)篩:挑取初篩菌種的保藏菌種一兩環(huán),在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)后半期后,以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基,進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實驗,培養(yǎng)72h進(jìn)行產(chǎn)量測定。

1.2.4 分析方法 生物量測定:采用比濁法,紫外分光光度計測菌液OD600nm[18]；致死率的測定:活菌平板計數(shù)法[19]；乳酸的測定:EDTA滴定法[20]。

致死率(%)=(誘變前活菌數(shù)-誘變后活菌數(shù))/誘變前活菌數(shù)×100

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)處理均采用Excel、顯著性結(jié)果分析均采用SPSS19；圖表制作均采用origin 7.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始菌株的生長曲線

為了了解原始菌株生長情況并為后期實驗做準(zhǔn)備。按照1.2.1的方法,得到原始菌株的生長曲線(圖1)。由圖1可以看出,前10h為延滯期,從10h到22h為對數(shù)生長期,22h后為穩(wěn)定期。由于誘變在菌種生長的對數(shù)期后半期效果最明顯,所以選取培養(yǎng)18h的菌種作后期誘變處理。

圖1 嗜熱乳桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus thermophilus

2.2 X射線誘變結(jié)果

本實驗將X射線的流強控制在大致相同的范圍內(nèi),按照1.2.2的方法,以相對輻照劑量為橫坐標(biāo),致死率為縱坐標(biāo),作致死曲線,結(jié)果如圖2所示。

圖2 嗜熱乳桿菌的致死曲線Fig.2 Lethality rate curve of Lactobacillus thermophilus

根據(jù)誘變理論,有研究表明一般選擇致死率為70%～80%的劑量輻照誘變菌株,菌株容易出現(xiàn)正突變[10,18]。由圖2可以看出,隨著輻照劑量的增加,細(xì)菌的致死率逐漸提高,當(dāng)輻照劑量達(dá)到75Gy時,致死率已經(jīng)達(dá)到94%。圖2表明,本實驗選取的輻照量范圍合理,并選擇輻照劑量在50～100Gy的菌液平板,挑取單菌落進(jìn)行發(fā)酵測定。

表2 突變株SR3、SR5、SR7遺傳穩(wěn)定性測定(g/L)Table 2 The results of genetic stability of the mutation stain SR3、SR5、SR7(g/L)

2.3 X射線突變菌的篩選

2.3.1 初篩 將經(jīng)X射線誘變處理的菌懸液適當(dāng)稀釋,按照1.2.3初篩的方法,初篩結(jié)果見表1。為了實驗的可靠性和重復(fù)性,再對其做了發(fā)酵產(chǎn)酸測定(圖3)。結(jié)果SR7的HC值高于原始的5.4%,發(fā)酵產(chǎn)酸也達(dá)到了23.35g/L,有顯著差異(p<0.001)。則根據(jù)表1和圖3挑選出HC值比出發(fā)菌株SR0大并產(chǎn)酸能力強的3株(S3、S5、S7)單菌落挑取保藏,以便進(jìn)行下一步發(fā)酵實驗。

表1 嗜熱乳桿菌的平板初篩Table 1 Screening results ofLactobacillus thermophilus with plate

圖3 菌株的產(chǎn)酸篩選Fig.3 The strains screening of acid production注:不同數(shù)量的*表示差異顯著, *p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；圖4、表2同。

2.3.2 復(fù)篩 綜上可見,將挑選出的SR3、SR5、SR7突變株進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵實驗。按照1.2.3復(fù)篩的方法,得到突變菌株的產(chǎn)酸如圖4。由圖4可見,SR7突變菌株的產(chǎn)酸量比原始菌株有顯著的提高。

圖4 菌株的產(chǎn)酸篩選Fig.4 The strains screening of acid production

2.4 突變株穩(wěn)定性測定

將以上3個突變株連續(xù)傳代7次,每隔一代分別進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸實驗,測定L-乳酸含量,結(jié)果見表2。從表2可以看出,SR3和SR5突變株的產(chǎn)酸穩(wěn)定性不好,而SR7經(jīng)過7次傳代,L-乳酸產(chǎn)量變化不大,說明突變株SR7有穩(wěn)定的產(chǎn)酸遺傳特性。原始菌株L-乳酸產(chǎn)量平均為19.12g/L,SR7突變菌株的L-乳酸產(chǎn)量平均為22g/L,比原始菌株產(chǎn)酸率提高了15.04%。

3 結(jié)論

本實驗通過對原始菌株SR0進(jìn)行X射線誘變,經(jīng)初篩、復(fù)篩,篩選得到一株穩(wěn)定的、高產(chǎn)L-乳酸的嗜熱乳桿菌的突變菌株SR7,其L-乳酸產(chǎn)量從最初的19.12g/L提高到22g/L,產(chǎn)率提高了15.04%,連續(xù)傳代7次其L-乳酸產(chǎn)量變化不大,表明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性,這為利用該菌進(jìn)行L-乳酸工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Breeding study ofLactobacillusThermophilicsinduced by

X-ray forL-lactic acid productionWU Qing-hua1,2,3,CHEN Ji-hong2,3,*,ZHANG Zhen1,LI Wen-jian2,3,HU Wei2,3,WEI Zi-hao1,LIU Jing2,3,WANG Shu-yang2,3

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China;3.Engineering Laboratory of Radiation and Mutation Breeding,Gansu Province,Lanzhou 730000,China)

In order to obtain a lactic acid bacteria strain to more suitable for industrial production and to improve the production efficiency. TheLactobacillusthermophiluswhich irradiated by X-ray were screened by calcium carbonate-bromocresol purple plate and submerged fermentation in shaking flask. The results showed that a stable high-yield mutant strain,named SR7,could produce 22g/L ofL-lactic acid on average with the yield increase of 15.04%,compared to the original strain. It was also proved that SR7 strain had good genetic stability by repeating experiments.

Lactobacillusthermophilus;L-lactic acid;mutation breeding

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.015

2014-04-02

吳慶華(1988-),女,碩士研究生，研究方向:營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

*通訊作者:陳積紅(1965-),男,本科,高級工程師,研究方向:輻射微生物選育研究。

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2013GB24910680)(2012GB24910647)；國家青年基金項目(11305225)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)03-0116-04