紫甘藍(lán)花色苷組成及抗豬傳染性胃腸炎病毒活性分析

雷用東,魏向利,羅小玲,*,童軍茂,趙曉燕

(1.農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院,北京 100097)

紫甘藍(lán)花色苷組成及抗豬傳染性胃腸炎病毒活性分析

雷用東1,魏向利1,羅小玲1,*,童軍茂2,趙曉燕3

(1.農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院,北京 100097)

為在體外探尋紫甘藍(lán)花色苷(Anthocyanins from Purple Cabbage,APC)抗豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)的活性效果。本研究以APC粉為原料,采用高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)的方法鑒定其花色苷成分后,在體外將APC作用于感染TGEV的豬睪丸細(xì)胞系(swine testicle,ST)單層表面,通過研究APC對(duì)TGEV誘導(dǎo)ST細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞存活情況,評(píng)價(jià)APC是否具有抗TGEV的活性作用。結(jié)果表明:紫甘藍(lán)花色苷粉中至少含13種花色苷成分,其中主要為矢車菊色素的糖苷；APC對(duì)細(xì)胞無毒性的最大安全質(zhì)量濃度為100μg/mL；APC在安全濃度范圍內(nèi)能夠顯著抑制TGEV誘導(dǎo)的ST細(xì)胞形態(tài)變化,降低凋亡。因此,紫甘藍(lán)花色苷具有抗TGEV的生物活性作用。

紫甘藍(lán)花色苷,豬睪丸細(xì)胞系,豬傳染性胃腸炎病毒,生物活性

紫甘藍(lán)(Purple Cabbage),又稱紅甘藍(lán),拉丁名:BrassicaoleraceaL.var.capitataL.,十字花科蕓苔屬[1]。紫甘藍(lán)作為一種食用性蔬菜,在我國(guó)已大面積種植,價(jià)格低廉、色素含量高,且安全無毒,具有特定的藥理藥效功能。研究發(fā)現(xiàn)花色苷具有抗氧化[2]、抗癌、抗腫瘤[3]、抑菌[4]等作用,在食品、醫(yī)藥以及化妝品有廣泛的用途。TGEV為急性豬傳染性胃腸炎病病毒,傳染速度快,尤其仔豬容易受感染[5],已給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大經(jīng)濟(jì)損失。因此,本項(xiàng)目在結(jié)合國(guó)內(nèi)外對(duì)紫色作物花色苷抗氧化生理功能研究的基礎(chǔ)上,以紫甘藍(lán)花色苷粉末為材料,借助體外ST細(xì)胞為載體,通過APC對(duì)TGEV誘導(dǎo)的ST細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,在體外開展其抗病毒活性的研究。為APC預(yù)防病毒藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)和預(yù)防家禽病毒提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫甘藍(lán)花色苷粉 由北京農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供；ST細(xì)胞及TGEV病毒 由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧所提供；胰蛋白酶 美國(guó)BD公司；胎牛血清(FBS),MEM培養(yǎng)基 Hyclone公司；二甲基亞砜(DMSO),噻唑藍(lán)(MTT) Sigma公司；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC 1200系列,MS 6310系列) Agilent公司；CO2水套式培養(yǎng)箱 Thermo公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡TE300 Nikon公司；細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)分析儀CYT-100 CYTORECON公司；酶標(biāo)儀 550 Bio Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫甘藍(lán)花色苷的主要成分分析 樣品的制備:采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液將APC粉配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的母液,在無菌條件下,用0.22μm濾膜過濾備用。

HPLC-MS聯(lián)機(jī)上機(jī)參數(shù):流動(dòng)相A采用5%甲酸水溶液,流動(dòng)相B采用100%乙腈,梯度洗脫程序如下:0min(13%B,87%A)、8min(22%B,78%A)、15min(23%B,77%A)、20min(100%B)、25min(100%B)、26min(13%B,87%A)、33min(停止)。流速為0.8mL/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm。MS采用正離子模式,N2流速為12L/min,干燥氣溫度為350℃,噴霧器壓力為45psig,離子掃描范圍為100～1000m/z。

1.2.2 ST細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮罐中取出ST細(xì)胞,先將細(xì)胞移入含有20% FBS的MEM培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)蘇。培養(yǎng)約48h,細(xì)胞待長(zhǎng)成單層,進(jìn)行棄液,采用0.25%胰蛋白酶消化,加入含10% FBS的MEM培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 紫甘藍(lán)花色苷對(duì)ST的毒性實(shí)驗(yàn) 為探索APC抗病毒作用,預(yù)先研究APC對(duì)ST細(xì)胞的毒性作用。取傳代培養(yǎng)至3～5代的ST細(xì)胞,消化細(xì)胞并稀釋濃度為2～3×105cells/mL的細(xì)胞懸液,采用移液排槍將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔移入量為200μL,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱,待長(zhǎng)成單層細(xì)胞,棄液,分別加入含不同體積的APC母液,使其APC質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100、120、140μg/mL,用含2% FBS 的MEM細(xì)胞維持液使其每孔總體積均為200μL。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別在48h和96h時(shí)采用MTT法測(cè)定OD490值,OD值的大小能反映出細(xì)胞存活情況。設(shè)置細(xì)胞對(duì)照和重復(fù)對(duì)照,三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 紫甘藍(lán)花色苷體外抗TGEV活性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 紫甘藍(lán)花色苷體外的預(yù)防病毒實(shí)驗(yàn) 按照上述APC對(duì)ST毒性實(shí)驗(yàn)方法,移取200μL的細(xì)胞懸液置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,向每孔中加入不同體積APC母液,在37℃培養(yǎng)箱中孵育1h后,每孔移入20μL TGEV病毒液,孵育1h,棄液,換上新的細(xì)胞維持液,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)至48h和72h時(shí),采用MTT法測(cè)定OD490值。同時(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)細(xì)胞和病毒對(duì)照,三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 紫甘藍(lán)花色苷體外的治療病毒實(shí)驗(yàn) 取待長(zhǎng)成單層細(xì)胞后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,棄液,每孔移入20μL TGEV病毒液,37℃培養(yǎng)箱孵育1h,棄液,向每孔中加入不同體積APC母液,用細(xì)胞維持液補(bǔ)液體至200μL。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)至48h和72h時(shí),采用MTT法測(cè)定OD490值,同時(shí)采用顯微鏡進(jìn)行觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)對(duì)照同上。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘藍(lán)花色苷的成分分析

通過HPLC分析得到紫甘藍(lán)花色苷的HPLC色譜圖,見圖1,圖中明顯有13個(gè)峰,說明紫甘藍(lán)實(shí)驗(yàn)至少含13種花色苷組分,其中峰1、9、10的峰面積明顯較大,說明此三種組分在總的花色苷含量比例較大。根據(jù)MS分析出的離子碎片信息,母離子及二級(jí)離子碎片信息的質(zhì)核比,并結(jié)合HPLC的保留時(shí)間,參考其它文獻(xiàn)[1,6],鑒定出13種紫甘藍(lán)花色苷主要成分的結(jié)構(gòu),結(jié)果見表1。由表1可知,紫甘藍(lán)花色苷組分均以矢車菊色素為苷元的多糖和不同?；Y(jié)合的糖苷,與劉玉芹[7]鑒定紫甘藍(lán)花色苷的九種組分大體相符合。本文從紫甘藍(lán)樣品中鑒定出13種不同?；Y(jié)合的花色苷組分,主要是由于品種差異、提取條件及檢測(cè)條件等差異引起的。

圖1 紫甘藍(lán)主要花色苷的HPLC色譜圖(520nm)Fig.1 HPLC-MS profiles(520nm) of the major anthocyanins from purple cabbage

表1 紫甘藍(lán)中主要的花色苷成分Table 1 The major anthocyanin components of purple cabbage

表2 APC對(duì)ST細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of APC on cytotoxicity test of ST ±S,n=6)

2.2 紫甘藍(lán)花色苷對(duì)ST細(xì)胞毒性的研究

本文ST細(xì)胞存活率采用經(jīng)典MMT法[8],測(cè)定經(jīng)不同質(zhì)量濃度的APC處理ST單層細(xì)胞,在不同時(shí)間下測(cè)定其OD值,可OD值的高低間接反映出ST的生長(zhǎng)情況。ST細(xì)胞在48h貼壁基本完成,在96h后,細(xì)胞因培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡、pH改變及代謝產(chǎn)物等因素,細(xì)胞開始慢慢衰老。因此,本文選定48h和96h時(shí)測(cè)定其OD值,結(jié)果見表2。

從表2看出,在48h和96h時(shí),APC小于等于100μg/mL各處理組的OD值與空白對(duì)照組的OD值相當(dāng)或稍高；當(dāng)APC小于60μg/mL各處理組的OD值,隨著濃度增加而對(duì)應(yīng)的OD值隨之升高,均比對(duì)照組的OD值較高,都能顯著地促進(jìn)了ST細(xì)胞的生長(zhǎng),說明APC小于100μg/mL對(duì)ST生長(zhǎng)有利或者無細(xì)胞毒性作用；APC濃度大于100μg/mL各處理組,其OD值與細(xì)胞對(duì)照相比,呈下降趨勢(shì),并且差異顯著(p<0.05),說明APC濃度高于100μg/mL 對(duì)ST生長(zhǎng)受到不同程度毒害作用。APC在低濃度下,對(duì)ST細(xì)胞生長(zhǎng)無毒性作用,但是濃度大于100μg/mL,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。在48h時(shí),140μg/mL高濃度的OD值為0.377,與對(duì)照OD值0.582相比,OD值降低了0.205,差異顯著；同時(shí)在96h時(shí),140μg/mL高濃度的OD值為0.702,對(duì)照組為0.926,OD值降低幅度到達(dá)0.224,由此說明APC對(duì)ST細(xì)胞生長(zhǎng)無影響的最大安全濃度。本研究體外實(shí)驗(yàn)加入APC,對(duì)正常ST細(xì)胞生長(zhǎng)無細(xì)胞毒性作用,APC濃度超過100μg/mL,各細(xì)胞組存活情況顯著下降,提示100μg/mL是APC對(duì)ST細(xì)胞的最大安全濃度。APC是優(yōu)良的天然抗氧化劑,徐亞民[9]等研究發(fā)現(xiàn)紫甘藍(lán)花色苷具有抗氧化性,對(duì)細(xì)胞免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用,因此APC在一定濃度范圍內(nèi)可能增強(qiáng)了ST細(xì)胞機(jī)能,從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。因此,通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)得出100μg/mL是APC對(duì)ST單層細(xì)胞生長(zhǎng)無副作用的最大安全濃度。

2.3 紫甘藍(lán)花色苷體外抑制TGEV活性的研究

本文在100μg/mL APC的最大安全濃度范圍下,從預(yù)防作用和治療作用兩方面來探討APC抑制TGEV增殖的活性效果。向ST單層細(xì)胞預(yù)先加入APC于孵育后,再加入TGEV病毒孵育,即為APC體外的預(yù)防作用,而預(yù)先加入TGEV病毒孵育再接入APC,即為APC體外的治療作用。圖2顯示,以正常ST細(xì)胞為對(duì)照,其存活率以100%計(jì)；在48h時(shí),病毒組已出現(xiàn)嚴(yán)重病變,其ST細(xì)胞存活率約為20%；而接入不同濃度APC處理后的ST細(xì)胞存活率,預(yù)防作用和治療作用的細(xì)胞存活率均比病毒組存活率高,并隨著APC濃度增加而細(xì)胞存活率呈上升趨勢(shì),差異顯著,尤其在APC濃度為100μg/mL預(yù)防作用的細(xì)胞存活率達(dá)到80%,治療作用的細(xì)胞存活率接近70%,說明通過在體外接入不同濃度的APC對(duì)TGEV增殖起到抑制作用,一定時(shí)間內(nèi)能減慢細(xì)胞的病變。從圖2也可以看出,APC在同一濃度下,其預(yù)防作用明顯比治療作用的細(xì)胞存活率較高,提示通過預(yù)先接入APC能增強(qiáng)細(xì)胞的抵抗病毒的能力。由此,說明了與TGEV病毒對(duì)照組比較,在一定時(shí)間內(nèi),APC能保護(hù)ST的細(xì)胞正常機(jī)能,抑制TGEV增殖和延長(zhǎng)ST細(xì)胞的脫落時(shí)間。

圖2 不同濃度紫甘藍(lán)花色苷體外抑制TGEV的作用(48h)Fig.2 Influence of prevention and treatment on TGEV under different concentration of APC(48h)

圖3顯示,在72h時(shí),APC抗TGEV的活性作用。細(xì)胞生長(zhǎng)至72h時(shí),TGEV病毒組存活率基本趨近于零,而不同濃度APC處理組,其ST細(xì)胞存活率均顯著高于病毒對(duì)照組,并呈劑量依賴關(guān)系,同時(shí)預(yù)防作用的細(xì)胞存活率比治療作用較高,提示APC對(duì)TGEV的預(yù)防作用比治療作用明顯,這與紫甘薯花色苷抗TGEV效果一致[10]。當(dāng)同一APC濃度為100μg/mL時(shí),預(yù)防作用方面,72h的細(xì)胞存活率接近20%,而48h的存活率約為80%；治療作用方面,72h的細(xì)胞存活率約15%,而48h的存活率約為70%,這一結(jié)果說明:APC相同濃度隨著時(shí)間的推移,ST細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì),其抗TGEV增殖能力逐漸下降。各濃度APC處理對(duì)受TGEV病毒感染ST細(xì)胞的預(yù)防和治療作用趨勢(shì)一致,呈劑量依賴關(guān)系,由此顯示了一定濃度的APC處理下,能明顯抑制TGEV在ST細(xì)胞上的生長(zhǎng)。研究表明,花色苷具有抗氧化作用[9],能降低細(xì)胞凋亡,由此推斷APC可能通過提高機(jī)體抗氧化酶類活性,防止細(xì)胞膜磷酸化,減少自由基釋放,能阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑,從而起到減慢TGEV于ST細(xì)胞核內(nèi)的增殖作用。因此,在飼養(yǎng)方面可以適當(dāng)為畜禽補(bǔ)給紫甘藍(lán)綠色蔬菜,能增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力,提高其免疫能力,起到一定預(yù)防作用。

圖3 不同濃度紫甘藍(lán)花色苷體外抑制TGEV的作用(72h)Fig.3 Influence of prevention and treatment on TGEV under different concentration of APC(72h)

2.4 紫甘藍(lán)花色苷與TGEV對(duì)ST細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

細(xì)胞病變程度是反映藥物抗病毒效果的經(jīng)典指標(biāo)。ST單層細(xì)胞受TGEV病毒感染后,單層細(xì)胞病變表現(xiàn)為形態(tài)改變、細(xì)胞脫落,而這一病變[11]在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到。圖4A顯示了正常ST單層細(xì)胞,呈長(zhǎng)梭形,大小均勻；加入APC質(zhì)量濃度為20μg/mL處理后(圖4B),ST單層細(xì)胞形態(tài)與正常一致,無空隙,很少細(xì)胞脫離單層,不影響細(xì)胞生長(zhǎng)；圖4C為加入APC質(zhì)量濃度為100μg/mL處理后ST細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)量較圖4A和4B相對(duì)較少,但不影響細(xì)胞形態(tài)。圖4D顯示ST細(xì)胞受TGEV病毒感染,單層細(xì)胞形態(tài)完全改變,大部分細(xì)胞脫離單層,發(fā)生嚴(yán)重的病變；APC 20μg/mL作用于TGEV誘導(dǎo)的ST細(xì)胞形態(tài),有少量細(xì)胞存在,但細(xì)胞均腫大、細(xì)胞間隙大,如圖4E顯示。圖4F顯示APC100μg/mL作用于TGEV誘導(dǎo)的ST細(xì)胞形態(tài),有部分細(xì)胞已脫離單層,細(xì)胞腫大,病變情況比圖4D、圖4E較好,說明APC較高濃度抗TGEV能力較強(qiáng)。從形態(tài)學(xué)方法得出,APC對(duì)TGEV病毒增殖有一定的抑制作用,一定時(shí)間內(nèi)能保護(hù)ST的細(xì)胞形態(tài)。

圖4 APC對(duì)ST細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)Fig.4 Effect of APC on ST morphology under microscope(× 100)注:A:ST細(xì)胞對(duì)照;B:ST+APC 20μg/mL; C:ST+APC 100μg/mL;D:TGEV病毒對(duì)照; E:TGEV+APC 20μg/mL;F:TGEV+APC 100μg/mL。

3 結(jié)論

本研究鑒定了紫甘藍(lán)含有13種不同花色苷,其中主要成分為矢車菊色素的葡萄糖苷；APC對(duì)ST生長(zhǎng)無細(xì)胞毒性作用的最大安全質(zhì)量濃度為100μg/mL；通過預(yù)防和治療作用探討,APC能夠顯著抑制TGEV誘導(dǎo)的ST細(xì)胞形態(tài)變化,且抑制程度成劑量關(guān)系,提高細(xì)胞存活率。因此,紫甘藍(lán)花色苷具有抗病毒生物活性,在體外具有抗TGEV病毒功能,能對(duì)ST細(xì)胞起到保護(hù)作用。

[1]Panagiotis A.,Chadotta T. Pressurized solvent extraction and monolithic column-HPLC/DAD analysis of anthocyanins in red cabbage[J]. Talanta,2008,74:1218-1223.

[2]王磊. 紫甘藍(lán)汁抗氧化成分及其活性研究[J]. 中國(guó)食品工業(yè),2011,2:60-61.

[3]Cooke D,Steward WP,Gescher AJ,etal. Anthocyans from fruits and vegetables-Does bright colour signal cancer chemopreventive activity?[J]. European Journal of Cancer,2005,41:1931-1940.

[4]楊曉玲,郭彥東. 紫甘藍(lán)色素的穩(wěn)定性及抑菌性[J]. 食品科學(xué),2010,31(23):32-35.

[5]吳國(guó)平,尹燕博,吳時(shí)友. 豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志,2003,39(2):29-32.

[6]王倩,汪云,宦衛(wèi)青,等. 紫甘藍(lán)色素的提取及組分的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2010,22:1057-1106.

[7]劉玉芹. 高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析紫甘藍(lán)和羽衣甘藍(lán)中花色苷[J]. 分析化學(xué),2011,39(3):419-424.

[8]Ferrari M,Fornasiero M C,Isetta A M. MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activityinvitro[J]. Journal of Immunological Methods,1990,131:165-172.

[9]徐亞民,趙曉燕,馬越,等. 紫甘藍(lán)色素抗氧化能力的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2006,27(11):59-62.

[10]雷用東,陳姍姍,趙曉燕,等. 紫甘薯花色苷制備及其抗豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)活性的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(21):349-352.

[11]房紅瑩,羅滿林. 豬傳染性胃腸炎病毒反向遺傳研究進(jìn)展[J]. 畜牧與獸醫(yī),2008,40(4):87-91.

Analysis of the anthocyanin profiles andanti-TGEV activity from purple cabbage

LEI Yong-dong1,WEI Xiang-li1,LUO Xiao-ling1,*,TONG Jun-mao2,ZHAO Xiao-yan3

(1. Supervision and Testing Center for Food Quality Ministry of Agriculture,Shihezi 832000,China;2. College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China;3. Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing 100097,China)

To explore the inhibitory action of anthocyanins from purple cabbage(APC)for transmissible gastroenteritis virus of swine(TGEV)invitro. APC powder as raw material,the sample of anthocyanins structure were identified by HPLC-MS method,APC were acted on disseminated TGEV in monolayer ST cells,then its influence on the morphological changes as well as cell survival were researched,it was evaluated whether APC had the active role of anti-TGEV. The results showed that the purple cabbage contained at least 13 kinds of anthocyanins,the main component was cyaniding-glucosides. The maximum safe mass concentration of APC was 100μg/mL for ST cells nontoxicity. Introduced TGEV to ST,APC could restrain ST cell morphological changes and less death rate under the 100μg/mL. In summary,anthocyanins from purple cabbage had significantly anti-TGEV biological activity.

Anthocyanins from purple cabbage;ST cell;TGEV;biological activity

2014-04-18

雷用東(1988-)，男，碩士，研究方向：果蔬貯藏與加工。

*通訊作者:羅小玲(1962-)，女，博士，研究員，研究方向：食品檢測(cè)。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972048)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)03-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.011