江蘇東部沿海四種低值貝類軟體中牛磺酸動態(tài)積累規(guī)律與適宜采收期研究

李 娜,王欣之,2,吳 皓,2,*,易瑞灶,劉 睿,2,王令充,2,賀蓓蓓,謝冬云,陳 濤

(1.南京中醫(yī)藥大學,江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,江蘇南京 210023；2.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023；3.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005)

江蘇東部沿海四種低值貝類軟體中?；撬釀討B(tài)積累規(guī)律與適宜采收期研究

李 娜1,王欣之1,2,吳 皓1,2,*,易瑞灶3,劉 睿1,2,王令充1,2,賀蓓蓓1,謝冬云1,陳 濤1

(1.南京中醫(yī)藥大學,江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,江蘇南京 210023；2.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023；3.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005)

以采自江蘇東部沿海的文蛤、青蛤、四角蛤蜊及菲律賓蛤仔四種低值貝類為樣本,研究其軟體中?；撬岬膭討B(tài)變化規(guī)律,探討這四種貝類的最適采收期。建立以鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化結合HPLC-UV測定?；撬岬姆椒?以Kromasil 50mm×2.1mm C18為分離柱,甲醇-0.05mol/L乙酸鈉(pH6.0)23∶77為流動相,流速0.3mL/min洗脫,紫外檢測波長為330nm。該方法可以準確測定四種貝類軟體中?；撬岬暮?且靈敏度高,重現(xiàn)性好。貝類的生長具有明顯季節(jié)性,一般春夏季較秋冬季生長較快,尤其夏季水溫為25～28℃時為快速生長期,此時,貝類軟體中?；撬岷窟_到最高。菲律賓蛤仔牛磺酸含量最高在7月,約為42.79mg/g；而文蛤、青蛤、四角蛤蜊軟體中?；撬岷孔罡咴?月,分別約為27.48、16.59、15.00mg/g。若從產量和有效成分?；撬岬暮孔兓暇C合考慮,建議菲律賓蛤仔牛磺酸最佳采收期為7月,文蛤、青蛤、四角蛤蜊最佳采收期為6月。

牛磺酸,高效液相色譜法,采收期,貝類軟體

?；撬?Taurine)又稱為2-氨基乙磺酸,是一種含硫的β-氨基酸,具有廣泛的生物學效應,主要體現(xiàn)在:促進大腦發(fā)育[2-3]；增強細胞抗病毒侵害能力[4]；增強心血管系統(tǒng)的功效[5-6]；保護神經系統(tǒng)[7]、免疫系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)[8]的作用；抗衰老、抗高血壓和高血脂[9]；防治糖尿病[10]；抗腫瘤活性[11]等幾個方面。

國內外市場上使用的牛磺酸有化學合成?；撬岷吞烊慌；撬?。其中廣泛使用的為化學合成品,但化學合成的?；撬岽嬖谠隙拘源?、工藝操作復雜、環(huán)境污染等嚴重問題[12],隨著生活水平的提高和綠色化學的進展,人們越來越提倡使用天然提取的?；撬?。天然牛磺酸主要存在于海產品及哺乳動物的幾乎所有臟器中,尤其是在海洋貝類軟體中,且以游離形式存在[13],故從海洋貝類中提取天然?；撬峋哂泻艽蟮膽们熬?。江蘇省沿海灘涂面積廣大,灘涂海洋生物資源豐富,其中四角蛤蜊、文蛤、青蛤、菲律賓蛤仔等貝類資源尤為豐富。因此,了解這些貝類軟體中牛磺酸的蘊藏量,總結不同采收期貝類軟體中?；撬岬膭討B(tài)積累規(guī)律,對江蘇沿海貝類的品質分析以及天然?；撬豳Y源的開發(fā)具有重大的科學指導意義。

目前,鮮有海洋貝類軟體中?；撬岷繙y定方法的研究,更缺乏貝類軟體中?；撬岬膭討B(tài)變化規(guī)律的報道。因此,本文通過鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化結合HPLC法[14],首次對江蘇東部沿海所產的不同采收期的菲律賓蛤仔、文蛤、青蛤以及四角蛤蜊中牛磺酸的含量進行系統(tǒng)研究,探討在一年之中四種貝類軟體中?；撬岬膭討B(tài)變化規(guī)律,以期了解江蘇沿海貝類的品質,并確定其最佳的采收期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菲律賓蛤仔、文蛤、青蛤、四角蛤蜊軟體(批號:201208-201307),由江蘇省海洋水產研究所提供,經江蘇省海洋水產研究所萬夕和研究員鑒定來源分別為:簾蛤科動物菲律賓蛤仔、文蛤和青蛤,蛤蜊科動物四角蛤蜊。

?；撬針藴势?純度大于99% 上海國藥集團化學試劑有限公司；甲醇 色譜純,美國TEDIA 天地試劑有限公司；鄰苯二甲醛 上海國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、硼酸、磷酸二氫鉀、乙酸鈉等分析純試劑,均為南京化學試劑有限公司生產的產品。

衍生化試劑的制備:稱取0.5g 鄰苯二甲醛于100mL容量瓶中,加10mL甲醇溶解,再加入5mL 2-巰基乙醇,并用硼酸鈉緩沖液(0.4mol/L,pH9.5,NaOH 調制)定容至100mL。密封后置于4℃冰箱中避光保存。在使用過程中,每隔兩天加入1mL 的2-巰基乙醇,使用期限1周[15]。

Waters 2695高效液相色譜儀 Waters 2489 UV/Visible Detector檢測器 美國Waters公司；TGL-16G型高速離心機 上海安亭科學儀器廠；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BT-125D型電子分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；UNIQUE-s15超純水機 廈門銳思捷科學儀器有限公司；LABCONCO凍干機 美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 分離柱:Kromasil C18(2.5mm×50mm)；流速0.3mL/min,進樣體積2μL,流動相A為甲醇,流動相B為0.05mol/L乙酸鈉溶液(pH6.0,冰醋酸調制),VA∶VB=23∶77,等度洗脫；紫外檢測器,波長330nm；柱溫40℃。?；撬釋φ掌芳八姆N貝類軟體樣品的色譜圖見圖1。

圖1 ?；撬針藴?A)、樣品(B菲律賓蛤仔、 C文蛤、D青蛤、E四角蛤蜊)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Taurine solution of standards(A)and samples(B,C,D,E)

1.2.2 衍生劑濃度 稱取OPA 500mg溶解于10mL甲醇中,加入1mL 2-巰基乙醇,并加入硼酸鈉緩沖液定容于100mL 容量瓶中,搖勻,避光放置,使用前加硼酸鈉緩沖液稀釋為濃度分別為0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、5mg/mL的系列濃度,依法衍生。

1.2.3 衍生反應時間 在其他條件不變的情況下,精密吸取1mL 0.20014mg/mL的?；撬釋φ掌啡芤号c1mL 5mg/mL OPA反應液進行不同時間的反應,然后通過柱分離測定其峰面積。

1.2.4 流動相考察 分別選擇不同配比的流動相甲醇-純水(80∶20、70∶30、60∶40、55∶45、30∶70)、甲醇-酸水(70∶30、60∶40、45∶55、30∶70)、甲醇-乙酸鈉水溶液(75∶25、40∶60、35∶65、23∶77),進行?；撬針藴势泛蜆悠返纳V分離實驗。

1.2.5 檢測波長的選擇 取牛磺酸對照品適量,用蒸餾水配成50mg/L濃度的對照品溶液。取該對照品溶液1mL于10mL容量瓶中,加入OPA衍生試劑1mL,搖勻,室溫反應1.5min后,立即加入0.1mol/L磷酸二氫鉀終止液1mL,搖勻,加甲醇定容至刻度。進行紫外全波掃描,確定最佳檢測波長。

1.2.6 提取條件考察 分別考察提取方法、提取溶劑、提取溶劑比例、提取時間及提取次數(shù)對貝類軟體中?；撬崽崛⌒Ч挠绊憽Ｌ崛》椒?提取溶劑純水、提取溶劑比例1∶30、提取時間60min,比較超聲提取與水煎煮加熱回流提取兩種提取方法的提取效率。提取溶劑:超聲提取,溶劑比例1∶30、提取時間60min,分別考察比較不同提取溶劑(純水、不同比例的甲醇溶液、不同比例的乙醇溶液)對?；撬岬奶崛⌒省Ｌ崛∪軇┍壤?超聲提取,70%乙醇,提取時間60min,不同溶劑提取比例1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。提取時間:超聲提取,70%乙醇,提取比例1∶30,提取時間分別為30、60、90、120min。

提取次數(shù):超聲提取,70%乙醇,溶劑比例1∶30,提取60min,提取次數(shù)分別為1、2、3次。

1.2.7 供試品溶液的制備 將購置的貝類軟體置于籃中,化凍,洗凈,靜置過夜,勻漿,于凍干機上凍成干粉。即為實驗中所用的貝類軟體的凍干粉。

取貝類軟體凍干粉約0.5g,精密稱定,置于100mL具塞錐形瓶中,加70%乙醇溶液15mL,超聲處理(功率300W,頻率100kHz)60min 后,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,再向殘渣中加入15mL 70%乙醇溶液,超聲處理60min,重復三次,合并續(xù)濾液,并定容至50mL 容量瓶中,保存?zhèn)溆肹16]。

精密量取上述對照品溶液和供試品溶液各1mL,分別置10mL量瓶中,各加入鄰苯二甲醛(OPA)衍生試劑1mL,搖勻,室溫反應1.5min 后,立即加入0.1mol/L磷酸二氫鉀終止液1mL,搖勻,加甲醇定容至刻度,即得。

1.2.8 對照品儲備溶液的制備及標準曲線的繪制 取?；撬釋φ掌愤m量,精密稱定,加蒸餾水制成每1mL含1.0007mg的溶液。

分別移取1.0007mg/mL牛磺酸標準溶液0.1、0.5、1、2、5、8mL于10mL容量瓶中,加超純水定容至刻度,搖勻,得到7個濃度系列的牛磺酸標準品溶液。分別精密吸取以上各濃度對照品溶液,依法進行衍生化反應,過0.45μm微孔濾膜,吸取2μL注入Waters 2695高效液相色譜儀中進行測定。

1.2.9 加樣回收率實驗 稱取?；撬釋φ掌?.06010g,精密稱定,加蒸餾水定容至10mL。取文蛤(201208)凍干粉0.25g,精密稱定,按80%、100%、120%的比例加入對照品,每個比例平行三份,再分別加入70%乙醇溶液補足到15mL,依照樣品處理方法處理,保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與討論

2.1 衍生反應條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生劑濃度 從圖2可以看出,當衍生試劑濃度小于1mg/mL時峰面積隨衍生試劑濃度的增大而增大,表明在此濃度范圍內衍生反應不充分。濃度在1.0～5mg/mL時峰面積穩(wěn)定。為保證衍生反應完全,確定衍生試劑的濃度為5mg/mL。

圖2 衍生劑濃度對?；撬酧PA衍生物色譜峰面積的影響Fig.2 Effect of OPA concentration on HPLC peak area of Taurine OPA derivation

2.1.2 衍生反應時間 衍生反應時間的長短對?；撬崤cOPA反應的程度有著直接的關系。時間過短,則反應不徹底；時間過長,則會使OPA衍生物迅速破壞。這都將影響檢測結果的準確性或者重現(xiàn)性。因此,準確的控制衍生反應時間將是整個測定的關鍵。從圖3可以看出,衍生時間不同,峰面積會有所變化,在衍生時間1.5min時峰面積達到最大,其檢測靈敏度最高,隨后開始下降,所以應將衍生時間準確控制在1.5min。

圖3 衍生反應時間對?；撬酧PA 衍生物色譜峰面積的影響Fig.3 Effect of reaction time on HPLC peak area of Taurine OPA derivation

2.2 色譜條件

實驗研究表明,隨著流動相中甲醇比例的減少,牛磺酸的出峰時間明顯推遲,且?；撬岬姆逍巫儗挕．斶x用甲醇-純水、甲醇-酸水時,牛磺酸的峰形很寬且拖尾很嚴重；當選用甲醇-0.05mol/L乙酸鈉作為流動相,在流速為0.3mL/min,甲醇-0.05mol/L乙酸鈉水溶液(pH6.0),23∶77,?；撬岬某龇鍟r間是9.805min,此時,樣品中?；撬岱迮c其鄰峰可以達到完全分離。

2.3 檢測波長的選擇

紫外全波掃描結果顯示,牛磺酸在330nm處有一個很大的吸收峰,故選擇330nm作為?；撬岬臋z測波長。

2.4 提取條件的考察

2.4.1 提取方法 實驗中分別考察了超聲提取和水煎煮加熱回流提取兩種方法的提取效率,結果顯示,超聲三次和水煎煮加熱回流三次提取出的?；撬岷肯嘟?考慮操作的復雜程度,選擇超聲提取的方法提取牛磺酸。結果見圖4a。

2.4.2 提取溶劑 提取溶劑分別為純水、不同比例的甲醇溶液、不同比例的乙醇溶液對牛磺酸的提取效率見圖4b。由圖4b可知,甲醇作為溶劑對?；撬岬奶崛⌒Ч黠@低于乙醇,故選擇乙醇作為提取溶劑。同時考察不同濃度的乙醇可知,隨著乙醇的提高,?；撬岬奶崛÷食氏壬吆笙陆档淖兓厔?提取溶劑為70%乙醇?；撬岬奶崛⌒Ч詈?。乙醇濃度升高可以增大?；撬岬娜芙舛?進而提高提取效果,但是當乙醇濃度為100%時會造成牛磺酸的含量下降。

2.4.3 提取溶劑比例 提取溶劑比例分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50對?；撬岬奶崛⌒室妶D4c。由圖4c可知,在溶劑比例為1∶10～1∶50范圍內,?；撬岬奶崛『侩S著溶劑比例的升高而提高,當溶劑比例大于1∶30時,牛磺酸的提取含量不再增長,故提取溶劑的比例為1∶30。

2.4.4 提取時間 提取時間分別為30、60、90、120min時?；撬岬奶崛⌒Ч妶D4d。從圖4d可以看出,在30～60min范圍內,四種貝類軟體中牛磺酸的提取含量隨提取時間的延長而升高,之后若再延長時間,提取率不再增長。在一定范圍內延長提取時間有利于牛磺酸的充分溶出,但提取時間過長,雖能增加?；撬岬奶崛÷?但需要耗費太多的時間、精力及功耗,考慮經濟,最后提取時間定為60min。

2.4.5 提取次數(shù) 提取次數(shù)分別為1、2、3、4次的提取效果見圖4e。由圖4e可以看出,?；撬岬奶崛『繒S著提取次數(shù)的增加而提高。在一定范圍內增加提取次數(shù),能夠使牛磺酸的提取含量顯著升高；但提取次數(shù)過多,雖能稍微提高?；撬崽崛⌒Ч?卻需要耗費更多的時間、能耗。綜合考慮,提取次數(shù)為3次。

圖4 不同提取方法對牛磺酸OPA衍生物含量的影響Fig.4 Effect of different extraction methods on the content of Taurine OPA derivation

2.5 線性關系考察

以各色譜峰的峰面積為縱坐標Y,濃度(μg/mL)為橫坐標X,計算回歸方程。進樣濃度與峰面積呈良好的線性正相關,相關系數(shù)R2=0.9995,回歸方程y=13098x-1696.3。取對照品溶液,用蒸餾水依次稀釋制成一系列由高到低的梯度濃度溶液,然后進行衍生化反應,測定峰面積為噪音3倍(S/N=3)時進樣濃度的檢出限(LOD)為0.5003μg/mL:測定峰面積為噪音10倍(S/N=10)時進樣濃度的定量限(LOQ)為1.5011μg/mL。

2.6 精密度實驗

分別精密移取“2.5”項下0.20014、0.010007mg/mL和0.80056mg/mL牛磺酸對照品溶液,依法衍生,每種濃度平行處理3份,當日連續(xù)進樣6次,則日內精密度RSD分別為2.82%、2.35%、1.70%。此外,連續(xù)三天分別進樣3次,記錄峰面積,并計算三種濃度點日間精密度RSD值分別為1.89%、2.69%、2.33%。

2.7 重現(xiàn)性實驗

取文蛤軟體凍干粉(2012.8)0.5g,精密稱定,按供試品溶液制備方法平行制備6份,依法衍生,經0.45μm微孔濾膜,吸取2μL進樣,每個樣品平行測定3次,記錄峰面積,計算其中牛磺酸的平均值為23.60g/kg,RSD值為1.88%。

2.8 穩(wěn)定性實驗

移取“2.7”項下樣品1溶液,依法衍生,經0.45μm微孔濾膜,每隔半個小時進樣一次(2μL),觀察測定時間對待測物穩(wěn)定性的影響。在衍生反應后的4h之內,測得的?；撬岷康腞SD值小于5%；而4h后,測得的?；撬岷康腞SD值大于5%。結果如圖5。所以,在4h之內,衍生物是穩(wěn)定的。

圖5 衍生物穩(wěn)定性實驗結果Fig.5 Stability experiment results of Taurine OPA derivation

表2 菲律賓蛤仔、文蛤、青蛤和四角蛤蜊不同采收時間軟體原料中?；撬岷繙y定結果Table 2 Contents of Taurine in different harvest time of Ruditapes philippinarum, Meretrix meretrix Linnaeus,Cyclina sinensis,and Mactra veneriformis Reeve

2.9 加樣回收率實驗

分別移取上述溶液1mL,依法衍生,進樣分析,記錄峰面積,采用外標法計算其中牛磺酸的濃度。結果見表1。

表1 回收率實驗結果Table 1 Recovery experiment results

2.10 樣品含量測定

分別取菲律賓蛤仔、青蛤、文蛤、四角蛤蜊蛤的軟體2012年8月～2013年7月共12個月的凍干粉0.5g,精密稱定,每份樣品平行處理三份,按“1.2.7”項下方法制備樣品溶液及衍生化反應,按“1.2.1”項下色譜條件進行測定,進樣量2μL,測得峰面積,由峰面積外標法定量,結果見表2。

從表2可以看出,四種貝類軟體中都含有較為豐富的?；撬?其中,菲律賓蛤仔軟體中牛黃酸的含量是相對較高的,其含量在13.50～42.79mg/g范圍之內,且最高是在七月份,約為42.79mg/g。其次是文蛤軟體,含量為14.61～27.48mg/g,其中含量最高是在六月份,約為27.48mg/g。而青蛤和四角蛤蜊軟體中牛磺酸的含量是很接近的,分別為7.62～16.59、9.09～15.00mg/g,且二者的最高含量的月份是在六月份,分別約為16.59、15.00mg/g。

3 結論

鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化結合HPLC-UV測定?；撬崾菄沂称窐藴手兴捎玫姆治龇椒?OPA與巰基試劑在堿性條件下與?；撬嵫杆侔l(fā)生衍生反應,生成唯一的衍生產物,該產物具有紫外和熒光吸收。已有研究報道,高加龍等人[16]采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化結合HPLC-UV測定馬氏珍珠貝中牛磺酸含量。故本課題組也嘗試首次采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生化結合HPLC-UV測定四角蛤蜊、文蛤、青蛤、菲律賓蛤仔軟體中牛磺酸含量,結果表明衍生產物穩(wěn)定,準確性高,精密度好,在330nm處有良好吸收。

四種貝類軟體最佳采收期的確定(以?；撬釣橹笜顺煞?:從表2可以看出,四角蛤蜊、文蛤、青蛤、菲律賓蛤仔四種貝類軟體均含有豐富的?；撬?其中以6、7月份中?；撬岬暮肯鄬^高。四種貝類中牛磺酸的含量相比較而言,菲律賓蛤仔軟體中含有?；撬岬暮渴亲罡叩?尤其是7月份,最高可達約42.79g/kg,其次是文蛤,其軟體中?；撬岷孔罡呤窃?月份,約為27.48g/kg。而青蛤和四角蛤蜊軟體中?；撬岬暮肯鄬^低且含量也較接近,含量最高都是在6月份,分別為16.59、15.00g/kg。

貝類的生長具有較為明顯的季節(jié)性,一般春夏季生長較快,其中夏季水溫25～28℃時是它的快速生長期,秋冬季生長緩慢。通常在5月至7月期間是貝類生長繁殖最為旺盛,各種營養(yǎng)成分也較為豐富,肥滿度也是最高的,由此我們推測,若從產量和有效成分?；撬岬暮孔兓暇C合考慮,菲律賓蛤仔最佳采收期在7月,而文蛤、青蛤、四角蛤蜊最佳采收期在6月。本實驗通過探討并總結一年之中四種貝類軟體中?；撬岬膭討B(tài)變化規(guī)律,證實海洋貝類軟體含有豐富的?；撬?其對沿海貝類的品質分析具有重大的科學指導意義,且能夠為天然牛磺酸資源的利用提供理論依據(jù)。

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Study on the dynamic accumulation of taurine in four shellfish fleshof Jiangsu east costal and the appropriate harvest times

LI Na1,WANG Xin-zhi1,2,WU Hao1,2,*,YI Rui-zao3,LIU Rui1,2,WANG Ling-chong1,2,HE Bei-bei1,XIE Dong-yun1,CHEN Tao1

(1.Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;2.Jiangsu collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization,Nanjing 210023,China；3.The 3rd Institute of Oceanography State Oceanic Administration,Xiamen 361005,China)

Four kinds of shellfish from the east coast of Jiangsu province were collected to research the dynamic changes of taurine in the shellfish flesh,in order to investigate the appropriate harvest times. To determine the content of taurine,a method of HPLC-UV combined with opthaldialdehyde was established,and the samples extracted by 70% alcohol were separated by a Kromasil 50mm×2.1mm C18column with the column temperature of 40℃. The mobile phase was composed of 23% methanol and 77% 0.05mol/L sodium acetate(pH6.0)at the flow rate of 0.3mL/min with gradient elution. The UV detection wavelength was 330nm. This method,with high sensitivity,good reproducibility,could accurately determine the content of taurine in four shellfish. Generally,the growth of shellfish had an obvious seasonal characteristic and its growth faster in spring and summer than autumn and winter,especially when water temperature was 25 to 28℃ in summer-the rapid growth period. During the period,the content of taurine reached its peak. Moreover,the content of taurine ofRuditapesphilippinarumreached highest was July,with 42.79mg/g.MeretrixmeretrixLinnaeus,Cyclinasinensis,MactraveneriformisReeve was in June,when the content of taurine was up to 27.48,16.59,15.00mg/g,respectively. In combination production with content changes of effective constituent-taurine,the best harvest time ofRuditapesphilippinarumwas recommended in July,withMeretrixmeretrixLinnaeus,Cyclinasinensis,MactraveneriformisReevewas in June.

Taurine；HPLC；harvest time；shellfish flesh

2014-05-04

李娜(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：海洋藥物。

*通訊作者:吳皓(1957-)，女，博士，教授，從事海洋藥物研究開發(fā)以及中藥質量標準研究。

國家公益性行業(yè)專項基金(201305007)。

TS254.1

A

1002-0306(2015)03-0054-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.002