漆斑菌Myrothecium sp.IMER1液體和固體發(fā)酵產(chǎn)膽紅素氧化酶分析

劉友勛++閆明陽(yáng)++黃娟++趙春澎

摘 要：為了提高漆斑菌Myrothecium sp.IMER1的膽紅素氧化酶（bilirubin oxidase，BOX）產(chǎn)量，分析了其液體和固體發(fā)酵產(chǎn)酶的特性。首先分析了該菌株液體和固體發(fā)酵產(chǎn)BOX的時(shí)間變化曲線，對(duì)其所產(chǎn)的胞外酶進(jìn)行了活性電泳，進(jìn)一步分析了其液體產(chǎn)酶的模型和宏觀動(dòng)力學(xué)內(nèi)容。結(jié)果表明，菌株IMER1在液體發(fā)酵中第5天的產(chǎn)BOX酶量最大，其固體發(fā)酵產(chǎn)酶量最大時(shí)間也是在第5天，但是，其固體發(fā)酵能持續(xù)高產(chǎn)BOX。從BOX的底物活性顯色中可知，在固體和液體發(fā)酵的粗酶液中都能檢測(cè)到BOX，并且沒(méi)有同工酶出現(xiàn)；而B(niǎo)OX生物合成模式為中期合成型，通過(guò)數(shù)據(jù)計(jì)算和模擬得出了產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程。

關(guān)鍵詞：膽紅素氧化酶；漆斑菌；液體發(fā)酵；固體發(fā)酵

中圖分類號(hào)：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2015.09.005

膽紅素是一類線形四吡咯衍生物。在人體內(nèi)，如果不能及時(shí)去除由于血紅素降解而產(chǎn)生的膽紅素，那么，過(guò)多的膽紅素不僅會(huì)使皮膚變黃，產(chǎn)生黃疽，而且還具有明顯的神經(jīng)毒性，會(huì)導(dǎo)致耳聾、精神遲鈍和大腦麻癉，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)致死。膽紅素氧化酶（bilirubin oxidase，BOX，EC.1.3.3.5）是一種含銅的多酚氧化酶，它能催化膽紅素氧化，而且氧氣是其電子受體，具體的反應(yīng)過(guò)程為BOX催化膽紅素生成膽綠素，后者可進(jìn)一步氧化，最終生成性質(zhì)還不清楚的無(wú)色化合物。最早，BOX是在荷蘭豬腦中被發(fā)現(xiàn)的，隨后又發(fā)現(xiàn)了多種真菌，比如食用雙孢蘑菇、青霉屬和漆斑菌屬也能分泌該酶。但是，自從日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)漆斑菌屬能高產(chǎn)BOX后，在臨床醫(yī)學(xué)中，開(kāi)始嘗試使用該酶來(lái)測(cè)定膽紅素。這種方法具有特異性、靈敏高和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床手工或自動(dòng)化檢測(cè)中。近年來(lái)，BOX的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸拓寬，被用于生物電池的制造、污水處理等研究中。最近也有文獻(xiàn)報(bào)道指出，芽孢桿菌的孢子外殼蛋白也具有BOX活性，但是，細(xì)菌的BOX氧化能力比真菌的氧化能力要低，所以，工業(yè)生產(chǎn)BOX還是以漆斑菌發(fā)酵產(chǎn)酶為主。鑒于BOX應(yīng)用范圍的日益廣泛，對(duì)其酶的需求量也在逐年提高，而如何改善漆斑菌發(fā)酵產(chǎn)BOX的能力，是目前面臨的一大難題。在前期實(shí)驗(yàn)中，篩選到了一株能產(chǎn)生BOX的漆斑菌（Myrothecium sp.IMER1），本文擬通過(guò)分析其液體和固體發(fā)酵產(chǎn)酶的相關(guān)特性，為提高菌株IMER1產(chǎn)BOX的能力打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器

供試菌株 IMER1（Myrothecium sp.IMER1）；2，2-連氮-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）銨（ABTS，美國(guó)SIGMA公司）；馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯20%（削片煮水），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖；固體培養(yǎng)基：麩皮5 g，水15 mL。

UNICO-UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度儀（上海尤尼柯儀器有限公司）；TGL-16/TGL16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀集團(tuán)）；ZD-88全溫氣浴振蕩搖床（金壇市成輝儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體培養(yǎng)

通常情況下，IMER1菌株的PDA斜面種5～7 d便可產(chǎn)生大量的分生孢子，用適量的蒸餾水將試管中的孢子沖洗出來(lái)，利用顯微計(jì)數(shù)，將孢子數(shù)量調(diào)整到1×108/mL，用前將孢子懸浮液搖勻。用移液槍吸取1 mL孢子液注射入滅菌后100 mL的液體培養(yǎng)基中，將接種的培養(yǎng)基放在搖床中，在150 rpm下振蕩培養(yǎng)。菌株IMER1在液體基質(zhì)中培養(yǎng)一段時(shí)間后，將菌絲過(guò)濾即可得粗酶液。

1.2.2 固體培養(yǎng)

用移液槍吸取上述配制好的1 mL孢子液，將其注射入滅菌后的固體培養(yǎng)基中，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（27 ℃）。菌株IMER1在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入50 mL的蒸餾水，然后振蕩3 h，再過(guò)濾收集粗酶液。

1.2.3 酶活測(cè)定

ABTS法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)。在3 mL反應(yīng)體系中，含有2.7 mL pH為4.5、物質(zhì)的量濃度為0.2 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液，0.1 mL的酶液，物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的 ABTS0.2 mL，按次序混合并搖勻，30 s后開(kāi)始記錄A420，每隔15 s記1個(gè)A420值。1個(gè)酶活力單位（U）在上述條件下，每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。

1.2.4 活性PAGE電泳

將玻璃板、膠墊和梳子用雙蒸水洗干凈，用酒精棉球擦拭，將電泳槽安裝好，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠。在配制過(guò)程中，不加入SDS，樣品不需要加熱變性。加入了電極緩沖液后，將樣品（發(fā)酵液）用微量進(jìn)樣器點(diǎn)入點(diǎn)樣孔底部，60 V電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠時(shí)，電壓改為150 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。將凝膠剝下，延泳道切成不同的小條塊，分別浸泡在100 mL的不同的底物液（ABTS或膽紅素）中，染色1～3 h，待膠帶顯色后立即照相。

1.2.5 還原糖的測(cè)定

將1 mL樣品加入試管中，然后加入0.5 mL的 DNS，混勻放置沸水浴中水浴，5 min后取出加6 mL蒸餾水，混勻后于540 nm分光光度測(cè)量OD。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株IMER1在液體發(fā)酵中產(chǎn)BOX的時(shí)間曲線

菌株IMER1在液體發(fā)酵中產(chǎn)BOX的時(shí)間曲線如圖1所示。

如圖1所示，當(dāng)培養(yǎng)了5 d左右時(shí)，菌株液體發(fā)酵產(chǎn)BOX酶量達(dá)到最大，酶量相對(duì)穩(wěn)定，但是，隨后緩慢下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，發(fā)酵液的顏色逐漸由灰色變成棕黃色，pH值從6.0上升到7左右。如圖2所示，菌球隨著時(shí)間的增加也逐漸變大，到后期慢慢開(kāi)始潰解，最后大部分菌球會(huì)變成絮狀，發(fā)酵液的黏度也會(huì)增加。上述結(jié)果表明，為了得到高酶活的BOX，應(yīng)在發(fā)酵培養(yǎng)后的第5天左右收集濾液。如果在5 d之后去收集酶液，可能會(huì)對(duì)后續(xù)BOX酶的分離造成很大的影響。因?yàn)榫虻臐⒔鈺?huì)產(chǎn)生大量的雜蛋白，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)該盡量避免在發(fā)酵后期收集酶液。

1.2.4 活性PAGE電泳

將玻璃板、膠墊和梳子用雙蒸水洗干凈，用酒精棉球擦拭，將電泳槽安裝好，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠。在配制過(guò)程中，不加入SDS，樣品不需要加熱變性。加入了電極緩沖液后，將樣品（發(fā)酵液）用微量進(jìn)樣器點(diǎn)入點(diǎn)樣孔底部，60 V電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠時(shí)，電壓改為150 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。將凝膠剝下，延泳道切成不同的小條塊，分別浸泡在100 mL的不同的底物液（ABTS或膽紅素）中，染色1～3 h，待膠帶顯色后立即照相。

1.2.5 還原糖的測(cè)定

將1 mL樣品加入試管中，然后加入0.5 mL的 DNS，混勻放置沸水浴中水浴，5 min后取出加6 mL蒸餾水，混勻后于540 nm分光光度測(cè)量OD。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株IMER1在液體發(fā)酵中產(chǎn)BOX的時(shí)間曲線

菌株IMER1在液體發(fā)酵中產(chǎn)BOX的時(shí)間曲線如圖1所示。

如圖1所示，當(dāng)培養(yǎng)了5 d左右時(shí)，菌株液體發(fā)酵產(chǎn)BOX酶量達(dá)到最大，酶量相對(duì)穩(wěn)定，但是，隨后緩慢下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，發(fā)酵液的顏色逐漸由灰色變成棕黃色，pH值從6.0上升到7左右。如圖2所示，菌球隨著時(shí)間的增加也逐漸變大，到后期慢慢開(kāi)始潰解，最后大部分菌球會(huì)變成絮狀，發(fā)酵液的黏度也會(huì)增加。上述結(jié)果表明，為了得到高酶活的BOX，應(yīng)在發(fā)酵培養(yǎng)后的第5天左右收集濾液。如果在5 d之后去收集酶液，可能會(huì)對(duì)后續(xù)BOX酶的分離造成很大的影響。因?yàn)榫虻臐⒔鈺?huì)產(chǎn)生大量的雜蛋白，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)該盡量避免在發(fā)酵后期收集酶液。

1.2.4 活性PAGE電泳

將玻璃板、膠墊和梳子用雙蒸水洗干凈，用酒精棉球擦拭，將電泳槽安裝好，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠。在配制過(guò)程中，不加入SDS，樣品不需要加熱變性。加入了電極緩沖液后，將樣品（發(fā)酵液）用微量進(jìn)樣器點(diǎn)入點(diǎn)樣孔底部，60 V電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠時(shí)，電壓改為150 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。將凝膠剝下，延泳道切成不同的小條塊，分別浸泡在100 mL的不同的底物液（ABTS或膽紅素）中，染色1～3 h，待膠帶顯色后立即照相。

1.2.5 還原糖的測(cè)定

將1 mL樣品加入試管中，然后加入0.5 mL的 DNS，混勻放置沸水浴中水浴，5 min后取出加6 mL蒸餾水，混勻后于540 nm分光光度測(cè)量OD。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株IMER1在液體發(fā)酵中產(chǎn)BOX的時(shí)間曲線

菌株IMER1在液體發(fā)酵中產(chǎn)BOX的時(shí)間曲線如圖1所示。

如圖1所示，當(dāng)培養(yǎng)了5 d左右時(shí)，菌株液體發(fā)酵產(chǎn)BOX酶量達(dá)到最大，酶量相對(duì)穩(wěn)定，但是，隨后緩慢下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，發(fā)酵液的顏色逐漸由灰色變成棕黃色，pH值從6.0上升到7左右。如圖2所示，菌球隨著時(shí)間的增加也逐漸變大，到后期慢慢開(kāi)始潰解，最后大部分菌球會(huì)變成絮狀，發(fā)酵液的黏度也會(huì)增加。上述結(jié)果表明，為了得到高酶活的BOX，應(yīng)在發(fā)酵培養(yǎng)后的第5天左右收集濾液。如果在5 d之后去收集酶液，可能會(huì)對(duì)后續(xù)BOX酶的分離造成很大的影響。因?yàn)榫虻臐⒔鈺?huì)產(chǎn)生大量的雜蛋白，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)該盡量避免在發(fā)酵后期收集酶液。

2.2 菌株IMER1在固體發(fā)酵中產(chǎn)酶的時(shí)間曲線

菌株IMER1在固體發(fā)酵中產(chǎn)酶的時(shí)間曲線如圖3所示。

如圖3所示，菌株IMER1固體發(fā)酵1 d后就可以測(cè)到BOX活性，而在液體發(fā)酵中，需要2 d后才能測(cè)到BOX活性。在第5天時(shí)，酶活達(dá)到最高，從第3天至第10天，酶活都處于較高的水平。這表明，菌株IMER1在麩皮固體基質(zhì)中能持續(xù)高產(chǎn)BOX酶。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，BOX活性也會(huì)逐漸下降。將液體與固體發(fā)酵產(chǎn)酶作比較，從中可以看出，固體發(fā)酵產(chǎn)酶的時(shí)間早，保持高酶產(chǎn)量的時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)，固體發(fā)酵產(chǎn)酶的成本比較低。雖然固體發(fā)酵要比液體發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)勢(shì)大，但是，大規(guī)模固體發(fā)酵也存在一些技術(shù)上的問(wèn)題，比如設(shè)備占地面積大、勞動(dòng)強(qiáng)度大、傳質(zhì)傳熱困難，參數(shù)比如pH值、溫度、菌體增殖量和產(chǎn)物生成量等難檢測(cè)。如果能有效地解決了這些問(wèn)題，那么，固體發(fā)酵將會(huì)得到更好的發(fā)展。

2.3 菌株IMER1在液體和固體發(fā)酵中胞外酶的BOX活性檢測(cè)

固體發(fā)酵粗酶液和液體發(fā)酵粗酶液活性電泳如圖4所示。

漆斑菌屬是產(chǎn)BOX的主要真菌，在工業(yè)中，常用該屬菌株生產(chǎn)BOX，但是，也有報(bào)道表明，其他的氧化酶和BOX底物具有一定的交叉活性，比如漆酶。另外，該菌株在固體液體發(fā)酵中是否有差異，比如BOX同工酶的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步了解這些問(wèn)題，可以對(duì)液體和固體發(fā)酵的胞外酶液進(jìn)行活性電泳分析。理論上，BOX能催化黃色膽紅素，形成一種綠色的物質(zhì)，而其能催化無(wú)色的ABTS形成一種綠色物質(zhì)。該實(shí)驗(yàn)利用BOX的底物（膽紅素和ABTS）對(duì)IMER1的發(fā)酵液活性電泳后進(jìn)行活性檢測(cè)，使用膽紅素溶液（pH8.0）底物顯色的膠條時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，在黃色的背景中，有明顯的單條綠色條帶，而使用無(wú)色的ABTS溶液底物（pH4.0）顯色的膠條時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，在灰色的背景中，有明顯的單條綠色條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在液體和固體中發(fā)酵的粗酶液都能得到同樣的現(xiàn)象。結(jié)果表明，IMER1在本文所述的條件下，在液體和固體中只產(chǎn)生1種BOX，沒(méi)有同工酶，同時(shí)，菌株所產(chǎn)生的其他胞外酶不會(huì)與BOX產(chǎn)生交叉活性。

2.4 菌株IMER1宏觀產(chǎn)BOX酶動(dòng)力學(xué)

通過(guò)分析、比較可知酶的生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，可以將酶生物合成的模式分為4種類型，即同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型和滯后合成型。

中期合成型是指酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，而在進(jìn)入細(xì)胞平衡期后，酶的合成也將終止。如圖5所示，菌株IMER1在生長(zhǎng)的調(diào)整期時(shí)（48 h內(nèi)），發(fā)酵液中未檢測(cè)到BOX酶活；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（48～119 h）后，BOX酶也開(kāi)始合成，酶濃度逐步上升，而當(dāng)菌株IMER1的生長(zhǎng)達(dá)到平穩(wěn)期后，BOX酶的濃度也達(dá)到平穩(wěn)，即酶的合成停止。由于菌體在不斷生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中還原糖的濃度（主要是葡萄糖）也在不斷下降。在菌株IMER1的生長(zhǎng)后期，還原糖濃度會(huì)降到最低，如圖6所示。結(jié)果表明，菌株IMER1在PDB中的BOX酶分泌屬于中期合成型。該類型酶的特點(diǎn)是其合成會(huì)受到反饋?zhàn)瓒簦移渌鶎?duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。如果在發(fā)酵培養(yǎng)的后期不斷排空發(fā)酵液，并補(bǔ)充培養(yǎng)基，可以提高BOX酶的產(chǎn)率。

3 結(jié)論

當(dāng)菌株IMER1在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d左右時(shí)，其產(chǎn)BOX的活性最高，隨后酶活性開(kāi)始降低，同時(shí)，伴隨著菌絲球潰解，因此，從液體發(fā)酵體系分離BOX的最適時(shí)間點(diǎn)為第5天，菌株IMER1在麩皮固體基質(zhì)中發(fā)酵時(shí)能持續(xù)高產(chǎn)BOX酶。將液體發(fā)酵產(chǎn)酶與固體發(fā)酵產(chǎn)酶相比，固體發(fā)酵產(chǎn)酶的時(shí)間早，保持高酶產(chǎn)量的時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)，固體發(fā)酵產(chǎn)酶的成本比較低。相比較而言，液體發(fā)酵液中酶的提取比從固體發(fā)酵物中提取要簡(jiǎn)單。因此，液體和固體發(fā)酵產(chǎn)BOX都有一定的優(yōu)缺點(diǎn)。在液體和固體發(fā)酵物中，菌株IMER1不會(huì)產(chǎn)生BOX同工酶，其他胞外酶和BOX不會(huì)產(chǎn)生交叉活性。產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率和各種因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影響。研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率被稱為宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)，屬于非結(jié)構(gòu)力學(xué)。宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)一般與細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和濃度以及產(chǎn)酶模式有關(guān)，可用式（1）表示：

. （1）

式（1）中：E為酶濃度，U/L；t為時(shí)間；?為比細(xì)胞生長(zhǎng)速率，L/h；α為生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)酶系數(shù)，U/g，以細(xì)胞干重計(jì)；x為細(xì)胞濃度，g/L，以細(xì)胞干重計(jì)；β為非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率，U/g·h，以細(xì)胞干重計(jì)。

中期合成型的酶為特殊的生長(zhǎng)耦聯(lián)型，其非生長(zhǎng)耦聯(lián)比產(chǎn)酶速率β=0，所以，其宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)與同步合成型相同，產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可簡(jiǎn)化為：

. （2）

根據(jù)Monod方程式可知：

. （3）

式（3）中：μ為微生物的比增殖速度；μmax為微生物最大比增殖速度；S為限制性底物濃度，在該實(shí)驗(yàn)中指培養(yǎng)基中還原糖的濃度；KS為飽和常數(shù)，為μ=1/2μmax時(shí)的底物濃度。

將式（3）代入式（2）中，其產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程為：

. （4）

在式（4）中，α，KS和μmax為模型參數(shù)，可利用線性化處理和嘗試誤差法求出有關(guān)模型參數(shù)值。根據(jù)α為生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)酶系數(shù)，以酶量為因變量，細(xì)胞干重為自變量，根據(jù)圖5中的數(shù)據(jù)擬合曲線方程求出α=0.006 3；μmax為微生物最大比增殖速度，并求出其在產(chǎn)酶過(guò)程中的最大μ值，即μmax=4.022 56.根據(jù)（3）式求得KS=0.016 492.而模擬出的產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程為：

. （5）

式（5）中：E為酶濃度，U/L；t為時(shí)間；S為PDB培養(yǎng)基中還原糖的濃度，g/L；x為細(xì)胞濃度，g/L。

由式（5）可知，單位時(shí)間的酶產(chǎn)量與PDB培養(yǎng)基中還原糖的濃度、菌體的濃度有關(guān)。分析菌株IMER1在液體和固體中產(chǎn)BOX酶的特征，其結(jié)果為提高BOX的產(chǎn)量打下了基礎(chǔ)。

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〔編輯：白潔〕