固相萃取-高效液相色譜法測定人血漿中的替硝唑濃度

郭志磊，孔 敏

固相萃取-高效液相色譜法測定人血漿中的替硝唑濃度

郭志磊，孔 敏*

目的 建立固相萃取結(jié)合高效液相色譜法測定人血漿中替硝唑濃度的方法。方法 血漿樣品經(jīng)C18固相萃取小柱凈化后進(jìn)樣。色譜柱：HyperSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：磷酸二氫鉀(含0.1%三乙胺，磷酸調(diào)pH=3.2)-乙腈(89∶11)，柱溫：25 ℃，流速：1 mL/min，檢測波長：236 nm，進(jìn)樣量：30 μL。結(jié)果 替硝唑血藥濃度在0.5～50 mg/L之間呈良好線性關(guān)系(r=0.999 5)，線形方程Y=1.012 C-0.053 1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，回收率>90%。結(jié)論 該方法操作簡便、準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，適用于替硝唑的血藥濃度檢測。

固相萃??；高效液相；替硝唑；血藥濃度

0 引言

替硝唑?qū)傧趸溥蝾惢衔?，臨床上主要用于治療腸道和腸外阿米巴病及厭氧菌感染[1]。目前，高效液相測定替硝唑血藥濃度的血漿處理方法是蛋白沉淀法。但采用蛋白沉淀法處理血樣，內(nèi)源性雜質(zhì)干擾大，靈敏度不高[2-3]。而采用固相萃取處理替硝唑血漿還未見報(bào)道。經(jīng)過對前期試驗(yàn)的研究改進(jìn)[4]，本研究首次建立了固相萃取聯(lián)合高效液相色譜法測定替硝唑血藥濃度的方法，且具有簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床替硝唑的血藥濃度監(jiān)測。

1 儀器與試藥

日本SHIMADZU公司高效液相色譜系統(tǒng)(SPD-20A檢測器，CTO-10AS柱溫箱，LC-20AD 四元泵)；Cleanert C18固相萃取柱(200 mg/3 mL，Agela Technology)。

替硝唑(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100336-200703)；甲硝唑(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100191-200606)；甲醇、乙腈均為色譜級(jí)(美國TEDIA公司)；磷酸二氫鉀、磷酸、三乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：HyperSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀(含0.1%三乙胺，用磷酸調(diào)pH值至3.2)-乙腈(89∶11)；檢測波長：236 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：30 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.1 替硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取替硝唑標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，配制成200 mg/L供試品溶液，于4 ℃下避光保存。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，配制成100 mg/L對照品溶液，于4 ℃下避光保存。

2.3 樣品處理 取血漿樣品0.2 mL，加入對照品溶液20 μL，渦旋振蕩10 s后，置活化的固相萃取柱上。先用1 mL水沖洗，再用1 mL 90%甲醇淋洗，然后用20%冰醋酸甲醇溶液2 mL上柱洗脫，收集洗脫液于60 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈珊?，?.5 mL蒸餾水溶解，取30 μL進(jìn)樣。

2.4 方法專屬性 按上述色譜條件和血漿處理方法，替硝唑和甲硝唑分離度良好，峰形尖銳且無拖尾現(xiàn)象，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)極少，對測定無干擾。空白血漿、替硝唑及甲硝唑色譜圖見圖1。甲硝唑和替硝唑的保留時(shí)間分別為5.8、8.7 min。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿180 μL，加入對照品溶液和供試品溶液各20 μL，使替硝唑血漿濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L，按“2.3”項(xiàng)下處理，用樣品峰與內(nèi)標(biāo)峰的面積比對樣品濃度作線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1.012 C-0.053 1，r=0.999 5，表明替硝唑在0.5～50 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低檢測限為0.02 mg/L (信噪比S/N≥3)。

2.6 方法回收率和精密度試驗(yàn) 取替硝唑供試品溶液適量，依次配制低、中、高濃度(1、10、50 mg/L)的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下處理，3種濃度樣品每日測定5次，連續(xù)測定5 d，計(jì)算方法回收率及日內(nèi)、日間精密度(表1)。由表1可見，回收率>95%，精密度RSD均<5%，滿足生物樣品的測定要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取替硝唑供試品溶液適量，配制濃度為1、10、50 mg/L的血漿樣品，平行制備3份，按“2.3”項(xiàng)下處理，分別在室溫條件(0、6、12、24、72 h)、凍融條件(凍融3次)下進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，各樣本測定值RSD均<10%，表明替硝唑在室溫條件(72 h內(nèi))和凍融條件(3次)下穩(wěn)定性良好。

表1 回收率和精密度試驗(yàn)(n=5)

2.8 方法學(xué)應(yīng)用 收集我院2013年1-12月口腔科和婦科疾病患者血樣(經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，患者簽署知情同意書)，共34例患者，男12例，女22例，年齡21～54歲，平均年齡(35.4±2.1)歲。測定口服1 g替硝唑片劑后的血藥濃度，72 h內(nèi)取血14點(diǎn)，結(jié)果顯示，替硝唑血藥濃度均在定量范圍內(nèi)。血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 替硝唑血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

筆者對流動(dòng)相體系進(jìn)行考察[5-7]，流動(dòng)相組成中無三乙胺時(shí)，替硝唑峰形不對稱且有拖尾；但當(dāng)流動(dòng)相中三乙胺含量為0.1%時(shí)，替硝唑峰形對稱無拖尾。而且還發(fā)現(xiàn)磷酸二氫鉀與乙腈的比例對于測定影響較大，當(dāng)磷酸二氫鉀∶乙腈=89∶11時(shí)，內(nèi)源性雜質(zhì)干擾少，峰形較為尖銳。

已有文獻(xiàn)中，研究者多采用磷酸鹽乙腈或磷酸鹽甲醇溶液作為洗脫劑[8-9]。但筆者通過實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)，仍有少量內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。本研究采用冰醋酸甲醇溶液作為洗脫劑，可以將替硝唑和甲硝唑從SPE柱上洗脫下來。此外，20%的冰醋酸甲醇溶液洗脫能力最強(qiáng)，而且雜質(zhì)干擾較少。

朱余兵等[10]采用甲醇、乙腈等作為蛋白沉淀劑純化血樣，測定替硝唑血藥濃度。但由于沉淀劑對替硝唑的部分吸附，導(dǎo)致該方法的最低檢測限只能達(dá)到0.5 mg/L，還有內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。而本試驗(yàn)采用固相萃取法純化血樣，所需藥品量少，樣品處理簡單，靈敏度高，適用于臨床檢測替硝唑血藥濃度。

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Determination of the concentration of tinidazole in human plasma by HPLC with solid phase extraction

GUO Zhi-lei,KONG Min*

(Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan 430015,China)

Objective To establish a new solid phase extraction (SPE)-HPLC method for the determination of tinidazole in plasma.Methods The plasma samples were cleaned up by SPE.The HyperSil C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used,and the mobile phase consisted of phosphate buffer-acetonitrile (89∶11).The flow rate was 1 mL/min with the detection wavelength of 236 nm,and the column temperature was 25 ℃.Results The linear relation was in the range of 0.5～50 mg/L (r=0.999 1),RSDof intra-day and inter-day were both less than 5%,and the recovery rate was more than 90%.Conclusion The method is convenient,rapid and accurate,it is suitable for the assay of tinidazole in plasma.

Solid phase extraction;High performance liquid chromatography;Tinidazole;Plasma drug concentration

2014-05-18

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院，武漢 430015

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201502017