浴場海水中大腸桿菌耐藥性及其耐藥基因研究

王玥，蘇潔，明紅霞，石巖，趙莎，關(guān)道明，樊景鳳*

（1.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧大連 116023；2.國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室，遼寧大連 116023；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023）

浴場海水中大腸桿菌耐藥性及其耐藥基因研究

王玥1，3，蘇潔1，2，明紅霞1，2，石巖1，3，趙莎1，3，關(guān)道明1，2，樊景鳳1，2*

（1.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧大連 116023；2.國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室，遼寧大連 116023；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023）

為了解海水浴場中大腸桿菌耐藥性狀況及其耐藥基因分布，以大連星海浴場近岸海水樣品為研究對象，分離鑒定得到41株大腸桿菌，采用K-B藥敏紙片法檢測其對9種常用抗生素的耐藥性，并對耐藥菌株中的耐藥基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：41株受試大腸桿菌菌株對四環(huán)素的耐藥率最高（46%），而對氨曲南的耐藥率最低（5%），大腸桿菌的多重耐藥率達(dá)到34%。采用PCR方法對41株分離菌株進(jìn)行四環(huán)素耐藥基因檢測，結(jié)果顯示，僅四環(huán)素耐藥基因tetA和tetB被檢出，其他4種類型四環(huán)素耐藥基因未被檢出。大腸桿菌基因組與質(zhì)粒DNA中tetA的檢出率分別為34%和29%；tetB的檢出率分別為2%和12%。相關(guān)性分析結(jié)果表明大腸桿菌的四環(huán)素耐藥表型與四環(huán)素耐藥基因的陽性檢出率顯著相關(guān)。

大腸桿菌；浴場海水；耐藥性；耐藥基因

1 引言

隨著海洋環(huán)境與資源的不斷開發(fā)與利用，海洋也逐步成為耐藥性微生物及其耐藥基因的重要儲存庫。耐藥細(xì)菌也會隨雨水沖刷、潮汐和海流帶入近岸海濱旅游區(qū)，通過菌種間遺傳物質(zhì)的傳遞，耐藥基因有可能被傳入海水環(huán)境中的人體病原菌。由于海灘娛樂水域承載了大量的游客，這些耐藥性致病菌可通過海水吞咽引發(fā)游泳人群致命性腸道疾病，因而大大增加了人體耐藥病原菌病害發(fā)生和流行的可能性［1—3］。

大腸桿菌（Escherichiacoli）作為海產(chǎn)品及海洋環(huán)境糞便污染的重要指示微生物，是臨床上引起感染最常見的腸桿菌科細(xì)菌之一，致病性的大腸桿菌會引發(fā)嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥等疾?。?—6］。2013年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，在各大醫(yī)院采集臨床分離菌的8萬多株菌中耐藥性大腸桿菌的檢出率最高［7］。作為引起人類感染最常見的腸桿菌科細(xì)菌，大腸桿菌也是耐藥基因的主要儲存庫，在耐藥基因的傳播中發(fā)揮著重要作用［8］。此外，臨床上發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的多重耐性現(xiàn)象較嚴(yán)重，并且多重耐藥性的大腸桿菌已被發(fā)現(xiàn)于近岸海水中［9—10］。耐藥性大腸桿菌及其耐藥性基因會通過海產(chǎn)品或海水吞咽等途徑傳遞給人類，使抗菌藥對人類疾病的治療效果下降或消失，成為威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。

目前，國外僅有少數(shù)關(guān)于海水浴場中大腸桿菌耐藥性的報道，如Turgeon等人通過檢測比較2004年與2005年在魁北克南部近200個浴場中采集的海水樣品發(fā)現(xiàn)海水浴場中耐藥性大腸桿菌的檢出率升高了10%［1］。國內(nèi)僅在北黃海近岸海域開展了抗磺胺類大腸桿菌的分布調(diào)查，并且采用的是化學(xué)分析方法［11］，而對娛樂海水浴場中耐藥性大腸桿菌的研究還未見報道。此外，目前國外的研究僅局限于海水浴場中大腸桿菌耐藥性狀況的檢測層面，對其在海水浴場中的傳播擴散因子——耐藥基因的分布研究尚未開展。因此，我們對大連星海浴場中大腸桿菌耐藥性及其耐藥基因進(jìn)行研究，通過藥敏實驗分析了海水浴場中大腸桿菌的耐藥性狀況，根據(jù)抗生素敏感性檢測結(jié)果采用PCR方法對受試大腸桿菌四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行分析。本研究的開展將有助于了解娛樂海水對人體健康的影響，并為相關(guān)管理部門進(jìn)行的海水浴場風(fēng)險評價提供數(shù)據(jù)支持，對浴場中耐藥基因污染的深入研究具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品采集

于2014年8月進(jìn)行樣品采集，水樣采自大連星海浴場距岸邊約30 m游泳人群密集處，無菌玻璃瓶采集表層（10～15 cm）海水，低溫保存運至實驗室。

2.1.2 抗生素及生化鑒定管

選取臨床上治療大腸桿菌感染常用的9種抗生素：四環(huán)素（TCY）、哌拉西林（PIP）、氨曲南（ATM）、左氧氟沙星（LYX）、頭孢噻吩（CEP）、復(fù)方新諾明（SXT）、鏈霉素（STR）、慶大霉素（GEN）、氯霉素（CHL），這9種抗生素均購自杭州天和微生物試劑有限公司。實驗中所選腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管及參照的腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定手冊由杭州天和微生物試劑有限公司提供。

2.1.3 菌株及培養(yǎng)基

實驗用大腸桿菌質(zhì)控菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC 25922，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。實驗所需的培養(yǎng)基有4種：m-TEC，用于大腸桿菌分離培養(yǎng)；LB瓊脂，用于菌種的純化；EC肉湯，用于大腸桿菌生化鑒定；水解酪蛋白瓊脂（Mueller-Hinton，MH），用于藥敏實驗。

2.2 大腸桿菌的分離鑒定

2.2.1 大腸桿菌的分離

使用濾膜法對大連星海浴場表層海水中的大腸桿菌進(jìn)行過濾，水樣過濾后濾膜置于m-TEC瓊脂培養(yǎng)基上，于（35±1）℃培養(yǎng)2 h，再以（44.5±0.5）℃培養(yǎng)16～18 h。挑取黃色和黃棕色菌落初步鑒定為疑似大腸桿菌。于LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離純化。37℃培養(yǎng)過夜，直至平板上長出單一相同的菌落。

2.2.2 生理生化鑒定

用接種針在LB瓊脂培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種于腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管，進(jìn)行以下15種試驗項目：硫化氫實驗、苯丙酸鹽實驗、葡萄糖酸鹽實驗、吲哚實驗、葡磷胨水實驗、枸櫞酸鹽實驗、尿素實驗、半固體實驗、葡萄糖產(chǎn)氣實驗、賴氨酸實驗、鳥氨酸實驗、棉子糖實驗、山梨醇實驗、側(cè)金盞花醇實驗、木膠糖實驗。將鑒定管置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，依據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果，參照細(xì)菌鑒定編碼冊進(jìn)行判斷并編碼，再按照編碼值檢索生化編碼表，即可獲得對應(yīng)的結(jié)果。

2.3 抗生素敏感性檢測

采用CLSI推薦的K-B藥敏紙片擴散法研究大腸桿菌對9種常用抗生素的耐藥性［12］。細(xì)菌藥敏實驗結(jié)果參照CLSI公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感、中敏、耐藥3種形式對抑菌圈大小作出解釋。采用UHONET5.6軟件對藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。抗生素敏感性檢測過程中采用大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

2.4 四環(huán)素耐藥基因檢測

為檢測大腸桿菌中四環(huán)素耐藥基因的分布，選取海水環(huán)境中常見的6種四環(huán)素耐藥基因（tetA，tetB，tetC，tetD，tetE，tetG）為檢測對象，以大腸桿菌基因組DNA和質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行四環(huán)素耐藥基因的PCR擴增。PCR反應(yīng)條件及引物信息參照文獻(xiàn)［13］。25μL的PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 12.5μL，上下游引物各0.25μL，DNA模板1μL，dd H2O 11μL?；蚪MDNA和質(zhì)粒DNA的提取均參照試劑盒（天根生物公司的基因組DNA和質(zhì)粒DNA提取試劑盒）說明書。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS軟件，根據(jù)對大腸桿菌分離菌株體外四環(huán)素藥物敏感性和四環(huán)素耐藥基因PCR檢測結(jié)果，將四環(huán)素耐藥基因陽性菌株數(shù)與四環(huán)素耐藥菌株數(shù)進(jìn)行χ2檢驗，對四環(huán)素耐藥基因陽性菌株中的耐四環(huán)素菌株數(shù)與四環(huán)素耐藥基因陰性菌株數(shù)進(jìn)行比較，分析大腸桿菌的四環(huán)素耐藥性與四環(huán)素耐藥基因陽性檢出率的相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1 生理生化鑒定

對在m-TEC瓊脂培養(yǎng)基上初篩得到的138株疑似大腸桿菌菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表1所示。由表1可知，其中41株為大腸桿菌，分離率為30%，其余77株為非腸桿菌科細(xì)菌。這說明使用m-TEC瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)用于海水中大腸桿菌的分離率較低。

表1 138株篩選細(xì)菌種屬分布Tab.1 The bacterial species identification of 138 isolates

3.2 藥敏實驗

41株大腸桿菌對9種常用抗生素的藥敏實驗結(jié)果顯示，66%的受試大腸桿菌被檢測到耐藥性。其中受試菌株對四環(huán)素的耐藥率最高（46%），對頭孢噻吩和復(fù)方新諾明也呈現(xiàn)較高耐藥性，耐藥率達(dá)到30%以上。受試菌株對哌拉西林、左氧氟沙星、鏈霉素、慶大霉素和氯霉素的耐藥率也達(dá)到了近20%。而對氨曲南耐藥率最低（5%）（表2）。41株大腸桿菌的多重耐藥率為34%，最高耐抗生素個數(shù)達(dá)到7（表3）。

表2 41株大腸桿菌對9種抗菌藥物的耐藥情況Tab.2 Antibiotic resistance of 41E.coliisolates against 9 antimicrobials

續(xù)表2

表3 41株大腸桿菌的多重耐藥譜Tab.3 Multi-resistant pattern of 41E.coliisolates

3.3 四環(huán)素耐藥基因的PCR檢測

3.3.1 基因組DNA中四環(huán)素耐藥基因檢測

采用PCR方法對41株大腸桿菌基因組DNA中的四環(huán)素耐藥基因tet（A，B，C，D，E，G）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，僅耐藥基因tetA和tetB被檢測到，檢出率分別為34%和2%（表4）。四環(huán)素耐藥菌株中14株（63%）檢測到tetA基因，1株（5%）檢測到tetB基因，2株四環(huán)素敏感菌株檢測到tetA基因，推測其原因為攜帶四環(huán)素耐藥基因但并未表達(dá)。其他四環(huán)素耐藥基因檢測結(jié)果均為陰性。實驗結(jié)果中四環(huán)素耐藥基因檢測結(jié)果為陽性的菌株，四環(huán)素耐藥菌株占了很大比率，tetA檢測為陽性的菌株中86%為四環(huán)素耐藥菌株，tetB檢測為陽性的菌株中100%為四環(huán)素耐藥菌株，這表明四環(huán)素耐藥基因在基因組DNA中的攜帶情況與耐藥菌株的四環(huán)素耐藥表型可能存在一定的相關(guān)性。

表4 大腸桿菌基因組DNA中四環(huán)素耐藥基因檢出率Tab.4 Detection rate of tetracycline resistance gene ingenome DNA of 41E.coliisolates

3.3.2 質(zhì)粒DNA中四環(huán)素耐藥基因檢測

大腸桿菌質(zhì)粒DNA中四環(huán)素耐藥基因檢測結(jié)果顯示，41株受試大腸桿菌中tetA的檢出率為29%，而tetB的檢出率為12%。四環(huán)素耐藥基因tetA陽性菌株中91%為四環(huán)素耐藥菌株，tetB陽性菌株中全部為四環(huán)素耐藥菌株（表5），這說明四環(huán)素耐藥基因在質(zhì)粒DNA中的攜帶情況與耐藥菌株的四環(huán)素耐藥表型存在一定的相關(guān)性。

表5 大腸桿菌質(zhì)粒DNA中四環(huán)素耐藥基因檢測結(jié)果Tab.5 Detection rate of tetracycline resistance gene in plasmid DNA of 41E.coliisolates

3.3.3 四環(huán)素耐藥表型與四環(huán)素耐藥基因的相關(guān)性分析

41株分離菌株中，有19株為四環(huán)素耐藥菌株，耐藥率為46%。大腸桿菌基因組DNA與質(zhì)粒DNA中四環(huán)素耐藥基因的檢測結(jié)果顯示，四環(huán)素耐藥基因陽性菌株中四環(huán)素耐藥菌株所占比例較高，分別為86.7%和94.1%。為進(jìn)一步驗證四環(huán)素耐藥基因陽性菌株數(shù)與四環(huán)素耐藥菌株數(shù)之間的相關(guān)性，將二者進(jìn)行χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因陽性菌株中的四環(huán)素耐藥菌株數(shù)顯著高于四環(huán)素耐藥基因陰性菌株，表明大腸桿菌的四環(huán)素耐藥性與四環(huán)素耐藥基因陽性檢出率相關(guān)（表6，表7）。

表6 大腸桿菌四環(huán)素耐藥表型與基因組DNA中四環(huán)素耐藥基因相關(guān)性分析Tab.6 Correlation among tetracycline resistant phenotype and tetracycline resistant gene in genome DNA ofE.coli

表7 大腸桿菌四環(huán)素耐藥表型與質(zhì)粒DNA中四環(huán)素耐藥基因相關(guān)性分析Tab.7 Correlation among tetracycline resistant phenotype and tetracycline resistant gene in plasmid DNA ofE.coli

4 討論

本文采用m-TEC瓊脂培養(yǎng)基在大連星海浴場海水中初篩獲得138株疑似大腸桿菌，經(jīng)生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)41株分離菌株為大腸桿菌，這說明應(yīng)用于m-TEC瓊脂培養(yǎng)基方法對海水中大腸桿菌的分離率較低。藥敏試驗結(jié)果顯示，66%的受試大腸桿菌被檢測到耐藥性，受試大腸桿菌對9種抗生素中四環(huán)素的耐藥率最高。這可能與四環(huán)素類藥物（包括四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素等）在我國使用時間較長，應(yīng)用范圍較廣有關(guān)。相反，由于氨曲南等藥物的臨床使用相對較少，在藥物使用的選擇壓力下，反映為抗生素的耐藥率相對較低，這與國外的相關(guān)研究結(jié)果一致。如在印度東南部杜蒂戈林海岸的海洋生物中篩選出的168株大腸桿菌中，其中對四環(huán)素的耐藥率達(dá)到了26%［10］；韓國學(xué)者對GOMSO海灣表層海水中篩選出的131株大腸桿菌進(jìn)行耐藥性研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素耐藥率為33.6%、鏈霉素11.5%、氯霉素9.9%、慶大霉素0.8%［14］。本研究發(fā)現(xiàn)大連星海浴場海水中大腸桿菌不但普遍存在抗生素抗性，而且其多重耐藥率較高，這說明星海浴場中多重耐藥情況明顯，而多重耐藥的產(chǎn)生會給人和動物疾病的治療帶來極大困難，因此海水浴場水質(zhì)相關(guān)管理部門應(yīng)引起重視。

在本研究中，大腸桿菌對四環(huán)素的耐藥性最為普遍，為進(jìn)一步了解我國海水浴場海水中大腸桿菌四環(huán)素耐藥性傳播機制，本文初步研究了大腸桿菌中四環(huán)素耐藥基因的分布。前期研究發(fā)現(xiàn)，海水環(huán)境中的細(xì)菌至少有7種以上不同質(zhì)粒編碼的四環(huán)素耐藥基因（tetA，tetB，tetC，tetD，tetE，tetG，tetY等）［15—19］，并且世界上不同海域內(nèi)主要四環(huán)素耐藥基因的種類和組成有很大的差異，這種差異不但與地理分布有關(guān)，而且還與細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化有關(guān)。普遍認(rèn)為主動外排作用和核糖體保護(hù)作用是細(xì)菌對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性的主要機制，其中大腸桿菌以主動外排機制為主［20］，研究較多的主動外排基因分別為tetA，tetB和tetC等，其中tetA與tetC作為代表四環(huán)素類藥物外排機制的基因廣泛存在于很多細(xì)菌中［21］。本研究發(fā)現(xiàn)受試大腸桿菌無論是基因組DNA還是質(zhì)粒DNA中僅四環(huán)素耐藥基因tetA和tetB被檢測到，而且tetA的檢出率最高，因此推測海水浴場海水中大腸桿菌四環(huán)素耐藥性可能主要由tetA基因傳遞，主動外排機制可能為本研究中試驗菌株四環(huán)素耐藥的主要機制。Fan W等［22］在世界范圍內(nèi)收集了107株耐四環(huán)素大腸桿菌分離株，用多重PCR方法檢測四環(huán)素耐藥基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中49.5%含tetA基因，35.5%含tetB基因，5.6%含tetC基因，1.9%含tetD基因。以上數(shù)據(jù)說明tetA基因和tetB基因可能在大腸桿菌中分布廣泛，這兩種基因尤其是tetA基因作為四環(huán)素外排泵基因，在四環(huán)素耐藥性方面起到主要作用。

通過檢測四環(huán)素耐藥基因還發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素耐藥基因檢測結(jié)果為陽性的菌株在耐四環(huán)素的大腸桿菌中占了很大比率，這說明四環(huán)素耐藥基因的攜帶情況與耐藥菌株的四環(huán)素耐藥表型可能存在一定的相關(guān)性。將四環(huán)素耐藥基因陽性菌株數(shù)與四環(huán)素耐藥菌株數(shù)進(jìn)行χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素耐藥基因陽性菌株中的耐四環(huán)素菌株數(shù)顯著高于四環(huán)素耐藥基因陰性菌株數(shù)，這表明大腸桿菌的四環(huán)素耐藥表型與四環(huán)素耐藥基因陽性檢出率相關(guān)，因此進(jìn)一步推斷在本研究中大腸桿菌四環(huán)素耐藥性的產(chǎn)生可能是由tetA和tetB基因介導(dǎo)的。

5 結(jié)論

（1）采用K-B藥敏紙片擴散法研究發(fā)現(xiàn)，大連星海浴場表層海水中大腸桿菌耐藥情況嚴(yán)重，其中對四環(huán)素的耐藥率最高，并且多重耐藥狀況明顯。

（2）對分離的大腸桿菌進(jìn)行四環(huán)素耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，主動外排基因tetA與tetB被檢測到，主動外排機制被推測為受試菌株四環(huán)素耐藥的主要機制。

（3）海水中受試大腸桿菌的四環(huán)素耐藥表型與四環(huán)素耐藥基因陽性檢出率顯著相關(guān)，其耐藥性的產(chǎn)生可能是由tetA和tetB基因介導(dǎo)的。

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Study on antibiotic resistance and resistant related genes of Escherichia coli from seawater of bathing beach

Wang Yue1，3，Su Jie1，2，Ming Hongxia1，2，Shi Yan1，3，Zhao Sha1，3，Guan Daoming1，2，F(xiàn)an Jingfeng1，2

（1.National Marine Environmental Monitoring Center，Dalian 116023，China；2.The Ecological Environment Key Laboratory of Coastal Waters of the State Oceanic Administration，Dalian 116023，China；3.College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

To study antibiotic resistance pattern and resistant gene ofEscherichiacolifrom seawater recreational beach，41E.coliisolates from seawater in Dalian Xinghai bathing beach were identified and characterized using biochemical tests.Antimicrobial resistance ofE.coliisolates was determined by Kirby-Bauer disk diffusion method，the result showed highest resistance to tetracycline（46%）and lowest resistance against ammonia QuNa（5%）.Multidrug resistance was observed in 34%of 41E.coliisolates.Only tetracycline resistant genetetA andtetB gene were detected among the 41 isolates using PCR method.The detection frequency oftetA gene was 34%in genome DNA and 29%in plasmid DNA ofE.coli.WhiletetB gene was detected in 2%ofE.coligenome DNA and in 12% ofE.coliplasmid DNA.χ2test suggest that tetracycline resistant phenotype ofE.coliis correlated with tetracycline resistant gene.

Escherichiacoli；seawater of bathing beach；antibiotic resistance；resistant gene

S945.4

A

0253-4193（2015）12-0123-06

王玥，蘇潔，明紅霞，等.浴場海水中大腸桿菌耐藥性及其耐藥基因研究［J］.海洋學(xué)報，2015，37（12）：123—128，

10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.013

Wang Yue，Su Jie，Ming Hongxia，et al.Study on antibiotic resistance and resistant related genes ofEscherichiacolifrom seawater of bathing beach［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（12）：123—128，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.013

2015-05-22；

2015-09-27。

海洋公益性行業(yè)科研專項（201105007）；全球變化與海氣相互作用（GASI-03-01-02-05）；人社部2015年度留學(xué)人員科技活動項目。

王玥（1988—），男，遼寧省本溪市人，主要從事海洋生物學(xué)研究。E-mail：15941175630＠163.com

*通信作者：樊景鳳（1972—），女，研究員，主要研究方向為海洋微生物學(xué)和海洋生態(tài)學(xué)。E-mail：jffan＠nmemc.org.cn