海洋酸化對(duì)海水青鳉胚胎骨骼發(fā)育的影響

王曉杰，肖瀟，李超，岳娜

（1.上海海洋大學(xué)海洋生物系統(tǒng)和神經(jīng)科學(xué)研究所，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)國(guó)際海洋研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

海洋酸化對(duì)海水青鳉胚胎骨骼發(fā)育的影響

王曉杰1，2，3，肖瀟1，李超1，岳娜1

（1.上海海洋大學(xué)海洋生物系統(tǒng)和神經(jīng)科學(xué)研究所，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)國(guó)際海洋研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

本文在實(shí)驗(yàn)室模擬近期海洋酸化水平，對(duì)海洋酸化對(duì)海水青鳉魚（Oryziamelastigma）胚胎骨骼發(fā)育的影響進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)往實(shí)驗(yàn)水體中充入一定濃度CO2氣體酸化海水。對(duì)照組CO2分壓為450×10－6，兩個(gè)處理組CO2濃度分別為1 160×10－6和1 783×10－6，對(duì)應(yīng)的水體p H值分別為8.14，7.85和7.67。將海水青鳉魚受精卵放入實(shí)驗(yàn)水體中至仔魚孵化出膜，對(duì)初孵仔魚經(jīng)骨骼染色、顯微拍照，挑取了仔魚頭部、軀干及尾部骨骼染色清晰的28個(gè)骨骼參數(shù)的長(zhǎng)度進(jìn)行了顯微軟件測(cè)量及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸化處理對(duì)實(shí)驗(yàn)魚所測(cè)量的骨骼長(zhǎng)度影響均不顯著。因此推測(cè)，未來(lái)100～200年間海洋酸化對(duì)海水青鳉魚的胚胎及初孵仔魚的骨骼發(fā)育沒(méi)有顯著影響。

青鳉魚；海洋酸化；骨骼發(fā)育

1 引言

自工業(yè)革命以來(lái)，大約1 420億噸由人類活動(dòng)產(chǎn)生的CO2被海洋吸收，導(dǎo)致海洋快速酸化。如果繼續(xù)按照目前這種化石燃料消耗量和大氣CO2濃度升高的趨勢(shì)發(fā)展（目前濃度是390×10－6），到21世紀(jì)末CO2濃度會(huì)增加至720×10－6～1 020×10－6［1］，p H值可能會(huì)下降0.3～0.4［2］，而海水氫離子濃度會(huì)比工業(yè)革命以前上升100%～150%。

海洋酸化對(duì)海洋生物的影響，主要體現(xiàn)在對(duì)具有外骨骼或者內(nèi)骨骼的海洋生物鈣化過(guò)程的影響［3］。然而，對(duì)于海洋酸化對(duì)魚類等其他非鈣化生物影響的研究較少。在硬骨魚中，在早期生活史階段由于體內(nèi)缺乏成熟的p H調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)海洋酸化較為敏感。例如，較高濃度CO2（約2 000×10－6）的酸化處理，會(huì)引起魚類早期發(fā)育的遲緩［4］、降低RNA／DNA比［5］以及身體內(nèi)部多組織損傷［6］等。

魚類體內(nèi)的鈣化器官，主要是內(nèi)耳耳石，體內(nèi)骨骼中也含有少量碳酸鈣。已有研究發(fā)現(xiàn)，海洋酸化使海水魚仔魚的耳石體積、表面積和密度等顯著增加［7］，其影響機(jī)制可能與酸化情況下，HCO－3濃度上升導(dǎo)致耳石周圍的內(nèi)淋巴液中文石飽和度增加有關(guān)［8］。骨骼是魚體質(zhì)量的重要組成部分，頭部和脊椎骨骼大約占魚體總質(zhì)量的10%～15%［9］。骨骼的主要成分是礦物質(zhì)如鈣、磷和膠原蛋白［10］。骨骼礦物質(zhì)是一種磷灰石，主要是一類鈣羥基磷灰石，并含有少量和痕量的其他成分，如碳（C）、鎂（Mg）和鈉（Na）。生物體內(nèi)CO2－3對(duì)PO3－4離子的替換，能夠?qū)е铝谆沂⒕Т笮∽冃『腿芙舛鹊脑龈撸?1］。而且生物微環(huán)境變化、血液中p H值以及HCO－3或者CO2－3都可導(dǎo)致生物體內(nèi)幾種磷灰石形式的轉(zhuǎn)變［12－13］。目前，海洋酸化對(duì)仔稚魚骨骼發(fā)育影響的研究極少，并且研究結(jié)果也不一致。Munday等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)600～850 μatm的不同酸化處理后，多棘雀鯛（Acanthochromis polyacanthus）稚魚的骨骼參數(shù)的變化與酸化處理之間沒(méi)有必然相關(guān)性［14］。但是，在對(duì)塞內(nèi)加爾鰨（Solea senegalensis）進(jìn)行升溫和酸化的綜合處理后，造成了31.5%的畸形率，畸形主要發(fā)生在頭骨、脊柱、鰭等部位［15］。有限的研究不能全面了解酸化對(duì)魚類骨骼發(fā)育的影響，因此有必要開展進(jìn)一步的研究。

海水青鳉（Oryziamelastigma）具有個(gè)體小、世代時(shí)間短、兩性特征明顯、每日均可產(chǎn)卵、卵透明等優(yōu)點(diǎn)，作為一種模式物種已廣泛應(yīng)用于海洋生態(tài)毒理學(xué)研究［16］。而且，淡水青鳉（Oryziaslatipes）已經(jīng)完成了全基因組測(cè)序［17］。因此，本文將海水青鳉作為研究對(duì)象，研究海洋酸化對(duì)其骨骼發(fā)育的影響，為全面、深入了解酸化對(duì)魚類影響形式及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)魚

海水青鳉成魚每天投喂3次初孵鹵蟲，養(yǎng)殖水溫23～28℃，每天吸底換水。受精卵經(jīng)新鮮海水沖洗干凈用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置與水化學(xué)

經(jīng)非色散式CO2測(cè)試計(jì)（TES-1370，臺(tái)灣泰仕）測(cè)定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CO2濃度為450×10－6，作為對(duì)照組。設(shè)兩個(gè)處理組，CO2濃度分別為1 200×10－6和1 800 ×10－6，取約300粒受精6 h之內(nèi)的受精卵放入5 L的三角錐形瓶中，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行，每組水溫為28℃。

實(shí)驗(yàn)用水是由曝氣自來(lái)水加入紅海鹽配制而成。對(duì)照組利用氣泵直接通入空氣，利用CO2加富器（CE 100，武漢瑞華）控制CO2濃度。利用p H計(jì)（SevenE-asy，METTLER TOLEDO）測(cè)量實(shí)驗(yàn)水p H值。鹽度采用鹽度折射計(jì)測(cè)量。海水總堿度采用滴定法測(cè)定。水中碳酸系統(tǒng)的其他參數(shù)利用CO2SYS軟件進(jìn)行計(jì)算［18］。

2.3 骨骼參數(shù)測(cè)量

每天檢查瓶?jī)?nèi)是否有初孵仔魚，當(dāng)發(fā)現(xiàn)初孵仔魚之后，放入－30℃冰箱中保存。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在每個(gè)平行組取10尾魚，每個(gè)處理共30尾魚，進(jìn)行骨骼的染色以及骨骼參數(shù)的測(cè)量。對(duì)初孵仔魚，先后采用阿利新蘭軟骨染色方法和茜素紅硬骨染色方法。在體視顯微鏡下拍照（Stereo Discovery.V12，ZEISS），并利用顯微鏡自帶軟件（Axio-Vision Rel.4.7）對(duì)骨骼參數(shù)進(jìn)行測(cè)量。由于初孵仔魚骨骼鈣化程度低，茜素紅染色不明顯，阿利新蘭染色較清晰，因此，根據(jù)軟骨染色著色情況進(jìn)行骨骼參數(shù)測(cè)量。頭骨骨骼著色較深，分別對(duì)頭部側(cè)面、腹面和背面的骨骼進(jìn)行測(cè)量。脊椎骨著色相對(duì)較淺，但椎骨間長(zhǎng)度差異不顯著，因此，每尾魚選取4個(gè)椎骨進(jìn)行了測(cè)量，取其平均值。選取測(cè)量骨骼參數(shù)的條件：（1）在大部分的樣品中均清晰可見(jiàn)；（2）測(cè)量時(shí)有明顯可辨別的起止點(diǎn)。測(cè)量的骨骼參數(shù)詳見(jiàn)圖1中海水青鳉魚骨骼染色照片。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方法分析（one-way ANOVA）和Duncan多重比較對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)水體碳酸鹽系統(tǒng)各參數(shù)測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)水體中碳酸鹽系統(tǒng)的各參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)水體中各實(shí)驗(yàn)組碳酸鹽系統(tǒng)參數(shù)值Tab.1 Summary of seawater carbonate system parameters in the cultures

3.2 海水酸化對(duì)青鳉魚骨骼參數(shù)的影響

在對(duì)所有初孵仔魚進(jìn)行觀察后，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他明顯可辨別的畸形。初孵仔魚骨骼染色圖及主要骨骼示意圖見(jiàn)圖1，測(cè)量的各個(gè)骨骼參數(shù)起止點(diǎn)示意圖見(jiàn)圖2。

圖1 海水青鳉初孵仔魚骨骼染色及解剖示意圖Fig.1 The staining and anatomical schematic pictures of bones in marine medaka larvae

對(duì)照組中各個(gè)骨骼參數(shù)數(shù)值及3個(gè)實(shí)驗(yàn)組間骨骼參數(shù)的差異顯著性分析結(jié)果，如表2所示。對(duì)實(shí)驗(yàn)魚28個(gè)骨骼參數(shù)進(jìn)行了測(cè)量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，酸化處理對(duì)實(shí)驗(yàn)魚所測(cè)量的骨骼長(zhǎng)度影響均不顯著。而且，經(jīng)過(guò)酸化處理后，所測(cè)定的28個(gè)骨骼長(zhǎng)度并不呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，而是呈隨機(jī)變化，與酸化處理水平之間沒(méi)有相關(guān)性。

圖2 實(shí)驗(yàn)中測(cè)量的各骨骼參數(shù)的起止點(diǎn)示意圖Fig.2 The schematic pictures of measured skeleton parameters which start and ending points were shown

表2 各組中骨骼參數(shù)平均長(zhǎng)度以及這些參數(shù)的組間差異Tab.2 The average of lengths of parameters of skeletons in three groups and their differences among groups

續(xù)表2

4 討論

目前空氣中CO2平均濃度已超過(guò)380×10－6，若以每年0.5%的速度增加，推測(cè)至本世紀(jì)末將CO2濃度將至1 000×10－6，至2300年將至1 900× 10－6［1，19—20］。本文的研究提示，未來(lái)100～200年間海洋酸化對(duì)海水青鳉的胚胎及初孵仔魚的骨骼發(fā)育沒(méi)有明顯的影響。

魚類的骨骼主要是由磷酸鈣和軟骨質(zhì)物質(zhì)組成［21］，而非碳酸鈣，所以海洋酸化對(duì)骨骼的直接影響較少，但是酸化情況下伴隨魚體內(nèi)碳酸氫鹽和非碳酸氫鹽的緩沖調(diào)節(jié)系統(tǒng)的改變，可能間接的影響骨骼發(fā)育。骨骼的主要成分磷灰石有多種存在形式，在生物體內(nèi)各種磷灰石的形成，受p H、溫度和組成成分的影響，而且在HCO－3或者CO2－3存在的p H呈中性或堿性時(shí)，也會(huì)促使不同溶解度的磷灰石成分之間的轉(zhuǎn)換［12］。體外實(shí)驗(yàn)也證明，骨骼礦化過(guò)程中，從非結(jié)晶磷酸鈣到羥化磷灰石的轉(zhuǎn)變會(huì)受到CO2－3濃度的影響［22］。在本文的實(shí)驗(yàn)條件下，未來(lái)100～200年間海水酸化水平，對(duì)青鳉魚的胚胎及初孵仔魚的骨骼發(fā)育沒(méi)有明顯的影響。同樣，在CO2分壓為850μatm情況下，多棘雀鯛仔稚魚29個(gè)骨骼參數(shù)與對(duì)照組相比，也沒(méi)有顯著差別［14］。魚類由于生活于水中，與陸生動(dòng)物相比，需要呼出更多CO2以獲得足夠的氧氣，因此正常情況下其體內(nèi)HCO－3濃度較低。處于酸化水體中的魚類，體內(nèi)HCO－3濃度會(huì)相應(yīng)升高，但由于魚類成體具備較好的酸堿調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)鰓表面、腎、腸等組織，能夠排出體內(nèi)過(guò)多的HCO－3和H＋［23］。然而，在仔稚魚階段，其體內(nèi)的組織器官發(fā)育不成熟，對(duì)酸化處理較敏感。但是本研究中海洋酸化沒(méi)有明顯影響海水青鳉魚胚胎期骨骼發(fā)育。推測(cè)主要原因是海水青鳉原產(chǎn)于CO2自然變化范圍較大的沿海，使其對(duì)實(shí)驗(yàn)中CO2變化耐受力較高。海水青鳉原產(chǎn)于印度和孟加拉國(guó)沿海［24］，沿海地區(qū)是具有重要生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋生物的主要棲息地，同時(shí)由于生物量的季節(jié)變化、河流沖淡水、上升流和沿岸人類活動(dòng)影響等原因，造成水體中CO2濃度自然變化較大，變化幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)外海的CO2自然變化［25］。

全球氣候變化效應(yīng)的研究中，溫度與CO2是緊密相聯(lián)的。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，溫度升高、缺氧與酸化等環(huán)境脅迫因子可能同時(shí)存在，它們之間共同作用對(duì)海洋生物的影響可能比單一海洋酸化的影響更為嚴(yán)重［26—27］。Pimental等報(bào)道，升溫和酸化綜合處理塞內(nèi)加爾鰨（S.senegalensis）稚魚，嚴(yán)重影響其骨骼發(fā)育［15］。目前，海洋酸化引起魚體碳酸鹽體系的變化對(duì)于骨骼發(fā)育、磷酸鈣形成的影響機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。淡水青鳉魚已經(jīng)完成基因組測(cè)序，海水青鳉魚與其親緣關(guān)系較近，因此，在將來(lái)的研究中，可以利用分子生物學(xué)技術(shù)，深入研究海洋酸化與其他環(huán)境因子協(xié)同作用下，海水青鳉魚體內(nèi)碳酸鹽系統(tǒng)和磷酸鹽系統(tǒng)之間的生理調(diào)節(jié)機(jī)制。

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Impact of ocean acidification on skeletal development in embryonic marine medaka

Wang Xiaojie1，2，3，Xiao Xiao1，Li Chao1，Yue Na1

（1.Institute for Marine Biosystem and Neurosciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.International Center of Marine Study，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3.Key Laboratory of Exploration and Utilization of A-quatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In this study，the impact of ocean acidification on the skeletal development in embryonic marine medaka was investigated.The seawater carbonate system in the water was maintained stable by aerating with ambient air（450×10－6CO2）and CO2-enriched air（1 160×10－6or 1 783×10－6CO2）.Newly fertilized medaka eggs were exposed to three levels ofpCO2／p H（8.14，7.85 and 7.67）until to the main hatch occurring.Skeletons of 30 newhatched larvae from each CO2treatment were cleared，stained and photographed.Lengths of well stained 28 skeletal elements for ecah fish was measured using digital photograph and analyzed by image analysis software.Results showed that，the effects of exposure to elevated CO2concentrations on the length of representative skeletal elements were not significant.It suggested that the skeletal development of marine medaka would not be seriously affected by the changes in CO2concentrations that are predicted to occur over the next 100 to 200 years.

Oryziasmelastigma；ocean acidification；skeletal development

X174

A

0253-4193（2015）12-0116-07

王曉杰，肖瀟，李超，等.海洋酸化對(duì)海水青鳉胚胎骨骼發(fā)育的影響［J］.海洋學(xué)報(bào)，2015，37（12）：116—122，

10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.012

Wang Xiaojie，Xiao Xiao，Li Chao，et al.Impact of ocean acidification on skeletal development in embryonic marine medaka［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（12）：116—122，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.012

2015-02-09；

2015-09-29。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41306097）；中國(guó)科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KLMEES2013）。

王曉杰（1979—），女，山東省龍口市人，講師，研究方向：海洋生態(tài)學(xué)、魚類神經(jīng)生物學(xué)。E-mail：xj-wang＠shou.edu.cn