泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽抗菌活性及其機理研究

王娟娟，包永波，王素芳1，，林志華*

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211；2.浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協同創(chuàng)新中心，浙江寧波 315211；3.浙江萬里學院浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江寧波 315100）

泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽抗菌活性及其機理研究

王娟娟1，2，包永波3，王素芳1，3，林志華3*

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211；2.浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協同創(chuàng)新中心，浙江寧波 315211；3.浙江萬里學院浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江寧波 315100）

采用凝膠層析技術從泥蚶血細胞裂解物中純化得到兩種血紅蛋白Tg-HbⅡ（異源四聚體）和Tg-HbⅠ（同源二聚體），回收率分別為48.15%和24.91%。胰蛋白酶酶解Tg-HbⅡ，酶解液經反相C-18色譜柱分離純化得7種血紅蛋白源多肽F1～F7。通過瓊脂擴散法檢測酶解多肽抑菌活性，結果發(fā)現7種多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌和堅強芽孢桿菌均無抑菌作用，但多肽F2～F7對副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌具有明顯抗菌活性，且多肽F2～F7對副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌的MIC值在0.012～0.200 mg／m L范圍內。熒光顯微鏡觀察酶解多肽殺菌效果發(fā)現多肽殺菌迅速，5 min內弧菌細胞幾乎全部死亡。利用透射電子顯微鏡觀察正常的和經抗菌肽處理后的溶藻弧菌和哈維氏弧菌細胞的超微結構，結果顯示，對照組正常細胞內部結構完整，而經抗菌肽處理過的細胞其細胞壁完整，但因缺乏細胞內容物支持導致局部區(qū)域內陷，細胞質膜明顯收縮，細胞內物質外流形成許多空泡從而導致細胞死亡。研究結果表明血紅蛋白源抗菌肽對泥蚶致病菌弧菌有明顯的抗菌活性，其通過破壞細胞內部結構而起到殺菌作用，這些發(fā)現為血紅蛋白抗菌機制的研究奠定了基礎。

泥蚶；酶解多肽；反相高效液相色譜；抗菌活性；超微結構；抗菌機理

1 引言

抗菌肽（antibacterial peptides，AMP）是一類具有抗菌活性的小分子蛋白質物質［1］，廣泛地分布在各類生物體內，是無脊椎動物、脊椎動物和植物等生物非特異性免疫的關鍵因子［2］。近年來，國內外相關研究發(fā)現，不僅從生物體內提取的某些多肽具有生物活性，蛋白質經酶解處理后也會產生具有特殊功能的活性肽［3］，Estelle等研究發(fā)現，牛血紅蛋白經酶解作用產生的某些肽段具有抗菌作用，而且肽段不同抗菌特性和活力也不同［4］。趙玲等通過瓊脂擴散抑菌試驗發(fā)現南極磷蝦酶解產生的多肽對金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌活性［5］?？咕囊蚓哂锌咕V廣泛、快速查殺靶細胞、熱穩(wěn)定性好，特別是對靶菌株不易產生耐藥性等優(yōu)勢，被認為是未來取代抗生素的上佳選擇［6］。

泥蚶（Tegillarcagranosa），隸屬于軟體動物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），是我國傳統養(yǎng)殖貝類之一。因其體內富含特有的血紅蛋白，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛。近年來，海洋污染日益加劇，致使泥蚶在養(yǎng)殖過程中經常受到病原菌感染而造成大面積死亡［7］。由于泥蚶不具有特異性免疫系統，只能依靠體液因子和血細胞的非特異性免疫系統來抵御生活環(huán)境中病原微生物的侵襲。王素芳等［8］研究發(fā)現泥蚶血紅蛋白通過其過氧化物酶活性產生ROS，從而起到對部分革蘭氏陰性菌大腸桿菌和惡臭假單胞菌的抑菌作用，但對貝類致病菌弧菌卻沒有抗菌活性；Xu等［9］研究表明毛蚶血紅蛋白對革蘭氏陽性菌有明顯的抗菌活性。本研究試圖從血紅蛋白源抗菌肽這一可能的機制入手，來分析泥蚶血紅蛋白酶解多肽是否具有抗菌活性，為血紅蛋白抗菌機制研究奠定基礎。另外，泥蚶血紅蛋白酶解多肽抗菌作用的研究幾乎沒有報道，因此進行泥蚶血紅蛋白酶解多肽抗菌活性及其殺菌機理的研究對深入認識泥蚶自身免疫反應具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗用泥蚶材料取自于寧波市鄞州區(qū)丹艷養(yǎng)殖基地。溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、惡臭假單胞桿菌（Pseudomonasputida）、堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和大腸桿菌（Eschetichiacoli）為浙江萬里學院微生物實驗室提供。胰蛋白酶為Promega公司產品，乙腈（ACN）和三氟乙酸（TFA）為質譜純，純凈水為杭州哇哈哈集團有限公司生產，其他試劑均為國產分析純。

2.2 主要儀器

均質機（SH-2A，IKA公司），紫外分光光度計（3300 pro，美國Amershaw），凝膠排阻色譜柱SephacryS-100HR（HiPrep26／60，GE公司），AKTA蛋白層析系統（pure 150，GE公司），反相C-18色譜柱（YMC-Pack-ODS-A250×10 mm，日本YMC），恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162，上海慧泰儀器制造有限公司），搖床（HZ-9211KB，江蘇同君儀器科技有限公司），Nano Vue plus超微量紫外分光光度計（GE公司），Triple TOF 5600高分辨液相色譜質譜聯用系統（AB SCIEX公司），熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE 80i，尼康公司），透射電子顯微鏡（H-7650，HITACHI日立公司）。

2.3 泥蚶血紅蛋白的分離純化

將采集于養(yǎng)殖池塘的活體泥蚶洗凈后，置于海水晶配制的海水中吐泥沙5 h。撬開貝殼后，用針筒采集血液，裝在含有抗凝劑的10 m L離心管中，1 500 r／min轉速4℃冷凍離心10 min，血細胞沉淀，除去上層清液。用0.9%的NaCl溶液多次漂洗血細胞直至上層溶液無色澄清，血細胞加適量磷酸鹽緩沖液后進行勻漿破碎，最后以12 000 r／min高速低溫離心30 min除去細胞碎片，上清為血紅蛋白粗產品。將獲得的血紅蛋白粗產品過Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱，用p H為7.2磷酸鹽緩沖液以0.2 m L／min的流速洗脫，1 m L／管收集洗脫液，280 nm和415 nm波長檢測洗脫液。

2.4 泥蚶血紅蛋白濃度測定

采用考馬斯亮藍法進行泥蚶血紅蛋白濃度的測定［10］。用50 mmol／L PBS對標準濃度為1.4 mg／mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液進行梯度稀釋，配制成濃度分別為0.2、0.4、0.6和0.8 mg／mL的BSA標準液。取上述BSA標準液和待測的泥蚶血紅蛋白樣品各10 u L，分別與1 m L考馬斯亮藍G250染液充分混勻，在室溫下靜置反應5 min后，用紫外分光光度計檢測各混合物在595 nm波長處的吸光度（蛋白質－色素結合物在595 nm有最大光吸收）。以BSA各濃度梯度為橫坐標、對應的A595值為縱坐標，繪制蛋白濃度標準曲線，再根據樣品在595 nm波長處的吸光值以及標準曲線方程式計算泥蚶血紅蛋白濃度（mg／mL）。

2.5 泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解

經Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱過濾后收集的Tg-HbⅡ，按胰蛋白酶：HBII為1∶20于50 mmol／L NH4HCO3（p H7.6）中恒溫在37℃水浴中反應4 h。吸取酶解液于超濾離心管（3 kDa），超速離心30 min以除去多余的胰蛋白酶，終止酶切反應。將濾出液收集到空離心管中，在35℃下真空干燥濃縮60 min以除去NH4HCO3，繼續(xù)干燥濃縮至樣品量到含少量液體，此樣品為HbⅡ酶解液。

2.6 HbⅡ酶解液分離純化

采用反相高效液相色譜法進行分離。酶解液過反相C-18色譜柱，用A液（0.1%三氟乙酸）和B液（0.1%三氟乙酸和60%乙腈），以3 mL／min流速0%～100%B液梯度洗脫20 min，1 m L／管收集洗脫液，用220 nm波長檢測洗脫液。

2.7 瓊脂擴散法測抑菌活性

培養(yǎng)細菌至對數生長期，用無菌生理鹽水配制成105cfu／m L的菌懸液，取200μL菌懸液均勻涂布于配制好的固體培養(yǎng)基上，放置好牛津杯后，依次加入200μL多肽F1（0.048 mg／mL）、F2（0.083 mg／mL）、F3（0.077 mg／m L）、F4（1.404 mg／m L）、F5（0.123 mg／mL）、F6（1.096 mg／mL）、F7（0.238 mg／mL）多肽洗脫液。大腸桿菌、不動桿菌、惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和堅強芽孢桿菌置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌則置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，取出后拔去牛津杯觀察并拍照保存實驗結果。為了確保實驗的準確性，每種待測菌種各做3次獨立平行實驗。

2.8 最低抑菌濃度（MIC）測定

采用微量肉湯稀釋法。超凈工作臺內無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的多肽分別加到滅菌過的96孔板中，第1至第11孔加多肽，每孔100μL，第12孔不加多肽作為生長對照。采用生長法制備濃度為0.5麥氏比濁標準的菌懸液，用MH肉湯按1∶1 000比例稀釋后，向每孔中加100μL菌懸液，密封后將弧菌置于28℃，其他菌則置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育12 h后觀察判斷最低抑菌濃度。為確保實驗科學性，酶解多肽F2～F7洗脫液對每種試驗菌各做3次獨立平行實驗，將3次試驗結果平均值作為多肽對待測菌的最低抑菌濃度。

2.9 熒光顯微法觀察殺菌效果

將對數生長期的弧菌用無菌生理鹽水配制成105cfu／m L菌懸液，取10μL菌液與10μL多肽F4洗脫液混勻作用5 min，對照組為加10μL 50 mmol／L PBS與10μL菌液混勻作用5 min，5 000 r／min轉速離心5 min使菌體沉淀，用PBS漂洗3次以除去多肽，最后加10μL生理鹽水懸浮菌體，用LIVE／DEAD核酸熒光染料試劑盒染色后，取1μL菌液于載玻片上，蓋上蓋玻片后用熒光顯微鏡觀察活菌數量。

2.10 透射電鏡觀察抗菌肽對溶藻弧菌超微結構的影響

培養(yǎng)弧菌至其對數生長期，5 000 r／min轉速離心5 min使菌體沉淀，用0.1 mol／m L p H 7.2磷酸鹽緩沖液稀釋為1×105cfu／m L。取2份1 m L弧菌菌液，其中一份加入200μL多肽F4洗脫液，另一份加200μL 50 mmol／L PBS做為對照組，28℃培養(yǎng)2 h后，將菌液5 000 r／min轉速離心5 min，沉淀的菌體。2.5%戊二醛4℃固定24 h，經1%四氧化鋨固定1 h，經50 mmol／L磷酸緩沖液漂洗，酒精梯度脫水，包埋、切片、染色后用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2.11 多肽質譜鑒定

通過抑菌實驗發(fā)現，多肽F2～F7對溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌均具有明顯抗菌活性，進一步分析其氨基酸序列組成。將上述具有抑菌活性的多肽F2～F7采用MALDI-TOF-MS做質譜檢測分析，將得到的數據用Proteinpilot軟件檢索比對，得到抗菌肽氨基酸序列。

3 結果與分析

3.1 泥蚶血紅蛋白異源四聚體及其酶解多肽的分離純化

泥蚶血紅蛋白粗產品經凝膠過濾柱洗脫后，洗脫圖譜如下圖1所示。已有文獻報道［8，10］，根據280 nm和415 nm（蛋白質在280 nm波長附近特征性吸收峰，而Tg-Hb在415 nm波長處有獨特的吸收峰），兩種波長下的檢測圖譜，判斷峰1為雜蛋白，峰2為異源四聚體（HbⅡ），峰3為同源二聚體（HbⅠ），其中，Tg-HbⅡ的回收率為48.15%，Tg-HbⅠ的回收率為24.91%（見表1）。

圖1 泥蚶血紅蛋白的凝膠層析圖Fig.1 Gel chromatography of Tg-Hb

利用反相C-18色譜柱對Tg-HbⅡ酶解多肽梯度洗脫，用乙腈－水（60∶40，體積比）作為流動相，以3 m L／min流速0%～100%B液梯度洗脫20 min，用220 nm波長檢測洗脫液［4］。洗脫圖譜見圖2。圖譜中有7個主要峰，其保留時間適中，各峰能夠達到較好的基線分離且峰形較好，代表了7種純凈多肽，分別以1 m L／管收集洗脫液備用。

表1 泥蚶血紅蛋白的回收率Tab.1 Recovery of Tg-HbⅡfrom the blood of Tegillarca granosa

圖2 泥蚶Tg-HbⅡ酶解多肽的反相C-18色譜圖Fig.2 Reverse phase C-18 of peptides from enzymolysis Tg-HbⅡ

3.2 Tg-HbⅡ酶解多肽的抗菌活性

采用瓊脂擴散法檢測了7種多肽對5種革蘭氏陰性菌即大腸桿菌、惡臭假單胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌以及3種革蘭氏陽性菌即金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和堅強芽孢桿菌的抗菌活性。實驗結果表明，多肽F2～F7對3種海洋性弧菌哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌均有明顯抗菌效果而未檢測到對其他幾種菌有抑菌圈，而F1對所有試驗菌均無抑菌活性（圖3），F2對溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌的MIC分別為0.012 mg／mL，0.012 mg／m L和0.024 mg／m L，F3對3種菌均為0.020 mg／mL，F4分別為0.200 mg／m L，0.100 mg／mL和0.200 mg／mL，F5對3種菌均為0.019 mg／m L，F6分別為0.075 mg／m L，0.075 mg／m L和0.150 mg／mL，F7分別為0.096 mg／m L，0.190 mg／m L和0.096 mg／mL（表3），從中可以發(fā)現幾種多肽抗菌作用具有選擇性且活性差別較大。

3.3 熒光顯微鏡觀察Tg-HbⅡ酶解多肽殺菌作用

圖3 多肽對溶藻弧菌的抑菌環(huán)Fig.3 Antibacterial circles of peptides toV.alginolyticus

表2 泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽對8種菌的抗菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of peptides against 8 kinds of bacterias

表3 泥蚶Tg-HbⅡ酶解多肽序列及最低抑菌濃度Tab.3 Sequences and the minimal inhibitory concentrations of all peptide fractions obtained from Tg-HbⅡhydrolysate

熒光顯微鏡觀察顯示，利用LIVE／DEAD熒光核酸染料染溶藻弧菌細胞核酸，該染料中含Calcein-AM和EthD-1兩種染料。Calcein-AM分子能透過細胞質膜，可在各種酯酶的作用下，轉化為很強的綠色熒光物質，并且保留在胞內無法擴散出完整的膜結構，使活細胞經染色后顯示綠色熒光；EthD-1則是一種膜不通透的染料，能進入破損的細胞質膜和核膜，死細胞因通透性增加經染色后顯示紅色熒光。如圖4所示，A為50 mmol／L PBS處理溶藻弧菌作為對照組，熒光明亮且細胞分布均勻，死細胞較少或幾乎不含死細胞；B為經多肽F1處理，多肽F1無抑菌活性，其結果與正常對照組一樣顯示明亮綠色熒光，且活細胞數量與對照組相當；但弧菌經多肽F2～F7作用5 min后（C-H），綠色熒光明顯淬滅，且死細胞也未發(fā)出紅色熒光，表明細胞經抗菌肽作用后，弧菌細胞通透性屏障受損，其核心遭到破壞。

圖4 溶藻弧菌的熒光顯微觀察圖Fig.4 Fluorescence microscopic observation ofV.alginolyticus

圖5 正常哈維氏弧菌和抗菌肽處理的哈維氏弧菌透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopes ofV.harveyi

3.4 透射電鏡觀察觀察抗菌肽對弧菌的作用

圖6 正常溶藻弧菌和抗菌肽F4處理的溶藻弧菌透射電鏡圖Fig.6 Transmission electron microscopes ofV.alginolyticusand treated with antimicrobial peptide F4

通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現抗菌肽破壞了細胞結構導致細胞死亡，利用電鏡進一步觀察經抗菌肽處理后的弧菌細胞內部受損情況。如圖5和圖6所示，兩圖中A和B是未經抗菌肽處理的弧菌細胞，其結構完整，表面光滑，細胞壁層次分明、清晰可見。C～F是經抗菌肽作用30 min的弧菌細胞，其細胞質膜收縮（圖6C），溶藻弧菌細胞因內容物外泄形成許多大小不一的空泡（圖6D），弧菌死亡細胞的細胞壁依然完整，只是局部區(qū)域凹陷（圖6C，D）。通過電鏡觀察溶藻弧菌和哈維氏弧菌兩種弧菌，證實了抗菌肽作用使弧菌細胞內容物泄漏，是導致細胞死亡的主要原因。

4 討論

4.1 泥蚶血紅蛋白的分離純化

開展Tg-HbⅡ酶解多肽免疫學研究的前提是得到高純度的Tg-HbⅡ，王素芳等在泥蚶血紅蛋白的制備及其抗菌活性研究中，通過質譜檢測確定泥蚶血紅蛋白含有同源二聚體和異源四聚體兩種形式，并采用凝膠過濾方法分離純化得到高純度Tg-HbⅡ和Tg-HbⅠ［8］。Bao等已經成功克隆Tg-Hb 3個亞基的基因Tg-HbⅡA、Tg-HbⅡB和Tg-HbⅠ，并用相關軟件預測其分子量分別為16.23 kDa，17.23 k Da和16.04 kDa，等電點分別為5.745，8.836和9.144，因此推測Tg-HbⅡ和Tg-HbⅠ的分子量分別約為67 k Da和32 k Da［11］。Tg-HbⅡ、Tg-HbⅠ和雜蛋白分子量存在較大差異，利用凝膠層析技術能較好地將雜蛋白和血紅蛋白分開，同時兩種血紅蛋白在凝膠層析所用磷酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性也比較好。本研究采用280 nm和415 nm兩種波長檢測Tg-Hb洗脫峰，能夠較好地快速判定Tg-Hb出峰情況。

4.2 泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽的分離純化

反相高效液相色譜（reverse-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）是目前分離純化多肽物質的主要手段之一，其在多肽分離純化中運用十分廣泛［12］。在RP-HPLC流動相中，水有較高的比重，因此能較好地與多肽水溶性的生物學性質相適應，盡管其流動相中的乙腈等有機溶劑、三氟乙酸以及固定相均有可能使多肽的天然構象發(fā)生改變，但一旦去除這些因素后，一般多肽構象能夠恢復原狀而保持其特有的生物學活性，采用RP-HPLC技術純化多肽回收率可達80%以上［12］。楊化新等利用RPHPLC技術，通過C-18色譜柱成功檢測了重組人生長激素的肽片段［13］。本研究中Tg-HbⅡ經胰蛋白酶酶解后，獲得較小分子量多肽片段。應用RP-HPLC技術成功分離純化得到7種主要肽段，分子量在1～4 k Da范圍內，去除洗脫液中的有機溶劑以后，多肽保持較好的活性。

4.3 泥蚶血紅蛋白酶解多肽的抗菌活性

抗菌肽研究的興起是從20世紀80年代初開始的，1980年由Boman等［14］從天蠶蛹中發(fā)現第一種抗菌肽天蠶素，并于次年測得了其氨基酸序列。此后，科學家們從各生物體內發(fā)現并提取了上千種抗菌肽，加上酶解及合成的抗菌肽，已構成龐大的抗菌肽數據庫。雖然抗菌肽眾多，但其結構具有一些共同之處，大多數抗菌肽具有強堿性，C端富含丙氨酸、亮氨酸等非極性氨基酸，N端精氨酸和賴氨酸等極性氨基酸較豐富［15］。Daoud等［16］研究發(fā)現牛血紅蛋白經酶解后的某些肽段對無害利斯特菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、及腸炎沙門氏菌有較強抗菌活性，這些肽段與抗菌肽具有類似的特點。據文獻報道，生物體在特殊條件下會自身水解某類蛋白質產生具有活性的肽段。Lee［17］等研究發(fā)現淡水小龍蝦在酸性條件下會水解其血藍蛋白的羧基末端產生活性肽astacidin1。本研究采用胰蛋白酶酶解泥蚶血紅蛋白異源四聚體，使其酶解產生的肽段末端為Lys或Arg，符合抗菌肽特征。結果發(fā)現酶解產生的大部分多肽對哈維氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌海洋性弧菌具有明顯的抑菌活性。

國內外學者研究發(fā)現抗菌肽主要有三類殺菌機制：第一類主要作用于細胞質膜，增加細胞質膜通透性，致使胞內物質外流而死亡；第二類主要是抗菌肽作用于宿主細胞后，激活了機體的免疫應答反應；第三類是抗菌肽通過抑制細胞呼吸或抑制細胞某些細胞器功能從而起到抑菌效果［18］。Viljanen等［19］發(fā)現人體內抗菌肽可以使細菌細胞質膜通透性增加，致使Trion X-100等物質更易進入細菌細胞內部。Uyterhoeven等［20］發(fā)現抗菌肽buforinⅡ進入細胞后與核酸（RNA／DNA）緊密結合，抑制了基因復制和表達，從而起到殺菌作用。正常細菌細胞質膜上的微孔僅容許1 nm以下的小分子物質通過［21］。利用透射電子顯微鏡觀察經抗菌肽作用后的哈維氏弧菌和溶藻弧菌細胞，發(fā)現抗菌肽處理后的弧菌細胞，其細胞質膜通透性增加，胞內物質外流導致細胞內部結構嚴重損壞只剩細胞壁空架，從而導致細胞死亡，屬于抗菌肽第一類殺菌機制。

本研究用胰蛋白酶酶解Tg-HbⅡ使之產生以賴氨酸或精氨酸為末端的肽段，發(fā)現大部分酶解肽段對副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌等海洋性弧菌具有抗菌作用，而對大腸桿菌、惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌、堅強芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等一般性陸生菌則無抑菌活性，說明酶解產生肽段的抗菌作用具有選擇性。猜測很可能與泥蚶生活習性相關，因泥蚶是一種埋棲于沿海灘涂的雙殼貝類，難免受到常見海洋性弧菌如副溶血弧菌等的威脅，從而進化出一套獨特的免疫系統，其可能只對海洋性致病菌具有殺菌作用，而對一般陸生菌則無抗菌活性。但為什么酶解多肽的抗菌作用有選擇性，這需要進一步深入研究。同時，通過熒光顯微鏡和電鏡觀察其抗菌機理，證實了抗菌肽通過增加細胞質膜通透性使胞內物質外流而起到殺菌作用。這些發(fā)現，為泥蚶血紅蛋白抗菌機制研究提供了一個新方向。

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Antibacterial activity and mechanisms of heterotetramer hemoglobin derived polypeptide from Tegillarca granosa

Wang Juanjuan1，2，Bao Yongbo3，Wang Sufang1，3，Lin Zhihua3

（1.School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Ocean Efficient Healthy Culture，Ningbo 315211；3.Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

Tg-HbⅡ（heterogeneous tetramer）and Tg-HbⅠ（homodimer）were purified by gel chromatography with a recovery 48.15%and 24.91%.Seven major peptides（F1－F7）were purified by reverse phase C-18 column from trysin enzymatic hydrolysates of Tg-HbⅡ.The agar diffusion method was used to detect their antibacterial activity.Results showed that all peptide collections exhibited no antibacterial activity toStaphylococcusaureus，Pseudomonasputida，Eschetichiacoli，BacillusfirmusandB.subtilis；but peptides F2－F7 showed antibacterial activity againstVibrioalginolyticus，V.harveyiandV.parahaemolyticus.MICs of peptide F2－F7 towardV.alginolyticus，V.parahaemolyticusandV.harveyiwere 0.012－0.200 mg／m L Using fluorescence microscopy to observe the cell that treated with peptide，found that vibrio cells die rapidly in 5 min.Using Transmission electronmicroscopy to observeV.alginolyticusandV.harveryiafter antibacterial peptides treatment，the results showed that the peptides changed permeability of cytoplasmic membrane，leading to leaking out of cytoplasmic contents.Finally，the affected Vibrio died due to leakage of the cell contents.Research results showed that theTegillarca granosahemoglobin source of antimicrobial peptides have obvious antibacterial activity against vibrio and antimicrobial peptides kill bacteria by damaging its internal structure，these findings laid a solid foundation to the research of antibacterial mechanism of hemoglobin.

Tegillarcagranosa；enzymolysis peptides；RP-HPLC；antibacterial activity；ultrastructure；antibacterial mechanism

S917.4

A

0253-4193（2015）12-0106-10

王娟娟，包永波，王素芳，等.泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽抗菌活性及其機理研究［J］.海洋學報，2015，37（12）：106—115，

10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.011

Wang Juanjuan，Bao Yongbo，Wang Sufang，et al.Antibacterial activity and mechanisms of heterotetramer hemoglobin derived polypeptide fromTegillarcagranosa［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（12）：106—115，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.011

2015-07-20；

2015-09-28。

國家高技術研究發(fā)展計劃項目（2012AA10A410）；浙江省自然科學重點基金項目（LZ12C190001）；浙江省重中之重學科開放基金項目（KF2014002）；寧波市自然科學基金（2015A610258）。

王娟娟（1990—），女，浙江省蘭溪市人，主要從事海洋生物學研究。E-mail：425107946＠qq.com

*通信作者：林志華，研究員，主要研究方向為水產動物繁育及遺傳育種。E-mail：zhihua9988＠126.com