微波輔助甲酯化-快速GC 法測定煙草中的多元酸和高級脂肪酸

朱 玲，鄭 健，楊 涓，安泓汋，王 晶，龍 君，朱立軍

川渝中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)研發(fā)中心，成都市錦江區(qū)成龍大道56號 610066

微波輔助甲酯化-快速GC 法測定煙草中的多元酸和高級脂肪酸

朱 玲，鄭 健，楊 涓，安泓汋，王 晶，龍 君，朱立軍*

川渝中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)研發(fā)中心，成都市錦江區(qū)成龍大道56號 610066

建立了同時檢測煙草中多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸）和高級脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸）的微波輔助甲酯化-快速氣相色譜（GC）分析方法，并測定了烤煙及雪茄煙各10個煙葉樣品中的多元酸和高級脂肪酸含量（質(zhì)量分數(shù)）。結(jié)果表明：①最優(yōu)前處理條件為衍生化試劑10%硫酸-甲醇溶液，微波功率以20W/s的速率升高至1200W（保持1 m in），萃取劑二氯甲烷。②快速GC分析時間為8．81m in，目標化合物標準曲線線性良好（r2＞0．99），加標回收率在83．18%～114．17%之間，精密度（RSD）小于5%。③烤煙煙葉和雪茄煙煙葉中有機酸含量差異較大，其中烤煙煙葉中多元酸（除蘋果酸外）含量低于雪茄煙煙葉，高級脂肪酸（除硬脂酸外）含量高于雪茄煙煙葉。該方法快速、準確，適用于測定煙草中的多元酸和高級脂肪酸含量。

煙草；微波輔助甲酯化；快速氣相色譜（GC）；多元酸；高級脂肪酸

煙草中的非揮發(fā)性多元酸和高級脂肪酸占煙葉質(zhì)量的10%左右，其種類和含量是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一［1］。多元酸能與生物堿結(jié)合成鹽，調(diào)節(jié)質(zhì)子化和游離態(tài)煙堿比例，從而影響煙葉的勁頭和吸味，其中蘋果酸、檸檬酸、草酸等多元酸還是卷煙加料的常用成分，可以調(diào)節(jié)卷煙煙氣pH、增加煙氣濃度、改善吸味、使煙氣醇和［2］。飽和高級脂肪酸會增加煙氣的脂肪或蠟味，亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸則會增加刺激性［3］。因此，分析多元酸和高級脂肪酸的種類及含量對了解煙葉的內(nèi)在質(zhì)量和改進卷煙配方具有重要的指導意義。目前，多元酸和高級脂肪酸的檢測常用硫酸-甲醇作為衍生化試劑直接甲酯化，然后進行氣相色譜(GC)分析［1,3-7］。由于甲酯化反應大多采用室溫靜置或加熱回流的方法，GC法主要使用常規(guī)色譜柱，因而存在甲酯化反應及色譜分析樣品耗時長、操作繁瑣、檢測效率較低等問題。微波加熱具有滲透力強、升溫速率快、加熱效率高等特性［8-9］，能顯著提高有機酸的提取和酯化效率；快速GC采用微孔毛細管短柱，能顯著縮短色譜分析時間［10］，適合大量樣品的快速分析。因此，建立了微波輔助甲酯化-快速GC測定煙草中多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸）和高級脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸）的分析方法，旨在為煙草中多元酸和高級脂肪酸的快速檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

國內(nèi)外烤煙及雪茄煙煙葉樣品各10個，均由川渝中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)研發(fā)中心提供。其中烤煙煙葉樣品生產(chǎn)年份均為2012年，雪茄煙煙葉樣品為2009—2011年。

二氯甲烷（色譜純，美國Fisher Chemical公司）；甲醇、硫酸（AR，國藥集團化學試劑有限公司）。草酸（美國Sigma-Aldrich公司），丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、蘋果酸、一水合檸檬酸（國藥集團化學試劑有限公司），己二酸（內(nèi)標，日本TCI公司），硬脂酸（瑞士Fluka公司），棕櫚酸（德國Merck公司），亞油酸（比利時Acros公司），以上標樣純度均大于98%。

HP6890型氣相色譜/HP5973質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；Multiwave PRO微波樣品制備儀（奧地利Anton Paar公司）；MS204S電子天平（感量：0.000 1g，瑞士Mettler Toledo公司）；3K-15離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q Direct 16純水機（美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 標準工作溶液的配制

內(nèi)標溶液：取1.60 g己二酸，于100mL容量瓶中用甲醇定容，配制一級內(nèi)標儲備液；取一級內(nèi)標儲備液10mL，用甲醇稀釋至100m L，得到二級內(nèi)標溶液，于4℃冰箱中保存。

系列標準工作溶液：準確稱取2.50 g蘋果酸、2.50 g檸檬酸、0.60 g丙二酸、0.10 g反丁烯二酸、0.10 g棕櫚酸、0.10 g亞油酸、0.03 g琥珀酸、6.55 g蘋果酸和0.02 g硬脂酸，于100mL容量瓶中用甲醇定容，得到有機酸混合標準儲備液；分別移取0.25、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mL有機酸混合標準儲備液于7只25mL容量瓶中，加入2.5mL一級內(nèi)標儲備液后用甲醇定容，得到有機酸系列標準工作溶液，于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2 衍生化試劑的配制

衍生化試劑為硫酸-甲醇溶液，反應時加入己二酸（內(nèi)標）的甲醇溶液用于內(nèi)標法定量分析。硫酸-甲醇溶液比例均表示為1.5體積硫酸-甲醇溶液和1體積內(nèi)標甲醇溶液混合后硫酸的終含量（體積分數(shù)）。根據(jù)比例分別配制得到硫酸終含量為1%、2%、4%、6%、8%、10%和12%的硫酸-甲醇溶液。

1.2.2 樣品預處理及衍生化

將煙葉抽去煙梗，40℃下干燥2 h，粉碎，過0.42 mm（40目）篩備用。采用行業(yè)標準方法測定煙葉含水率［11］。取0.1 g煙末于50mL微波反應管中，依次加入1mL二級內(nèi)標溶液和1.5 mL硫酸-甲醇溶液（硫酸含量10%），24管同時進行微波輔助衍生化處理，微波功率以20 W/s的速率升高至1 200W，并保持1 min；反應畢，冷卻至室溫，加入5mL水和3mL二氯甲烷，充分振蕩萃取，置于離心管中以5 000 r/min速率離心8 min；取上清液，過濾后進行快速GC-FID和GC-MS分析。分析條件為：

色譜柱：DB-17熔融石英毛細管柱（10 m× 0.10 mm i.d.×0.10μm d.f.）；進樣口溫度：250℃；載氣：He，0.4mL/min；進樣量：1μL，分流比187∶1；升溫程序：；FID 檢測器溫度：275℃；H2：40mL/min；空氣：450mL/m in；He：30mL/min；信號采集頻率：100 Hz；MS傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：230℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；掃描范圍：35～450 amu。

完全出露型孤石與疊孤石公式相同，但穩(wěn)定性并不相同，從公式(3)看，抗滑移能力主要與各自的摩擦系數(shù)有關(guān)，摩擦系數(shù)越大，抗滑移能力也就越強。由于完全出露孤石無懸空部分，所以完全出露型孤石與疊孤石相比不存在中心外移情況，公式(4)中x值也就更大，抗傾覆能力也就更好。故完全出露的孤石抗滑性由孤石與坡面的摩擦系數(shù)決定，抗傾覆性優(yōu)于疊孤石。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用NIST數(shù)據(jù)庫檢索及標準品對照定性各化合物，對沒有標準品的化合物根據(jù)文獻報道及NIST數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果定性；內(nèi)標法定量分析。應用SPSS軟件對烤煙及雪茄煙煙葉中多元酸和高級脂肪酸的測定結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 硫酸-甲醇比例的選擇

有機酸衍生化常采用硫酸-甲醇作為衍生化試劑，通過酸性條件下有機酸的酯化反應和酯交換反應，使有機酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的有機酸甲酯［5］。在本研究中，分別采用硫酸含量為0、1%、2%、4%、6%、8%、10%及12%的硫酸-甲醇作為衍生化試劑篩選最優(yōu)的硫酸-甲醇比例，進行3次平行實驗。結(jié)果（圖1）顯示，在相同的微波反應條件下，隨著硫酸含量的增加，各有機酸的色譜峰面積明顯增加，表明硫酸比例對有機酸的酯化程度有較大的影響，蘋果酸和己二酸（內(nèi)標）在硫酸含量為2%時基本反應完全，而大多數(shù)有機酸在硫酸含量為10%時均反應完全，當硫酸含量繼續(xù)增加時，棕櫚酸、亞油酸峰面積小，因此選擇10%硫酸-甲醇溶液作為衍生化試劑。

2.1.2 微波條件的優(yōu)化

2.1.3 萃取劑的選擇

有機酸衍生物的常用萃取溶劑有二氯甲烷、正己烷、正戊烷、乙酸乙酯等［4-5,12］，因此選擇這4種溶劑進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二氯甲烷萃取快速且效率高；乙酸乙酯萃取過程中部分樣品發(fā)生乳化難以分層；正己烷、正戊烷萃取率較低。因此選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

圖1 硫酸-甲醇比例對煙葉中多元酸和高級脂肪酸測定結(jié)果的影響

2.2 色譜條件的選擇

有機酸的檢測多采用DB-5MS（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）色譜柱［1,13］及與其性質(zhì)相近的HPU ltra 2色譜柱［4］，但此類色譜柱無法完全分離分子結(jié)構(gòu)和極性均相近的油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯，且分析時間長（通常超過1 h）。據(jù)文獻［14］報道，DB-17（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）色譜柱能有效分離油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯。為提高分析效率、縮短檢測時間，選用內(nèi)徑更小、柱長更短的DB-17（10 m×0.10 mm i.d.×0.10μm d.f.）色譜柱進行快速GC分析。結(jié)果（圖3）顯示，采用DB-17微孔短柱分離時，可以實現(xiàn)硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯及亞麻酸甲酯的分離，且色譜峰峰型較好，色譜分析時間僅需8.81min。

圖2 微波條件對煙葉中多元酸和高級脂肪酸測定結(jié)果的影響

圖3 多元酸和高級脂肪酸的標準溶液和樣品色譜圖

2.3 煙葉中多元酸和高級脂肪酸的定性結(jié)果

分別對標準溶液、烤煙及雪茄煙樣品進行GC-FID和GC-MS分析，色譜峰定性結(jié)果如圖3所示。其中沒有標準品的化合物定性結(jié)果如表1所示，表明烤煙和雪茄煙煙葉樣品中均含有油酸和亞麻酸［4,15］，另外此方法還能檢測到一定量的4-氧代-戊酸［16-17］和2,4-庚二烯酸［18-19］。

2.4 工作曲線和檢測限

分別對7個不同質(zhì)量濃度的多元酸和高級脂肪酸的混合標準溶液進行微波輔助衍生化和快速GC分析，采用內(nèi)標法定量，以各有機酸與相應內(nèi)標的峰面積比（Y）對其相應濃度比（X）進行回歸分析，得到各有機酸的回歸方程及其相關(guān)系數(shù)（表2）。由表2可知，各多元酸和高級脂肪酸標準曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。將最低濃度的標準溶液稀釋并進行快速GC分析，以3倍信噪比為方法的檢出限（LOD），結(jié)果（表2）表明本方法具有較高的靈敏度，適合于定量分析。

表1 煙葉樣品部分有機酸的定性結(jié)果

表2 多元酸和高級脂肪酸的工作曲線、相關(guān)系數(shù)、LOD、回收率和精密度 （n=6）

2.5 回收率與精密度

分別以烤煙和雪茄煙作為分析對象進行精密度實驗，重復測定6次，計算平行測定結(jié)果的相對標準偏差（RSD）。采用標準加入法測定方法的回收率，取烤煙和雪茄煙樣品各1個，進行低、中、高3種不同濃度水平的加標處理，衍生化后進行快速GC分析，計算其加標回收率。結(jié)果（表2）顯示：加標回收率為83.18%～114.17%，RSD為1.59%～4.93%，說明本方法的準確性和重復性均較好，可以滿足定量需要。

2.6 與傳統(tǒng)方法測定結(jié)果的比較

通常，有機酸和不飽和脂肪酸分析方法中衍生化時間為22～24 h，樣品分析時間為65 m in［3-4］，而采用本方法可同時微波輔助衍生化24個樣品，時間為2min，樣品色譜分析時間僅8.81 min，檢測效率大幅提升。對本方法和傳統(tǒng)方法［4］測定結(jié)果（表3）進行配對T檢驗，結(jié)果顯示，采用本方法的測定結(jié)果與采用傳統(tǒng)方法的測定結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），且與文獻報道［4,6,20-21］的煙葉樣品中多元酸和高級脂肪酸的含量范圍一致。

表3 本方法與傳統(tǒng)方法測定結(jié)果的比較 （mg·g-1）

2.7 樣品分析結(jié)果

采用本方法分別測定了10個烤煙和10個雪茄煙煙葉樣品，結(jié)果如表4和表5所示。對烤煙煙葉和雪茄煙煙葉中多元酸和高級脂肪酸含量進行獨立樣品T檢驗。結(jié)果表明，不同煙葉樣品中多元酸和高級脂肪酸含量差異較大，其中雪茄煙煙葉中的多元酸含量（除蘋果酸外）顯著高于烤煙煙葉（P＜0.05），尤其是草酸和檸檬酸；而烤煙煙葉中高級脂肪酸（除硬脂酸外）含量顯著高于雪茄煙煙葉（P＜0.05）。

表4 烤煙煙葉中多元酸和高級脂肪酸含量① （mg·g-1）

表5 雪茄煙煙葉中多元酸和高級脂肪酸含量 （mg·g-1）

3 結(jié)論

建立了微波輔助甲酯化-快速氣相色譜分析煙草中多元酸和高級脂肪酸含量的方法，本方法樣品前處理簡單快速、檢測靈敏度高、結(jié)果準確可靠，適用于煙草樣品中多元酸和高級脂肪酸的快速檢測?？緹熀脱┣褵煙熑~中的有機酸含量差異較大，烤煙煙葉中的多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸及檸檬酸）含量明顯低于雪茄煙煙葉，高級脂肪酸（棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸）含量明顯高于雪茄煙煙葉。

［1］王冰，夏巧玲，郭吉兆，等.兩種衍生化方法對煙草中多元酸和高級脂肪酸測定的影響［J］.煙草科技，2012（12）：56-59.

［2］朱立軍，施豐成，戴亞.國內(nèi)外卷煙中多元酸和高級脂肪酸含量的差異分析［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2010，36（2）：160-164.

［3］譚宏祥，程傳玲，趙桂銘，等.河南烤煙中多元酸和高級脂肪酸的分析研究［J］.安徽農(nóng)學通報，2008，14（5）：33-34.

［4］金永明，張明福，劉百戰(zhàn).煙草中多元酸和高級脂肪酸的分析［J］.煙草科技，2002（4）：21-24.

［5］劉春奎，陳勇，黃淮煥，等.煙草中有機酸和非揮發(fā)性有機酸分析的研究進展［J］.農(nóng)技服務，2010，27（10）：1329-1332.

［6］劉春奎，賈琳，毋麗麗，等.河南主產(chǎn)煙區(qū)烤煙非揮發(fā)性有機酸含量［J］.煙草科技，2014（8）：62-67.

［7］WANG Baoxing，YANG Shihua，CHEN Guohui，etal. Simultaneous determination of non-volatile，semivolatile，and volatile organic acids in to bacco by SIMS can mode GC-MS［J］.Journal of Separation Science，2008，31（4）：721-726.

［8］SHEN Yan，HAN Chao，LIU Jidong，etal.Analysis of volatile com ponents ofPseudostellariaheterophylla（Miq.）pax by m icrowave-assisted solvent extraction and GCMS［J］.Chromatographia，2008，68（7/8）：679-682.

［9］郭春霞，蔣曉原，樓輝，等.微波條件下固體酸催化劑催化酯化生物油的研究［J］.燃料化學學報，2011，39（2）：103-108.

［10］邱雨，朱玲，朱立軍，等.快速毛細管氣相色譜用于香料混合物的分析［J］.合成化學，2015，23（2）：282-［11］YC/T 31—1996煙草及煙草制品試樣的制備和水份測定烘箱法［S］.

［12］陳炳猛，柴金嶺.有機酸在液液兩相間分配的溶劑效應［J］.山東科學，2000，13（4）：21-23.

［13］楊式華，王保興，許國旺，等.煙草中揮發(fā)性和非揮發(fā)性有機酸的快速測定［J］.分析科學學報，2008，24（2）：167-172.

［14］劉丹，韓飛，李偉，等.GC法同時測定鴉膽子油中4種脂肪酸的含量［J］.沈陽藥科大學學報，2011，28（11）：882-885.

［15］郭磊，劉惠民，謝復煒，等.煙葉中26種揮發(fā)性與半揮發(fā)性有機酸的GC-MS/SIM法同時分析［J］.分析測試學報，2008，27（7）：739-743.

［16］陳章玉，楊偉祖，羅麗莉，等.煙葉中有機酸的分析［J］.煙草科技，2000（8）：23-26.

［17］趙銘欽，劉國順，于建春.香料煙陳化過程中煙葉有機酸含量變化特點研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報，2006，25（1）：17-20.

［18］石盼盼，宋朝鵬，趙華武，等.不同晾制處理對烤后煙葉致香物質(zhì)的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2013，34（3）：320-323.

［19］郭明全，馬君紅，盧迪，等.四川煙區(qū)煙葉有機酸含量綜合評價［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（3）：280-283.

［20］曹建敏，劉帥帥，于衛(wèi)松，等.福建省南平煙區(qū)煙草多元酸與高級脂肪酸含量分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40（6）：272-274.

［21］Ng L K，HupéM，Vanier M，etal.Characterization of cigar tobaccos by gas chromatographic/mass spectrometric analysis of nonvolatile organic acids：application to the authentication of Cuban cigars［J］. Journal of Agricultural and Food Chem istry，2001，49（3）：1132-1138.

責任編輯 洪廣峰

Determination of Polybasic Acids and Higher Fatty Acids in Tobacco by Microwave-assisted Methyl Esterification Combining with Fast GC

ZHU Ling,ZHENG Jian,YANG Juan,AN Hongyue,WANG Jing,LONG Jun,and ZHU Lijun*
Research&Development Center,China Tobacco Chuanyu Industrial Co.,Ltd.,Chengdu 610066,China

A method combining m icrowave-assisted derivatization with fast gas chromatography(GC)was developed for rapidly determ ining the contents of polybasic acids(oxalic acid,malonic acid,fumaric acid, succinic acid,malic acid and citric acid)and higher fatty acids(palm itic acid,stearic acid and linoleic acid)intobacco,and the contents of these acids inten flue-cured tobacco samples and ten cigar filler tobacco sam ples were determ ined.The resu lts showed that：1)The op timal pretreatment conditions were using 10%sulfuric acid-methanol as esterification reagent and CH2Cl2as extraction agent while the power of m icrowave increased at a rate of 20 W/s to 1200 W(remaining for 1 m in).2)The time for fast GC analysis was 8.81 m in,the calibration curves of target com pounds displayed good linearity(r2＞0.99),the standard addition recoveries ranged from 83.18%to 114.17%with RSD less than 5%.3)The contents of organic acids in flue-cured tobacco and cigar filler tobacco were quite different,the contents of polybasic acids(excluding malic acid)were higher in cigar filler tobacco,while the contents of higher fatty acids (excluding stearic acid)were higher in flue-cured tobacco.This method is rapid,accurate and suitable for the determ ination of po lybasic acids and higher fatty acids intobacco.

Tobacco;Microwave-assisted methyl esterification;Fast GC;Polybasic acid;Higher fatty acid

TS411.1

A

1002-0861（2015）09-0056-07

10.16135/j.issn1002-0861.20150910

2014-11-21

2015-04-17

四川省科學技術(shù)廳基金項目“光譜分析技術(shù)在卷煙主要輔助材料質(zhì)量監(jiān)控中的應用研究”（2013JYZ004）。

朱玲（1987—），女，碩士，助理工程師，主要從事煙草化學分析研究。E-mail：zhuling@cytobacco.com；*

朱立軍，E-mail：zhulj7802@163.com

朱玲，鄭健，楊涓，等.微波輔助甲酯化-快速GC法測定煙草中的多元酸和高級脂肪酸［J］.煙草科技，2015，48（9）：56-61，74.

ZHU Ling,ZHENG Jian,YANG Juan,etal.Determ ination of polybasic acids and higher fatty acids in tobacco by m icrowave-assisted methyl esterification combining with fast GC［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（9）：56-61，74.