煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆和功能分析

史艷梅，魏 攀，陳媛媛，楊 冉，金立鋒，劉萍萍，李 鋒，屈凌波,4，林福呈，王 燃*

1．鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號(hào) 450001

2．中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

3．中原工學(xué)院理學(xué)院，河南省新鄭市龍湖鎮(zhèn)淮河路1號(hào) 451191

4．河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街100號(hào) 450001

煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆和功能分析

史艷梅*1,2，魏 攀*2，陳媛媛3，楊 冉1，金立鋒2，劉萍萍2，李 鋒2，屈凌波1,4，林福呈2，王 燃**2

1．鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號(hào) 450001

2．中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

3．中原工學(xué)院理學(xué)院，河南省新鄭市龍湖鎮(zhèn)淮河路1號(hào) 451191

4．河南工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)蓮花街100號(hào) 450001

為揭示煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）基因的功能，采用同源克隆的方法從普通煙草（Nicotianatabacum）中克隆了NtZDS基因，并進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。同時(shí)通過熒光定量PCR技術(shù)分析NtZDS的時(shí)空表達(dá)模式、利用煙草脆裂病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）體系抑制本氏煙草中ZDS基因的表達(dá)，在該基因沉默后再通過定量PCR技術(shù)分析NtZDS上下游基因的表達(dá)量變化，并檢測了煙株色素含量的變化。結(jié)果顯示：NtZDS基因在普通煙草中至少存在兩個(gè)同源拷貝，其編碼序列與番茄、馬鈴薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在煙草盛花期的葉和花中表達(dá)量最高。與對(duì)照比較，該基因沉默后，煙株新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重白化現(xiàn)象，能夠?yàn)閂IGS體系提供一個(gè)良好的候選報(bào)告基因；同時(shí)類胡蘿卜素合成通路其他基因的表達(dá)量和煙株類胡蘿卜素、葉綠素含量都顯著降低，表明ZDS基因在煙草生長發(fā)育及類胡蘿卜素合成過程中發(fā)揮著重要作用。

煙草；ζ-胡蘿卜素脫氫酶；基因；克?。槐磉_(dá)模式；病毒誘導(dǎo)的基因沉默

在高等植物中，類胡蘿卜素主要存在于葉片的葉綠體及花和果實(shí)中，具有吸收和傳遞電子的能力，并在清除光合作用產(chǎn)生的葉綠素自由基方面具有重要的作用［1］。同時(shí)，類胡蘿卜素是植物激素脫落酸（ABA）的前體物，可促進(jìn)ABA的生物合成，增強(qiáng)植物的各種抗逆反應(yīng)能力［2］。因此，對(duì)類胡蘿卜素的生物合成進(jìn)行研究具有重要意義。

ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ζ-Carotene desaturase，ZDS）是類胡蘿卜素生物合成過程中的關(guān)鍵酶之一，主要參與植物體內(nèi)線狀類胡蘿卜素的生物合成。ZDS基因目前已從無花果、小麥、番木瓜、辣椒、擬南芥、番茄、草莓、甘薯、黃瓜、柿子和黃水仙等植物中分離出來，其cDNA全長1.8～2.lkbp，編碼558～574個(gè)氨基酸［3-5］。胡重怡等［6］從栽培煙草韭菜坪2號(hào)中克隆出ZDS的cDNA全長序列，并對(duì)其編碼蛋白的一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。表達(dá)枸杞和龍膽ZDS基因的轉(zhuǎn)基因煙草花中β-胡蘿卜素含量提高49%，葉片中的提高91%［7］，說明ZDS基因與類胡蘿卜素的合成密切相關(guān)。Rodrigo等［8］在柑橘中對(duì)類胡蘿卜素合成相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)ZDS基因和八氫番茄紅素合成酶（PSY）基因表達(dá)量上調(diào)，有利于線性類胡蘿卜素的合成，對(duì)柑橘果實(shí)顏色形成有重要貢獻(xiàn)。綜上所述，在多種植物中ZDS基因與類胡蘿卜素的合成緊密相關(guān)。然而煙草中類胡蘿卜素是一種重要的顯色物質(zhì)和香味前體物，與煙葉的外觀色澤和感官品質(zhì)關(guān)系密切［9］，在煙葉成熟及烘烤過程中對(duì)改善煙葉香氣品質(zhì)和保持香氣風(fēng)格具有重要作用［10］。但煙草中ZDS是否對(duì)類胡蘿卜素的合成有重要影響尚未見報(bào)道。因此，克隆了普通煙草ZDS基因的編碼區(qū)序列，并分析了該基因的時(shí)空表達(dá)模式，同時(shí)研究了ZDS基因下調(diào)情況下對(duì)煙草植株的生長發(fā)育及代謝物的影響，旨在明確煙草ZDS基因在類胡蘿卜素通路中的作用，為選育優(yōu)良煙草品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于表達(dá)模式分析的普通煙草紅花大金元（紅大）種植于云南省玉溪市研和鎮(zhèn)大田，分別采集苗床期、伸根期、旺長期、現(xiàn)蕾期、盛花期和不打頂移栽后70 d的煙草葉片、莖稈、須根和花。本氏煙草由鄭州煙草研究院國家煙草基因研究中心于溫室中栽培，栽培條件為溫度（23±1）℃，光照16 h，黑暗8 h，光暗交替，相對(duì)濕度（60±2）%［11］。

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑，克隆載體試劑盒pMDR19-T Simple Vector，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，DL2 000 DNA Marker，DL10 000 DNA Marker，SolutionⅠ連接酶及各種限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。RNA提取和DNA純化試劑盒及SYBR Green熒光染料購自德國QIAGEN公司。PCR試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成并測序。

1.2 方法

1.2.1 煙草RNA的獲取

取普通煙草和本氏煙草植物組織樣品，用液氮研磨成粉，按照RNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行RNA提取，經(jīng)Agilent2100檢測RNA的完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站普通煙草序列（KC484705.1）設(shè)計(jì)ZDS基因上下游引物，上游引物ZDS-F為5’-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3’，下游引物ZDS-R為5’-TCAGACAAGACTCAACTCATCA GATAC-3’。將克隆得到的紅大ZDS編碼區(qū)序列與其他物種的進(jìn)行比對(duì)，找出保守區(qū)域，利用保守區(qū)域設(shè)計(jì)病毒誘導(dǎo)ZDS基因沉默引物，上游引物ZDS-VIGS-F為5’-ATGGATCCATCCTGTCGCATA TGCTCTTGGA-3’（包含KpnⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物為5’-CACTCGAGGAGGCATGTAAGGGTCACC AGGT-3’（包含XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。ZDS基因沉默后定量PCR檢測引物序列見表1中ZDS-Q-F和ZDS-Q-R。

表1 類胡蘿卜素通路定量PCR所用引物及序列

1.2.3 ZDS基因編碼區(qū)全長的克隆

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將煙草RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，體系20μL，其中：RNA模板1μg，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，dNT Ps（10mmol/L）4μL，RNA酶抑制劑20U，Oligo（dT）18引物50pmol，AMV反轉(zhuǎn)錄酶10U，用DEPC處理過的水加至20μL，然后用ZDS基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2和表3。PCR結(jié)束后，純化PCR產(chǎn)物，純化后DNA片段連接T載體，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取白色單菌做菌落PCR驗(yàn)證，選2～3個(gè)陽性菌進(jìn)行測序。

1.2.4 遺傳進(jìn)化分析

用鄰接法（Neighbor-joiningmethod）和MEGA 5.0軟件對(duì)植物的ZDS核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹中的數(shù)字代表計(jì)算頻率值，重復(fù)檢驗(yàn)1 000次。

1.2.5 TRV2-ZDS重組載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

以克隆出的ZDS1基因?yàn)槟０?，用病毒誘導(dǎo)基因沉默引物擴(kuò)增保守區(qū)域，PCR反應(yīng)條件如表3（延伸時(shí)間為35 s），PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化回收?；厥盏腪DSVIGS目的片段和pTRV2（pYL156）載體均使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系：PCR回收產(chǎn)物（或pTRV2載體）2μg，KpnⅠ（10 U/μL）和XhoⅠ（10 U/ μL）各2.5μL，10×Buffer 5μL，加水至50μL。37℃酶切4 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化雙酶切產(chǎn)物，并連接轉(zhuǎn)化。菌落PCR驗(yàn)證得到陽性菌，提取質(zhì)粒，用KpnⅠ和XhoⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)條件

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒通過液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。分別取pTRV1、pTRV2、pTRV-ZDS和pTRV-PDS質(zhì)粒1μL，加入含0.1m L的GV 3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的EP管中，冰上放置30m in；將含有該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞放入液氮速凍1min，然后37℃溫育5m in；加入900μL LB液體培養(yǎng)基，28℃懸浮振蕩培養(yǎng)3 h；5 000 r/min離心1m in，棄去上清液，加入200μL LB液體培養(yǎng)基，重懸沉淀；取200μL重懸液（即轉(zhuǎn)化產(chǎn)物）均勻地涂于含25μg/m L利福平和50μg/m L卡那霉素的LB平板上，28℃培養(yǎng)2～3 d；挑取適量的轉(zhuǎn)化菌斑PCR鑒定無誤后，搖菌注射本氏煙草的煙苗。

1.2.6 農(nóng)桿菌侵染

利用注射接種的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染［11］，分別將pTRV1、pTRV2、pTRV2-ZDS和pTRV2-PDS陽性菌接種于含相應(yīng)抗生素的5m L LB培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)過夜。吸出0.2m L菌液接種于20mL LB培養(yǎng)基［含10 mmol/L 2-N-嗎啉基乙磺酸（MES）和20μmol/L乙酰丁香酮（AS）］中，28℃過夜培養(yǎng)。離心（4 000 r/min，30 s）收集上述菌體，然后重懸在LB培養(yǎng)基（含10mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES+200μmol/L AS）中，調(diào)OD600為1.0，室溫靜置3 h。以不注射為空白對(duì)照，pTRV1&pTRV2為陰性對(duì)照（TRV），pTRV1& pTRV2-PDS為陽性對(duì)照（TRV-PDS），pTRV1& pTRV2-ZDS為實(shí)驗(yàn)組（TRV-ZDS），每組中兩種菌液按1∶1比例混合，分別注射煙草。

1.2.7 熒光定量PCR

利用SYBR Green染料法在普通煙草中定量分析ZDS基因的時(shí)空表達(dá)模式，同時(shí)分析農(nóng)桿菌侵染本氏煙草后類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)量差異，采用26SrRNA為內(nèi)參基因。熒光定量PCR體系為：1μL cDNA模板（50 ng/μL），10μL SYBR Green染料（2×SYBR Green），ZDS（或26S）基因上下游引物各1μL（5μmol/L），無RNA酶的水7μL。PCR反應(yīng)條件采用兩步法：94℃5m in；94℃20 s，60℃20 s，40個(gè)循環(huán)；4℃，停止。

PSY、PDS和CRTISO等與類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因表達(dá)量分析所用的引物見表1，熒光定量PCR體系和條件同1.2.3節(jié)的ZDS基因。選取代表性的3株煙草樣品進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次，取Cp值的平均值，用2-△△CT法計(jì)算。

1.2.8 煙草色素含量測定

稱取干燥煙草葉片樣品200mg，25m L 90%丙酮超聲萃取20min，過濾取上清液，液相色譜檢測煙草色素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。色譜條件：色譜柱為反相C18液相色譜柱，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為3.9mm×150mm，4μm粒徑，或相當(dāng)型號(hào)色譜柱。進(jìn)樣量：10μL，流速：0.5m L/min。檢測波長：448 nm和428 nm。流動(dòng)相A：異丙醇。流動(dòng)相B：80%乙腈水溶液。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 NtZDS基因編碼區(qū)（CDS）的克隆及分析

以ZDS-F和ZDS-R為引物，從cDNA模板中PCR擴(kuò)增ZDS基因的CDS序列，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在1 000～2 000 bp之間出現(xiàn)較亮的特異條帶，見圖1。純化目的片段，連接T載體，進(jìn)行陽性克隆驗(yàn)證，大量挑取陽性菌進(jìn)行隨機(jī)測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩條相似度為96.02%的NtZDS基因序列，一條序列CDS全長為1 785 bp（命名為NtZDS1），另一條CDS全長是1 767 bp（命名為NtZDS2）。序列比對(duì)見圖2，結(jié)果表明普通煙草體內(nèi)NtZDS基因至少存在兩個(gè)拷貝。Blast結(jié)果顯示兩條序列與馬鈴薯和番茄的ZDS基因的相似度均高于90%。

圖1 NtZDS編碼區(qū)序列的PCR電泳圖

不同植物ZDS核苷酸序列進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，NtZDS1和NtZDS2分別與作為父母本煙草的絨毛狀煙草和林煙草聚為一支，NtZDS1源于林煙草基因組，NtZDS2源于絨毛狀煙草基因組，林煙草和絨毛狀煙草雜交加倍的過程中各貢獻(xiàn)了1個(gè)ZDS基因同源拷貝，因此在栽培煙草體內(nèi)至少存在有兩個(gè)拷貝。同時(shí)，在ZDS基因進(jìn)化樹中，雙子葉植物和單子葉植物（擬南芥除外）各聚為一支，ZDS基因?qū)儆陔p子葉植物的茄科，與同屬茄科的番茄、馬鈴薯聚為一支，表明該基因與茄科植物的親緣關(guān)系很近。

圖2 NtZDS1和NtZDS2兩序列比對(duì)

2.2 NtZDS基因時(shí)空表達(dá)模式分析

NtZDS基因在栽培煙草紅大各個(gè)發(fā)育時(shí)期和各器官中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式分析見圖4。結(jié)果顯示，NtZDS基因在各個(gè)時(shí)期的葉片中表達(dá)量最高，尤其是嫩葉（第15位葉片），在現(xiàn)蕾期和盛花期葉中表達(dá)量達(dá)到頂峰，在盛花期煙株花中表達(dá)量顯著提高，這可能與β-胡蘿卜素的積累及花的顯色相關(guān)。根部的表達(dá)量最低，轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式的研究結(jié)果表明，該基因與植物的生理狀態(tài)密切相關(guān)，在煙株光合作用較強(qiáng)的幼嫩組織中表達(dá)量較高，其生物學(xué)功能可能與光合生理過程存在密切的關(guān)系。

2.3 NtZDS基因VIGS重組載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

ZDS基因在普通煙草體內(nèi)存在相似度達(dá)96.02%的兩個(gè)拷貝，進(jìn)行分別的沉默難度大，因此采用VIGS技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行共同沉默。以克隆得到的ZDS1編碼區(qū)基因全長質(zhì)粒為模板，用ZDS-VIGS-F&-R擴(kuò)增VIGS片段保守區(qū)域，對(duì)應(yīng)于CDS的782～1 414 bp位置上，片段大小為633 bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測與預(yù)期大小一致，在600 bp左右有清晰的特異性條帶，見圖5A。然后經(jīng)過酶切連接到pTRV2載體上，構(gòu)建pTRV2-ZDSVIGS載體。對(duì)菌落PCR驗(yàn)證陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，并進(jìn)行雙酶切（KpnⅠ/XhoⅠ）驗(yàn)證，結(jié)果見圖5B。在約600 bp處有單一條帶出現(xiàn)，初步認(rèn)為構(gòu)建成功。然后對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果顯示插入片段長度為633 bp，經(jīng)序列比對(duì)與設(shè)計(jì)片段序列完全吻合，表明pTRV2-ZDS重組載體構(gòu)建成功。

2.4 農(nóng)桿菌接種

圖3 煙草與其他植物ZDS基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 ZDS基因的時(shí)空表達(dá)模式分析

圖5 瓊脂糖凝膠電泳圖

八氫番茄紅素脫氫酶基因（PDS）常被作為VIGS體系的指示基因，其沉默后植物新葉出現(xiàn)顯著的白化現(xiàn)象，以驗(yàn)證TRV載體的侵染效率［12］。分別將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌（TRV/TRV-PDS/ TRV-ZDS）侵染本氏煙草，TRV-PDS菌液注射煙草約10 d左右，煙草新葉出現(xiàn)顯著的白化現(xiàn)象，表明TRV病毒誘導(dǎo)基因沉默體系已發(fā)揮作用。如圖6所示，TRV-PDS農(nóng)桿菌侵染一個(gè)月后植株表型出現(xiàn)嚴(yán)重的光漂白現(xiàn)象。如圖7所示，與陰性對(duì)照TRV相比，侵染TRV-ZDS的煙株同時(shí)也出現(xiàn)了顯著的光漂白現(xiàn)象，ZDS基因表達(dá)被抑制，新生葉片都顯現(xiàn)出嚴(yán)重白化現(xiàn)象，株高明顯變矮，長勢不強(qiáng)，但不致死，與PDS基因沉默后表型比較相似。

圖6 PDS基因沉默表型圖

圖7 本氏煙草ZDS基因沉默表型圖

侵染效率考察結(jié)果顯示，注射TRV-ZDS農(nóng)桿菌的20株煙草中，侵染發(fā)病率為100%，表型一致，定量PCR檢測ZDS轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平僅有對(duì)照植株的10%（甚至更低，P＜0.05）（圖8），而注射TRV煙株與未注射煙株WT之間無顯著性差異（P＞0.05），表明ZDS基因被有效地沉默。由此可見，ZDS基因也可以作為TRV VIGS沉默體系的參照基因，為TRV介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默體系提供一個(gè)良好的候選參照基因。

圖8 ZDS在本氏煙草TRV 介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默體系中基因表達(dá)量

2.5 ZDS 基因沉默后對(duì)類胡蘿卜素合成通路及代謝物的影響

TRV-ZDS農(nóng)桿菌侵染煙株后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測類胡蘿卜素合成通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)侵染TRV-ZDS煙株，類胡蘿卜素合成通路基因的表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05），而注射TRV煙株與未注射WT煙株間無顯著差異（P＞0.05），見圖9。對(duì)代謝物類胡蘿卜素及葉綠素含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)、黃體素及葉綠素a和b也顯著降低（P＜0.05），見圖10。說明煙草中ZDS基因表達(dá)受抑制后，嚴(yán)重阻礙了植株類胡蘿卜素及葉綠素合成，所以ZDS在類胡蘿卜素合成中起著重要的作用。

圖9 ZDS基因表達(dá)抑制后類胡蘿卜素合成通路基因表達(dá)量分析

圖10 ZDS基因表達(dá)抑制后類胡蘿卜素及色素含量變化

3 結(jié)論

從普通煙草紅大中擴(kuò)增出NtZDS基因序列，發(fā)現(xiàn)該基因至少存在兩個(gè)拷貝。該基因在現(xiàn)蕾期、盛花期的葉片和花中表達(dá)量較高，推斷該基因生物學(xué)功能可能與光合生理過程存在密切關(guān)系，對(duì)煙草花中類胡蘿卜素的合成可能具有重要的調(diào)控作用。

ZDS基因表達(dá)下調(diào)后，新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重白化現(xiàn)象，株高明顯變矮，長勢不強(qiáng)，與PDS基因沉默后表型相似，為TRV介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默提供了一個(gè)良好的候選參照基因。對(duì)沉默植株上下游基因表達(dá)量分析及代謝物分析結(jié)果都說明ZDS基因在類胡蘿卜素合成過程中發(fā)揮著重要作用。

［1］Christopher I C.Carotenoids in nature：insights from plants and beyond［J］.Functional Plant Biology，2011，38（11）：833-847.

［2］Ian B T，Tineke S，Timothy D H B，etal.Regulation and manipulation of the biosynthesis of abscisic acid，including the supply of xanthophyll precursors［J］. Journal Plant Grow th Regulation，2005，24（4）：253-273.

［3］Araya-Garay JM，F(xiàn)eijoo-Siota L，Veiga-Crespo P，etal.Cloning and functional expression ofzeta-carotene desaturase，a novel carotenoid biosynthesis gene fromFicuscarica［J/OL］.Bioprocessing and Biotechniques，2012，2（4）：10.4172/2155-9821.1000125［2014-08-25］. http://www.researchgate.net/publication/260986251_Cloning_and_Functional_Expression_of_Carotene_Desaturase_ANovel_Carotenoid_Biosynthesis_Gene_From_Ficus_Carica.

［4］Cong L，Wang C，Li Z Q，etal.cDNA cloning and expression analysis of wheat（TriticumaestivumL.）phytoene andζ-carotene desaturase genes［J］.Molecular Biology Reports，2010，37（7）：3351-3361.

［5］Yan P，Gao X Z，Shen W T，etal.Cloning and expression analysis ofphytoenedesaturaseandζ-carotene desaturasegenes inCaricapapaya［J］.Molecular Biology Reports，2011，38（2）：785-791.

［6］胡重怡，雷波，劉冬，等.烤煙ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析［J］.煙草科技，2012（3）：34-37.

［7］JI J，Wang G，Wang J H，etal.Function analysis of multiple carotenogenic genes fromLyciumbarbarumandGentianaluteaL.for their effects onβ-carotene production in transgenic tobacco［J］，Biotechnology Letters，2009，31（2）：305-312.

［8］Rodrigo MJ，Marcos JF，Zacarías L.Biochem ical and molecular analysis of carotenoid biosynthesis in flavedo of orange（CitrussinensisL.）during fruit development and maturation［J］.Journal of agricultural and food chem istry，2004，52（22）：6724-6731.

［9］過偉民，李偉觀，劉陽，等.烤煙類胡蘿卜素含量與香氣質(zhì)量的關(guān)系［J］.煙草科技，2010（1）：51-55.

［10］Wahlberg I，Kerstin K，Austin D J.Effects of flue-curing and ageing on the volatile，neutral and acidic constituents of Virginia tobacco［J］.Pyhtochemistry，1977，16：1217-1231.

［11］史艷梅，王燃，楊軍，等.煙草類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因的克隆及功能研究［J］.中國煙草學(xué)報(bào)，2014，20（6）：138-143.

［12］Quadrana L，Rodriguez MC，López M，etal.Coupling virus-induced gene silencing to exogenous green fluorescence protein expression provides a highly efficient system for functional genom ics inArabidopsisand across all stages of tomato fruit development［J］.Plant Physiology，2011，156（3）：1278-1291.

責(zé)任編輯 董志堅(jiān)

Cloning and Functional Analysis ofζ-Carotene Desaturase Gene in Nicotiana tabacum

SHI Yanmei*1,2,WEI Pan*2,CHEN Yuanyuan3,YANG Ran1,JIN Lifeng2,LIU Pingping2,LI Feng2,
QU Lingbo1,4,LIN Fucheng2,and WANG Ran**2
1.College of Chem istry and Molecular Engineering,Zheng zhou University,Zheng zhou 450001,China
2.Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China
3.College of Science,Zhong yuan University of Technology,Zheng zhou 451191,China
4.College of Chem istry and Chem ical Engineering,Henan University of Technology,Zheng zhou 450001,China

To reveal the function ofζ-carotene desaturase（ZDS）inNicotianatabacum（N.tabacum),NtZDSgene was homologously cloned fromN.tabacumand its phylogenetic analysis was conducted. Fluorescence quantitative PCR techno logy was used to analyze the tem poral and spatial expression patterns ofNtZDSand tobacco rattle virus induced gene silencing（VIGS）system was employed to inhibit the expression ofZDSinNicotianabenthamiana.The expression levels of upstream and downstream genes were further analyzed by fluorescence quantitative PCR,and the changes of pigment contents in tobaccoplants were determ ined.The results showed that there existed at least two homologous copies ofNtZDSgene inN.tabacumwith the sim ilarity of more than 90%in coding sequence toZDSgenes in tomato and potato.The expression level ofNtZDSwas the highest in leaves and flowers at flowering stage.Comparing with the control,the leaves of tobacco p lants presented severe bleaching phenotype afterNtZDSsilencing, it provided a good candidate for reporter gene for VIGS system;meanwhile the expression levels of upstream and downstream genes and pigment contents（carotenoid and chlorophy ll）significantly decreased,it implied thatZDSgene played an important role in the course of growth,development and carotenoid formation ofN.tabacum.

Nicotianatabacum；ζ-carotene desaturase；Gene；Cloning；Expression pattern；Virus induced gene silencing（VIGS)

TS413

A

1002-0861（2015）09-0001-08

10.16135/j.issn1002-0861.20150901

2014-08-25

2015-02-28

中國煙草總公司鄭州煙草研究院科技項(xiàng)目“煙草類胡蘿卜素含量的遺傳調(diào)控和材料驗(yàn)證”（092013CZ0620）。

史艷梅（1985—），在讀博士研究生，研究方向：煙草基因功能研究。E-mail：sym zgh@163.com；*共同第一作者：

魏攀（1983—），博士，工程師，主要從事煙草分子生物學(xué)研究。E-mail：weipan83@126.com；**通訊作者：王燃，E-mail：wangranljj2010@163.com

史艷梅，魏攀，陳媛媛，等.煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆和功能分析［J］.煙草科技，2015，48（9）：1-8.

SHI Yanmei，WEI Pan，CHEN Yuanyuan，etal.Cloning and functional analysis ofζ-carotene desaturase gene in Nicotiana tabacum［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（9）：1-8.