利用定量加壓充氣球囊制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型

許士進(jìn)，何淑芳，金世云，胡 軍，張 野

利用定量加壓充氣球囊制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型

許士進(jìn)，何淑芳，金世云，胡 軍，張 野

雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只：假手術(shù)組（SHAM組）、球囊缺血再灌注組（SI／R組）、經(jīng)典缺血再灌注組（I／R組）。3組均在冠狀動(dòng)脈左前降支下穿線，SHAM組僅將未充氣的球囊固定于穿線處；SI／R組固定球囊后，通過(guò)加壓泵對(duì)球囊充氣和放氣建立缺血再灌注損傷模型；I／R組采用傳統(tǒng)的造模方法。記錄血流動(dòng)力學(xué)和心電圖的特異性改變，再灌注2 h后取心臟進(jìn)行TTC染色測(cè)心肌梗死面積。結(jié)果顯示，SI／R和I／R組均可造成顯著心肌缺血，兩組死亡率和心肌梗死體積（IS／ARR）的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

動(dòng)物模型；心臟；缺血再灌注；充氣；球囊

心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是指心肌組織在經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間缺血后，當(dāng)恢復(fù)血流灌注時(shí)反而使心肌缺血后損傷加重的病理生理現(xiàn)象［1］。心肌IRI的防治及機(jī)制研究已成為目前心血管領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。大鼠以其冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少、心肌壞死出現(xiàn)早、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，成為制作心肌IRI模型的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［2］。目前制備大鼠心肌IRI的經(jīng)典方法為推管法［3］，但反復(fù)推管操作易損傷心肌和冠狀血管，且無(wú)法滿足核磁共振（MRI）成像［4］、心肌灌注斷層顯像［5］等新技術(shù)在進(jìn)行動(dòng)物心肌IRI研究時(shí)對(duì)實(shí)時(shí)、遠(yuǎn)程操控的要求。該研究利用定量加壓充氣球囊制備心肌IRI模型，并可通過(guò)與延長(zhǎng)管連接實(shí)施實(shí)時(shí)遠(yuǎn)程操作，模型成功率高、損傷小、操作方便。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡健康雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，200～300g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室內(nèi)溫度20～25℃。

1.2 主要試劑戊巴比妥鈉（使用濃度為3%，生理鹽水溶解，由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）；伊文斯蘭（批號(hào)：20110909024，北京綠生源有限公司，使用濃度0.25%，生理鹽水溶解）；氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC，批號(hào)：129K1867V，美國(guó)Sigma公司，使用濃度為100 mmol／L，溶于磷酸鹽緩沖液pH＝7.4）。

1.3 主要儀器動(dòng)物呼吸機(jī)（ALC-V9型，上海奧爾科特生物科技有限公司）；生物機(jī)能系統(tǒng)（BL-420S型，成都泰盟生物科技有限公司）。

1.4 定量加壓充氣球囊采用尼龍（PA 12）材料，通過(guò)料管拉伸、球囊成型、前端封頭等技術(shù)制成直徑4 mm、長(zhǎng)度15 mm的可擴(kuò)充球囊，通過(guò)與球囊連接的延長(zhǎng)管利用定量加壓泵給球囊加壓充氣（球囊委托江蘇常美醫(yī)療器械有限公司定制，定量加壓泵由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院介入科提供）。

1.5 方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只：假手術(shù)組（SHAM組）、球囊缺血再灌注組（SI／R組）、經(jīng)典缺血再灌注組（I／R組）。大鼠用3%的戊巴比妥2 ml／kg腹腔注射，麻醉后仰臥固定于鼠板上，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄心電圖。氣管切開(kāi)，置入氣管導(dǎo)管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量3 m l／100 g，頻率60～80次／min。頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺置管，連接壓力傳感器，測(cè)動(dòng)脈血壓。股靜脈穿刺置管，用微量泵進(jìn)行補(bǔ)液［乳酸鈉林格氏液0.1 ml／（kg·h）］。于胸骨左側(cè)約0.5 cm，第3、4肋間處打開(kāi)胸腔，無(wú)齒鑷撕破心包膜，使心臟充分暴露。在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間找到與左冠狀動(dòng)脈伴行的心大靜脈，在左心耳下方2 mm處以5－0無(wú)損傷縫合針穿線，進(jìn)針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm。SHAM組穿線后，用結(jié)扎線將未充氣的球囊松緊適宜的固定于穿線處，且不影響冠脈血流，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不對(duì)球囊進(jìn)行充氣。SI／R組穿線后，用結(jié)扎線將未充氣的球囊松緊適宜的固定于穿線處，穩(wěn)定20 min后，用與球囊相連的定量加壓泵對(duì)球囊進(jìn)行快速充氣，使球囊壓力迅速達(dá)到并固定于200 kPa，此時(shí)擴(kuò)張的球囊壓迫冠狀動(dòng)脈，阻斷動(dòng)脈血流，造成缺血；缺血30 min后，通過(guò)加壓泵迅速抽盡球囊氣體，恢復(fù)冠脈血流。I／R組在穩(wěn)定20min后，用推管法結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，即將結(jié)扎線的兩端通過(guò)一硬塑管，用血管鉗向下推動(dòng)硬塑管壓向冠狀動(dòng)脈，夾緊結(jié)扎線阻斷冠脈血流；缺血30 min后，松開(kāi)結(jié)扎線實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.5.2 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 分別記錄各組在穩(wěn)定20 min后（基礎(chǔ)值），缺血30 min后和再灌注2 h后的心率（heart rate，HR）和平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP），計(jì)算HR和MAP乘積（rate pressure product，RPP）。

1.5.3 心肌梗死面積檢測(cè) 再灌注2 h后，取出心臟，剔除非心臟組織，置于Langendorff上用K－H液灌注5 min（37℃），沖洗出心肌內(nèi)殘留血液，重新結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，并從主動(dòng)脈注入0.25%Evan藍(lán)溶液，后置于－80℃冰箱速凍1～2 h。將冰凍的心臟放入心肌切槽，由心尖到結(jié)扎冠脈的線結(jié)處平切2 mm厚的心肌5～6片。置于1%TTC溶液中，37℃（pH＝7.4）溫孵15 min，取出置于10%福爾馬林室溫固定12 h。染色后缺血危險(xiǎn)區(qū)呈紅色，梗死區(qū)為白色，用圖像分析軟件（Imaging J 1.38e）計(jì)算左心室體積（left ventricle，LV）、右心室體積（right ventricle，RV）、缺血危險(xiǎn)區(qū)體積（area at risk，AAR）和梗死區(qū)體積（infarct size，IS），再算出LV＋RV，用IS／AAR表示心肌梗死體積。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK分析；血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析；死亡率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 死亡率比較SHAM組20只大鼠均存活，SI／R組20只大鼠中有1只大鼠于缺血時(shí)因心律失常死亡，2只大鼠于再灌注時(shí)因心力衰竭死亡；I／R組20只大鼠中有2只大鼠于缺血時(shí)因心律失常死亡，2只大鼠于再灌注時(shí)因心力衰竭死亡。SI／R組和I／R組相比死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.15 vs 0.20，χ2＝0.173，P＞0.05）。

2.2 心肌血供和心電圖ST段變化情況心臟直視下，SHAM組手術(shù)前后心肌血供無(wú)明顯變化；SI／R組和I／R組在冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后，左室前壁紫紺，再灌注后紫紺消失。SHAM組手術(shù)前后心電圖無(wú)明顯變化；SI／R組和I／R組在冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后QRS波群增寬、ST段均較結(jié)扎前明顯抬高。見(jiàn)圖1。且SI／R組和I／R組均在缺血后10 min左右及再灌注即刻出現(xiàn)明顯的心律失常，以一過(guò)性室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速為主。

2.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與基礎(chǔ)值相比，SI／R組在缺血30 min和再灌注2 h時(shí)的MAP和RPP以及I／R組在缺血30 min和再灌注2 h時(shí)的MAP和RPP均顯著降低（F＝21.540、10.488、35.975、16.534，P＜0.01）；與SHAM組相比，SI／R組在缺血30 min和再灌注2 h時(shí)的MAP和RPP以及I／R組在缺血30 min和再灌注2 h時(shí)的MAP和RPP也顯著降低（F＝21.148、10.810、15.449、7.949，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，n＝20）

表1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，n＝20）

與基礎(chǔ)值比較：**P＜0.01；與SHAM組比較：＃＃P＜0.01

項(xiàng)目SHAM組SI／R組I／R組HR（次／min）基礎(chǔ)值369±30 365±29 361±29缺血30min 360±31 350±32 347±26再灌注2 h 356±28 337±29 340±23 MAP（kPa）基礎(chǔ)值12.786±1.33 12.369±1.064 12.768±1.064缺血30min 12.369±1.197 8.645±0.931**＃＃9.443±1.197**＃＃再灌注2 h 11.837±0.532 9.842±0.798**＃＃10.374±0.931**＃＃RPP［kPa／（min·1 000）］基礎(chǔ)值4.655±0.798 4.522±0.665 4.655±0.798缺血30min 4.522±0.798 2.926±0.532**＃＃3.325±0.665**＃＃再灌注2 h 4.256±0.532 3.325±0.532**＃＃3.458±0.532**＃＃

2.4 心肌梗死體積測(cè)定各組間比較，LV＋RV、AAR體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SHAM組未見(jiàn)梗死。與I／R組相比，SI／R組的IS體積（cm3）（0.26±0.05 vs 0.27±0.04，P＞0.05）和IS／AAR（0.491±0.083 vs 0.506±0.091，P＞0.05）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

3 討論

冠狀動(dòng)脈左前降支是左心供血的最主要血管，結(jié)扎后可導(dǎo)致室間隔、左室前壁心肌缺血、梗死，因此成為研究心肌IRI最常用的血管。隨著對(duì)心肌IRI研究的不斷深入，以及新技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)心肌IRI的造模方法也提出了新的要求。

以往的大鼠心肌IRI的造模方法主要可歸納為壓管法［6］和推管法［3］兩大類，然而以上兩種方法在“壓管”和“推管”時(shí)，所用的硅膠管和硬塑管均與心臟表面接觸，大鼠心臟搏動(dòng)時(shí)，管與心臟摩擦，易損傷心臟和血管。目前缺血預(yù)處理［7］以及后處理［8］對(duì)抗IRI的機(jī)制研究已成為心肌保護(hù)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。然而傳統(tǒng)方法在進(jìn)行預(yù)處理和后處理時(shí)均需在胸腔內(nèi)反復(fù)進(jìn)行結(jié)扎與再灌注的操作，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)事，影響模型復(fù)制的成功率，而且會(huì)加重對(duì)心臟及冠脈的損傷。本實(shí)驗(yàn)采用定量加壓充氣球囊復(fù)制大鼠心肌IRI模型，充氣后可見(jiàn)大鼠心肌左室前壁迅速紫紺，心電圖ST段明顯抬高；再灌注后紫紺迅速消失，出現(xiàn)明顯的心律失常。兩者的死亡率及心肌梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明球囊法是一種穩(wěn)定可靠的復(fù)制大鼠心肌IRI的方法，且和傳統(tǒng)的壓管法及推管法相比，操作簡(jiǎn)便，對(duì)心臟及冠脈損傷小，通過(guò)與球囊相連的定量加壓泵可實(shí)現(xiàn)球囊的快速充氣和放氣，有利于進(jìn)行預(yù)處理及后處理等相關(guān)操作，并可固定球囊壓力實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)操作的量化。

近年來(lái)，核磁共振掃描［9］、心肌灌注斷層掃描［10］等新技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究。然而，傳統(tǒng)的造模方法已無(wú)法適應(yīng)這些新技術(shù)對(duì)于IRI模型制備過(guò)程中實(shí)時(shí)及遠(yuǎn)程操控的要求。Pohlmann et al［9］利用與腎動(dòng)、靜脈固定在一起的注水球囊制備腎臟IRI模型，從而獲得了腎臟在缺血再灌注過(guò)程中的實(shí)時(shí)功能MRI圖像。趙秀梅等［11］和周汝娟等［12］先后成功利用球囊墊扎法制作大鼠心肌IRI模型，但實(shí)驗(yàn)中使用的球囊均為醫(yī)用冠狀動(dòng)脈成形術(shù)的球囊導(dǎo)管，價(jià)格昂貴，或回收使用易致交叉感染；此外，這類球囊內(nèi)均含有金屬標(biāo)記物，不能用于高磁場(chǎng)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)使用定制的定量加壓充氣球囊，制作成本低，質(zhì)量可靠，可以成功制備大鼠心肌IRI，適合用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)在球囊與加壓泵之間添加延長(zhǎng)連接管，可以實(shí)時(shí)、遠(yuǎn)程實(shí)施缺血再灌注或預(yù)處理操作，將會(huì)滿足在普通或MRI、斷層掃描等特殊實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行動(dòng)物IRI研究的要求。

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AbstrsctAdultmale SD rats were randomly divided into three groups，20 rats in each group：Sham operation group（SHAM group），saccule ischemia-reperfusion group（SI／R group），classical ischemia-reperfusion group（I／R group）.A 5-0 silk tread was passed around the left anterior descending coronary artery of ratheart in all of the three groups.In SHAM group，the saccule was fixed on the artery without inflation.In SI／R group，the fixed saccule was inflated and then deflated to inducemyocardium ischemia and reperfusion by using a pressure pump.In I／R group，the classicalmethod was used to establish themodel.Hemodynamic parameters and electrocardiographic changeswere recorded during the experiment.Infarctsize（IS），as a percentage of the area at risk（AAR），was determined by 2，3，5-triphenyltetrazolium（TTC）staining at the end of reperfusion.The results showed regional ischemia was induced in both SI／R and I／R groups，and there was no statistically significant difference between SI／R and I／R groups regarding animalmortality and infarct size（IS／ARR）.

Establishment of ratmodel ofmyocardial ischem ia-reperfusion injury by using a quantitative inflating saccule

Xu Shijin，He Shufang，Jin Shiyun，etal
（Dept of Anesthesiology，The Second Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601）

animalmodel；heart；ischemia-reperfusion；inflation；saccule

R 654.2；R-332

A

1000－1492（2015）08－1180－04

2015－04－14接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81471145）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，合肥 230601

許士進(jìn)，男，碩士研究生；

張 野，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhangye＿h(yuǎn)assan＠sina.com