基于TRIZ原理的滅活疫苗中抗原空間表位的創(chuàng)新應(yīng)用

張琳等

摘 要：TRIZ是技術(shù)和產(chǎn)品創(chuàng)新一種重要方法，已在農(nóng)機(jī)裝備、農(nóng)業(yè)金融、農(nóng)產(chǎn)品加工等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域成功的進(jìn)行了應(yīng)用，但獸醫(yī)領(lǐng)域尚未嘗試。本研究基于TRIZ原理，應(yīng)用系統(tǒng)分析、三軸分析和矛盾分析對(duì)滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中病原蛋白質(zhì)的破壞問(wèn)題進(jìn)行了剖析，創(chuàng)新性提出了利用抗原空間表位建立滅活疫苗安全性檢驗(yàn)的新方法，反向指示疫苗是否安全的新思路。研究結(jié)果證實(shí)，TRIZ理論完全可以在獸醫(yī)領(lǐng)域中應(yīng)用，能夠?yàn)榧夹g(shù)難題提供新思路和方案。

關(guān)鍵詞：TRIZ原理；滅活疫苗；抗原空間表位

引言

滅活疫苗是我國(guó)目前制備工藝成熟、使用廣泛、安全有效的疫苗，它以病原為基本物質(zhì)，與滅活劑充分作用后加入佐劑制成，一方面因病原抗原表位的存在可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體達(dá)到清除病原的目的，另一方面因病原的核酸與蛋白完全失活保證了使用與環(huán)境的安全，所以被廣泛應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防。在病原確定的情況下，滅活疫苗制備的關(guān)鍵步驟是滅活，只有完全滅活的安全疫苗才能進(jìn)行應(yīng)用。但滅活的過(guò)程中破壞了病原蛋白的活性，致使疫苗產(chǎn)生的效力有所損失，同時(shí)蛋白活性作用無(wú)從體現(xiàn)。所以，在滅活疫苗生產(chǎn)中如何避免蛋白構(gòu)象的破壞和實(shí)現(xiàn)蛋白的創(chuàng)新利用，本研究嘗試?yán)肨RIZ進(jìn)行探索。

TRIZ理論全稱為“發(fā)明問(wèn)題解決理論”，是一種指導(dǎo)創(chuàng)新的方法論[1]。TRIZ理論產(chǎn)生于工程技術(shù)領(lǐng)域，主要解決泛制造業(yè)的技術(shù)難題。但隨著理論的發(fā)展和逐步完善，逐步向企業(yè)管理、政治、教育、服務(wù)的非技術(shù)領(lǐng)域延伸。近年來(lái)，在科技部等四部委的倡導(dǎo)下，TRIZ理論在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也迅速鋪開，已在農(nóng)機(jī)、農(nóng)業(yè)金融、農(nóng)產(chǎn)品加工等領(lǐng)域進(jìn)行了嘗試，為諸多技術(shù)難題的攻關(guān)提供了方案或者思路。對(duì)于TRIZ理論能否在獸醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用，文章將首先在滅活疫苗抗原空間表位的應(yīng)用上進(jìn)行嘗試，探索全新高效的利用方案。

1 TRIZ理論簡(jiǎn)介

TRIZ理論是前蘇聯(lián)科學(xué)家阿奇舒勒[2]在研究了大量的專利后發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)明在使用了相同的原理和解決方法，并且產(chǎn)品和技術(shù)系統(tǒng)是按照一定規(guī)律去發(fā)展的，在此基礎(chǔ)上他創(chuàng)立了TRIZ理論。TRIZ理論有幾個(gè)最重要的組成部分[3]——技術(shù)系統(tǒng)、資源、矛盾，這也是解決問(wèn)題流程中的基礎(chǔ)部分。技術(shù)系統(tǒng)是TRIZ提出問(wèn)題時(shí)所選擇的對(duì)象，系統(tǒng)可大可小，任何系統(tǒng)又包括一個(gè)或多個(gè)子系統(tǒng)，在系統(tǒng)之外則是超系統(tǒng)；系統(tǒng)確定分析后需要進(jìn)行資源分析，系統(tǒng)資源可分為自然、時(shí)間、空間、系統(tǒng)、物質(zhì)、能量場(chǎng)、信息和功能八類；矛盾是一個(gè)系統(tǒng)存在的難以解決問(wèn)題的根源，可分為技術(shù)矛盾和物理矛盾。

在問(wèn)題定義和轉(zhuǎn)化為TRIZ工程問(wèn)題后，TRIZ提供了三種重要方法和工具[4]：一是創(chuàng)新原理，用于消除技術(shù)矛盾，共40條，并形成矩陣。當(dāng)問(wèn)題確認(rèn)為技術(shù)矛盾后，可根據(jù)矛盾選擇工程參數(shù)，然后找到創(chuàng)新原理來(lái)消除矛盾。二是分離原理，當(dāng)矛盾為物理矛盾時(shí)，采用分離原理來(lái)解決，主要有從時(shí)間、空間上分離，部分與整體分離等方法。三是物場(chǎng)模型，一個(gè)功能必須同時(shí)具有三個(gè)基本元件才能存在，三者分別為兩種物質(zhì)和物質(zhì)間相互作用的場(chǎng)。物場(chǎng)模型可以用來(lái)發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)化問(wèn)題，解法為76種標(biāo)準(zhǔn)解。（見(jiàn)圖1）

2 問(wèn)題提出與TRIZ模型分析

2.1 問(wèn)題的定義和分析

TRIZ對(duì)于問(wèn)題的解決是從系統(tǒng)的確定開始的。上文提到系統(tǒng)的選擇可大可小，但范圍的選擇至關(guān)重要，如系統(tǒng)選擇過(guò)小，則系統(tǒng)內(nèi)子系統(tǒng)過(guò)少或者沒(méi)有，相互之間的關(guān)系和功能缺乏，造成解決方法過(guò)少；如系統(tǒng)選擇過(guò)大，則系統(tǒng)內(nèi)子系統(tǒng)過(guò)多而超系統(tǒng)少，內(nèi)部關(guān)系復(fù)雜難以完整分析。在本研究中選擇滅活疫苗為技術(shù)系統(tǒng)，組建組件模型和確定功能關(guān)系，如下圖所示。

其中滅活劑為超系統(tǒng)組件，疫苗為作用對(duì)象。在該組件系統(tǒng)中，定義存在問(wèn)題的功能關(guān)系有兩個(gè)，即“滅活劑-破壞-有害”和“佐劑-包裹-不足”。佐劑的內(nèi)容較為復(fù)雜，做另文發(fā)表，這里針對(duì)“滅活劑-破壞-有害”這一問(wèn)題進(jìn)行解決方案的探索。

問(wèn)題定義和系統(tǒng)分析后進(jìn)行三軸分析。三軸分析是從因果軸、操作軸和資源軸出發(fā)，分析當(dāng)前技術(shù)問(wèn)題的根本原因和解題資源，達(dá)到以最低成本解決問(wèn)題的目的。針對(duì)滅活劑的破壞作用，首先進(jìn)行因果分析。目前疫苗生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的滅活劑是甲醛，在滅活過(guò)程中，主要是滅活病原的蛋白質(zhì)及包裹在內(nèi)的核酸。滅活進(jìn)行時(shí)，甲醛首先作用于核酸，與腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的堿基結(jié)合而使病毒核酸變性。當(dāng)甲醛繼續(xù)作用，就與蛋白質(zhì)的胺基結(jié)合，形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物，而后再與酰胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，致使蛋白質(zhì)變性，并阻止核酸的逸出。所以，甲醛滅活蛋白發(fā)生在核酸滅活之后，蛋白質(zhì)變性才能保證疫苗的完全滅活。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，能夠激活免疫系統(tǒng)的氨基酸稱為抗原表位（抗原決定簇），表位依據(jù)形態(tài)又可分為線性表位和構(gòu)象（空間）表位?？臻g表位因其存在的位置和構(gòu)象，往往能比線性表位更好地被免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生特異性抗體。但滅活劑發(fā)生作用時(shí)，空間表位隨之被破壞，形成線性表位的狀態(tài)或者失去蛋白活性，而線性表位因本身長(zhǎng)度較短的線性狀態(tài)則基本不受影響，所以滅活劑的有害作用根本原因是破壞了空間表位的構(gòu)象。由此可見(jiàn)，滅活疫苗的滅活對(duì)象關(guān)鍵組分是蛋白的空間表位。

在因果分析中找到了問(wèn)題的根本所在，在資源軸上考慮能否不使用滅活劑或者換成其他的滅活劑（如BPL、BEI）解決因空間表位被破壞而損失疫苗免疫效價(jià)的問(wèn)題。但因安全、成本和適用范圍的原因不是最合適的方案。

在目前的生產(chǎn)中，滅活雖然破壞了蛋白空間表位，損失了疫苗產(chǎn)生的效價(jià)，但以安全為前提的情況下，空間表位的作用被忽略了。根據(jù)三軸分析的結(jié)果，針對(duì)滅活劑對(duì)空間表位的破壞作用，如何在保證安全的前提下降低空間表位的破壞和高效利用，設(shè)計(jì)出一個(gè)初步方案：調(diào)整甲醛的工作時(shí)間和濃度，減少對(duì)于空間表位構(gòu)象的破壞程度。

運(yùn)用TRIZ理論進(jìn)行發(fā)明、創(chuàng)新的關(guān)鍵是找出矛盾，并分析技術(shù)矛盾或物理矛盾，然后運(yùn)用TRIZ的解題工具找出解決矛盾的思考方向。對(duì)于初步方案的分析，得到一對(duì)技術(shù)矛盾，雖然減少了滅活劑對(duì)空間構(gòu)象的破壞，但疫苗的安全性無(wú)法得到保障。對(duì)照TRIZ矛盾矩陣，這對(duì)矛盾改善了“作用與物體的有害因素”卻惡化了“可靠性”。查找矛盾對(duì)應(yīng)的創(chuàng)新原理有四個(gè)，分別為廉價(jià)替代品原理、借助中介物原理、抽取原理和復(fù)合材料原理。其中抽取原理為問(wèn)題的解決提供了新的思路。抽取原理的內(nèi)容有兩條：一是從物體中抽出產(chǎn)生負(fù)影響的部分或?qū)傩?，二是從物體中抽出必要的部分或?qū)傩?。?duì)應(yīng)到滅活劑破壞病原蛋白空間表位的問(wèn)題上，既然滅活疫苗以安全為首要目標(biāo)，必須進(jìn)行病原的完全滅活，解決方案應(yīng)轉(zhuǎn)變思路，將蛋白空間表位抽提出來(lái)，作為滅活疫苗是否安全的指示系統(tǒng)，建立滅活疫苗滅活是否完全的檢測(cè)新方法，實(shí)現(xiàn)空間表位的高效利用。

2.2 解決方案的設(shè)計(jì)

2.2.1 總體方案

利用TRIZ分析獲得的方案，以滅活疫苗滅活中間產(chǎn)品蛋白空間表位的破壞為標(biāo)準(zhǔn)，建立滅活疫苗滅活程度的檢驗(yàn)方法，即安全性檢驗(yàn)新方法。新方法集成了疫苗滅活、蛋白結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)，不僅解決了空間表位的創(chuàng)新利用，而且與現(xiàn)行滅活疫苗安全性檢驗(yàn)方法相比，有三個(gè)突出特點(diǎn)：一是提高了檢測(cè)精度，變定性檢測(cè)為定量檢測(cè)；二是縮短了檢測(cè)時(shí)間，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程最多只需24小時(shí)；三是提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，利用免疫學(xué)技術(shù)糾正肉眼不易觀察的病變。

2.2.2 方案基礎(chǔ)

（1）滅活。如因果分析所述，目前疫苗生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的滅活劑是甲醛，甲醛滅活蛋白發(fā)生在核酸滅活之后，蛋白質(zhì)的變性能夠作為滅活完全的標(biāo)志。（2）抗原表位。同樣如因果分析所述，空間表位存在與否與蛋白是否變性是一致的，能夠作為滅活完全的判定標(biāo)準(zhǔn)。（3）空間表位的確定。肽掃描技術(shù)、氨基酸突變、X-ray、質(zhì)譜、噬菌體展示等均可用于空間表位的篩選[5]。利用這些方法，能夠簡(jiǎn)單可靠的確定大多數(shù)病毒主要抗原蛋白的空間表位，用于相關(guān)研究，保證了利用空間表位檢驗(yàn)滅活疫苗安全性成為可能。（4）ELISA檢測(cè)技術(shù)。免疫學(xué)檢測(cè)常用技術(shù)，以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)。利用基因工程技術(shù)對(duì)空間表位或其所在蛋白進(jìn)行可溶性表達(dá)，以保證制備的蛋白具有天然構(gòu)象。隨后使用蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫，制備相應(yīng)的單克隆或者多克隆抗體，從而建立雙夾心ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)滅活原理和抗原表位的分析，明確了空間表位在滅活過(guò)程中的作用，然后結(jié)合ELISA技術(shù)完成安全性的檢測(cè)。

2.2.3 應(yīng)用示例

以Lasota株滅活疫苗滅活程度的檢測(cè)為例。在生產(chǎn)中以雞胚接種尿囊腔的方式進(jìn)行病毒的增殖，隨后收集尿囊液以甲醛為滅活劑進(jìn)行滅活。利用肽掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HN蛋白163-569位氨基酸包含的7個(gè)抗原表位均為空間表位。以HN 163-569位氨基酸為目的蛋白，應(yīng)用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為表達(dá)媒介進(jìn)行蛋白的表達(dá)，獲得具有天然構(gòu)象的蛋白。將蛋白純化后免疫小鼠三次，采血分離血清制備多克隆抗體。制備抗體后建立檢測(cè)新城疫病毒的雙夾心ELISA方法。應(yīng)用的特異性NDV HN抗體和酶標(biāo)的NDV HN抗體為制備的多克隆抗體。最后通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定OD450的值，結(jié)合陰陽(yáng)性對(duì)照，最終確定待檢樣品的滅活程度。如檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則表明滅活中間品未滅活完全，結(jié)果為陰性時(shí)，則滅活中間品滅活完全。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在24小時(shí)內(nèi)完成。

疫苗滅活過(guò)程中對(duì)空間表位的破壞是不可避免的，使原本可以有效激發(fā)機(jī)體免疫的主要組分不能發(fā)揮作用，在這種情況下如何合理運(yùn)用、充分發(fā)揮空間表位的作用，TRIZ提供了新的思路：一是利用抽提原理將空間表位分離出來(lái)加以利用，在破壞不可避免的情況下變害為利，結(jié)合分子生物學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)建立新的檢驗(yàn)疫苗安全性的方法，用以指示疫苗是否滅活完全；二是解決了目前疫苗安全性檢測(cè)方法的缺點(diǎn)?，F(xiàn)行滅活程度的檢驗(yàn)一般通過(guò)接種對(duì)本毒敏感的細(xì)胞、禽胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，根據(jù)病變或死亡狀況進(jìn)行判定，需花費(fèi)多達(dá)5-6天的時(shí)間，耗時(shí)長(zhǎng)且中間操作過(guò)程要求嚴(yán)格。傳統(tǒng)的方法在要求生產(chǎn)效率提升和科技創(chuàng)新的背景下已不合時(shí)宜。TRIZ原理提供的新方法解決了以上不足。

3 結(jié)束語(yǔ)

滅活疫苗的問(wèn)題雖小，但說(shuō)明TRIZ理論完全可以在獸醫(yī)領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用，為科研和技術(shù)難題的攻關(guān)提供新思路和方案。這是TRIZ理論在獸醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用的一次有益嘗試，也為在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的全面應(yīng)用提供了借鑒。

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作者簡(jiǎn)介：張琳（1984-），男，山東濟(jì)南人，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所助理研究員。