強(qiáng)骨寶對(duì)疲勞性損傷誘發(fā)膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的作用

李芃　張俐

【摘 要】目的：探討強(qiáng)骨寶治療大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型的作用機(jī)制。方法：將56只8周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠分為空白對(duì)照組8只，模型對(duì)照組24只，強(qiáng)骨寶組24只。強(qiáng)骨寶組及模型對(duì)照組大鼠通過行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)訓(xùn)練以建立疲勞性膝骨關(guān)節(jié)炎模型。造模成功后，強(qiáng)骨寶組大鼠灌服強(qiáng)骨寶湯劑，模型對(duì)照組及空白對(duì)照組予以等量生理鹽水，分別于給藥1，2，3，4周后，取大鼠血清行誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，

SOD）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量檢測(cè)；取股骨下段行病理學(xué)觀察；并檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中iNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果：①根據(jù)Mankin評(píng)分情況，給藥第4周后，模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)為中度損傷，強(qiáng)骨寶組大鼠關(guān)節(jié)軟骨為輕度損傷。②給藥第2周后，強(qiáng)骨寶組大鼠血清iNOS含量較模型對(duì)照組顯著降低（F = 636.465，P < 0.05）；給藥第3周后，強(qiáng)骨寶組SOD含量較前升高，且顯著高于模型對(duì)照組（F = 1708.818，P < 0.05）；給藥前3周，強(qiáng)骨寶組大鼠血清VEGF含量呈顯著下降趨勢(shì)（F = 252.740，P < 0.05），模型對(duì)照組呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。③強(qiáng)骨寶組可見iNOS蛋白表達(dá)減弱，同一給藥時(shí)間點(diǎn)，強(qiáng)骨寶組蛋白表達(dá)均低于模型對(duì)照組（F = 63.622，P < 0.05）。結(jié)論：強(qiáng)骨寶可抑制勞損性骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨病變的發(fā)展，從而減輕大鼠膝關(guān)節(jié)病變所產(chǎn)生的癥狀。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；強(qiáng)骨寶；雙側(cè)卵巢切除；疲勞運(yùn)動(dòng)；模型；大鼠

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，較常見的發(fā)病部位包括膝、髖和脊柱關(guān)節(jié)等。本病屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“膝痹”范疇，其發(fā)病率較高，多見于中老年人，且女性多于男性，嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量。65歲以上人群中放射學(xué)OA的患病率可達(dá)50%以上，而在75歲以上人群中，可達(dá)到80%左右[1]。強(qiáng)骨寶是我國著名骨傷名老中醫(yī)張安楨教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用60余年，具有益腎壯骨、活血止痛之功效，用于治療骨與關(guān)節(jié)退行性變。本藥現(xiàn)已通過薄層鑒別研究，制訂了穩(wěn)定的強(qiáng)骨寶膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。本課題通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)M女性膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA），觀察強(qiáng)骨寶對(duì)KOA模型大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與造模 8周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠56只，體質(zhì)量（200±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：2007000549443；大鼠飼養(yǎng)在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001。飼養(yǎng)環(huán)境及飲食均符合動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。按體質(zhì)量均衡原則，采用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組

8只，模型對(duì)照組24只，強(qiáng)骨寶組24只，模型對(duì)照組及強(qiáng)骨寶組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)及ZH-PT動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，建立大鼠疲勞性KOA模型。具體訓(xùn)練方法如下：運(yùn)動(dòng)為持續(xù)性下坡跑，速度為16 m·min-1，坡度-16°，每次100 min，間隔

5 min，每日2次，連續(xù)訓(xùn)練35 d。運(yùn)動(dòng)中使用聲、光刺激或毛刷刺激尾部，不使用電刺激。毛刷刺激大鼠尾部，仍跟不上預(yù)定速度，體征表現(xiàn)為呼吸急促，神情倦怠，后肢跛行，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍等，視為建立了疲勞性損傷模型[4-7]。

1.2 藥物制備及給藥 強(qiáng)骨寶由補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、三七、甘草等藥物組成，由福建省中醫(yī)藥科技開發(fā)總公司制備，加工成每毫升含生藥1 g的藥液，于

-20 ℃密封保存，用時(shí)分裝后于4 ℃保存?zhèn)溆?。造?5 d后，強(qiáng)骨寶組每天灌服強(qiáng)骨寶湯劑，大鼠給藥劑量按與人的體表面積關(guān)系計(jì)算[8]，劑量為3.9 g·kg-1，

分早、晚2次進(jìn)行，連續(xù)4周。模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給等劑量生理鹽水灌服，連續(xù)4周。

1.3 動(dòng)物取材與指標(biāo)檢測(cè) 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別于給藥1，2，3，4周后，模型對(duì)照組和強(qiáng)骨寶組各選取6只大鼠，抽取腹主動(dòng)脈血，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA，ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，測(cè)定步驟按試劑盒說明進(jìn)行）方法檢測(cè)血清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量。分別取各組大鼠股骨下段，經(jīng)充分固定脫鈣后，石蠟包埋、切片，行HE染色，200倍光鏡下以Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨損傷程度，0～2分為正常軟骨，3～5分為軟骨表面纖維化，6～7分為中度軟骨損傷，8～10分為重度軟骨損傷，10分以上為軟骨完全缺失。取各組大鼠膝關(guān)節(jié)面軟骨，提取關(guān)節(jié)軟骨蛋白，經(jīng)蛋白深度定量后，行蛋白免疫印記雜交法（Western Blot）測(cè)定關(guān)節(jié)軟骨中iNOS蛋白的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）；采用二元定距變量Pearson簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠各給藥時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)形態(tài)及Mankin評(píng)分比較 給藥1周后，模型對(duì)照組及強(qiáng)骨寶組關(guān)節(jié)軟骨損傷形態(tài)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。給藥2周后，強(qiáng)骨寶組關(guān)節(jié)軟骨損傷情況較同期模型對(duì)照組有所改善（P < 0.05）。給藥4周后，模型對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin評(píng)分（6.333±0.516）分，為中度軟骨損傷；強(qiáng)骨寶組關(guān)節(jié)軟骨表面平整，基質(zhì)染色均勻，細(xì)胞較前增多，評(píng)分（2.833±0.752）分，為輕度損傷，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1、表1。

圖1 各給藥時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)軟骨光鏡切片（HE染色×200）

2.2 各組大鼠各給藥時(shí)間點(diǎn)血清iNOS含量比較 給藥1周后，模型對(duì)照組與強(qiáng)骨寶組iNOS含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。給藥2周后，強(qiáng)骨寶組大鼠血清iNOS含量較模型對(duì)照組顯著降低（P < 0.05），且呈持續(xù)降低。見表2。

2.3 各組大鼠各給藥時(shí)間點(diǎn)血清SOD含量比較 給

藥1，2周后，模型對(duì)照組與強(qiáng)骨寶組大鼠血清中SOD含量均呈下降趨勢(shì)，強(qiáng)骨寶組SOD含量較模型對(duì)照組高（P < 0.05）。給藥3周后，強(qiáng)骨寶組SOD含量較前升高，且顯著高于模型對(duì)照組，但與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠各給藥時(shí)間點(diǎn)血清VEGF含量比較 給藥后前3周，強(qiáng)骨寶組大鼠血清VEGF含量呈顯著下降趨勢(shì)（P < 0.05），模型對(duì)照組呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。給藥4周后，強(qiáng)骨寶組VEGF含量改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠各給藥時(shí)間點(diǎn)軟骨細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)比較 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中均有iNOS蛋白表達(dá)，但iNOS蛋白在正常軟骨組織中表達(dá)較弱，經(jīng)雙側(cè)卵巢切除以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)訓(xùn)練后，表達(dá)可見增強(qiáng)。經(jīng)過強(qiáng)骨寶干預(yù)后，強(qiáng)骨寶組大鼠軟骨組織iNOS蛋白表達(dá)減弱，并接近空白對(duì)照組蛋白表達(dá)（P > 0.05），見圖2（1）、表5。同一給藥時(shí)間內(nèi)，強(qiáng)骨寶組蛋白表達(dá)均低于模型對(duì)照組

（P < 0.05），見圖2（2）、表5。

注 1.空白對(duì)照組；2.給藥1周后模型對(duì)照組；3.給藥2周后模型對(duì)照組；4.給藥3周后模型對(duì)照組；5.給藥4周后模型對(duì)照組；6.給藥1周后強(qiáng)骨寶組；7.給藥2周后強(qiáng)骨寶組；8.給藥3周后強(qiáng)骨寶組；9.給藥4周后強(qiáng)骨寶組。給藥1，2，3，4周后，與模型對(duì)照組比較，1）P < 0.05；給藥4周后，與空白對(duì)照組比較，2）P > 0.05

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中iNOS蛋白表達(dá)情況

3 討 論

在現(xiàn)有的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，已知一氧化氮（NO）、VEGF、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等因子在關(guān)節(jié)軟骨病變過程中起到重要作用[10-11]。OA發(fā)病早期，受損裸露的軟骨細(xì)胞在周圍細(xì)胞因子的作用下，誘發(fā)iNOS蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致NO大量釋放。NO又進(jìn)一步促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子釋放，從而抑制軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和合成Ⅱ型膠原，影響軟骨的營(yíng)養(yǎng)交換，使軟骨處在一個(gè)不良的微環(huán)境中，最終導(dǎo)致軟骨質(zhì)量不斷下降和進(jìn)行性退化[12]。OA的顯著特征是關(guān)節(jié)軟骨的血管化。血管通過纖維組織管道滲透到關(guān)節(jié)軟骨，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡[13]。VEGF作為一個(gè)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的細(xì)胞因子，是導(dǎo)致OA中血管新生的最強(qiáng)有力的因素，其過度表達(dá)可能是導(dǎo)致OA滑膜血管翳形成，滑膜炎癥持續(xù)存在并導(dǎo)致軟骨破壞的關(guān)鍵因子[14]。而SOD作為自由基清除劑，其濃度下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基含量升高，抑制軟骨細(xì)胞增殖致細(xì)胞死亡[15]，最終通過影響關(guān)節(jié)軟骨的完整性，引起關(guān)節(jié)的退行性改變。

強(qiáng)骨寶具有益腎壯骨、活血止痛之功效。相關(guān)研究表明，骨碎補(bǔ)對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎具有刺激骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代償性增生作用，并能部分改善由于力學(xué)應(yīng)力線改變?cè)斐申P(guān)節(jié)軟骨的退行性變，從而降低骨關(guān)節(jié)病變率[16-17]。郝小金等[18]通過實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)腎活血“對(duì)藥”對(duì)兔KOA模型血清炎性細(xì)胞因子及氧自由基的影響，結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂+骨碎補(bǔ)“對(duì)藥”能降低IL-1、TNF-α及NO的含量，提高SOD水平。

在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過藥物干預(yù)，強(qiáng)骨寶組大鼠血清中iNOS、VEGF含量總體上（下轉(zhuǎn)第43頁）

（上接第33頁）呈下降趨勢(shì)，與同一給藥時(shí)間周期內(nèi)的模型對(duì)照組比較，其含量顯著減少。iNOS蛋白在正常關(guān)節(jié)軟骨蛋白中呈現(xiàn)較弱的表達(dá)趨勢(shì)，但模型對(duì)照組大鼠在造模后，出現(xiàn)了iNOS蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，且其表達(dá)程度顯著高于同一給藥時(shí)間周期內(nèi)強(qiáng)骨寶組蛋白表達(dá)。在藥物干預(yù)前2周，強(qiáng)骨寶組、模型對(duì)照組大鼠血清中SOD含量均呈下降趨勢(shì)（強(qiáng)骨寶組含量較同一給藥時(shí)間周期內(nèi)模型對(duì)照組高）；給藥3周后，強(qiáng)骨寶組大鼠血清SOD含量下降趨勢(shì)減緩，并較前有所上升，而模型對(duì)照組SOD含量則持續(xù)下降。綜上所述，可以認(rèn)為，強(qiáng)骨寶可抑制關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中iNOS、VEGF的產(chǎn)生，以及減弱關(guān)節(jié)軟骨中iNOS蛋白表達(dá)，同時(shí)減慢大鼠血清SOD下降程度，以達(dá)到減緩大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病變發(fā)展的作用。

本次實(shí)驗(yàn)中所采用的造模方法及標(biāo)本觀察時(shí)間均在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上制訂，能成功制造出輕、中度膝關(guān)節(jié)軟骨損傷形成KOA早期模型。在藥物干預(yù)方面，根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可認(rèn)為強(qiáng)骨寶對(duì)大鼠早期KOA癥狀有治療作用。但由于動(dòng)物模型損傷程度所限，藥物對(duì)KOA中、后期的病變是否能起到相同的治療作用，還有待進(jìn)一步觀察。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 李儒軍，林劍浩.骨關(guān)節(jié)炎流行病學(xué)的研究進(jìn)展[J].中國臨床醫(yī)生，2010，38（7）：6-10.

[2] 姜學(xué)敏，陳偉玲，楊明容，等.強(qiáng)骨寶膠囊的薄層鑒別研究[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，7（4）：16-18.

[3] 姜學(xué)敏，陳偉玲，楊明容，等.雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定強(qiáng)骨寶膠囊中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，8（1）：27-28.

[4] 張健，卜淑敏，魏兆松.運(yùn)動(dòng)結(jié)合藥物對(duì)大鼠骨骼密度影響的研究[J].首都體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，24（3）：274-279.

[5] 李世昌，季瀏，馬濤.不同方式跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)去卵巢小鼠破骨細(xì)胞分化及相關(guān)調(diào)節(jié)因子的影響[J].中國體育科技，2011，47（5）：134-140.

[6] 周蔚，陳立軍，張敏，等.不同訓(xùn)練負(fù)荷條件下SD大鼠運(yùn)動(dòng)模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（37）：6899-6903.

[7] 唐海峰.大鼠的不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)早期關(guān)節(jié)軟骨退變影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].北京：中國醫(yī)科大學(xué)，2010：6-21.

[8] 楊斐，胡櫻.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)基礎(chǔ)與技術(shù)[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2010：404-405.

[9] Makin HJ，Dorfrnan H.Biochemical andmetabolic abnormaliaties in caticular cartilage from osteoarthritisc human hips[J].Surg（Am），1971（53）：523-537.

[10] 石曉明，于占革.骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7（24）：11607-11610.

[11] 趙雪梅，李鴻斌，肖鎮(zhèn).骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)

展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2011，43（3）：321-327.

[12] 饒?jiān)伱?，杜建時(shí)，趙晴，等.白芍總苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎血清及關(guān)節(jié)液中一氧化氮及誘生型一氧化氮合酶的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2006，10（12）：1444-1445.

[13] 唐靜，李榮亨，周小莉.復(fù)元膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨中TNF-α和VEGF的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（6）：1374-1376.

[14] 朱寶玉，王奇緣，吳蓓，等.IL-6、VEGF在骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)滑膜和滑液中的表達(dá)及其意義[J].中國老年學(xué)雜志，2012，32（2）：273-275.

[15] 陳瑞蓮.超氧化物歧化酶在骨關(guān)節(jié)炎中的研究意義探討[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2011，23（6）：475-477.

[16] 陳順，關(guān)延彬.骨碎補(bǔ)藥理作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（7）：685-687.

[17] 朱慧鋒，王唯佳，王珠美，等.骨碎補(bǔ)研究進(jìn)展[J].中國骨傷，2009，22（1）：66-68.

[18] 郝小金，馮文進(jìn)，郝華，等.補(bǔ)腎活血“對(duì)藥”對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎NO、SOD、IL-1和TNF-α水平的影響[J].北京中醫(yī)藥，2010，29（5）：380-381.

收稿日期：2014-10-29；修回日期：2014-12-04