微波輔助提取牡丹籽粕多糖工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性

, ,,,國安

(河南科技大學(xué),洛陽市牡丹生物學(xué)重點實驗室,牡丹種質(zhì)創(chuàng)新與精深加工河南省工程實驗室,河南洛陽 471023)

牡丹是原產(chǎn)中國的特色花卉,傳統(tǒng)上主要用于觀賞和入藥,被人們認(rèn)為是富貴吉祥、繁榮昌盛的象征,在全國各地廣泛種植,其中以河南洛陽、山東菏澤種植最多。近年來,牡丹籽油開發(fā)呈現(xiàn)良好態(tài)勢,油用牡丹做為新型木本油料作物在全國的種植面積迅速擴(kuò)大,對滿足我國對優(yōu)質(zhì)食用油需求和防范食用油安全風(fēng)險具有重要意義[1-2]。牡丹籽油生產(chǎn)產(chǎn)生的大量牡丹籽粕副產(chǎn)物,包含有豐富的活性成分和營養(yǎng)物質(zhì),如多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素等[3]。

植物多糖來源廣泛,從植物的根、莖、葉、花、果實、種子及其他器官[4],均有成功提取活性多糖的報道。尤其是提取植物油脂后的大量餅粕副產(chǎn)物,成為植物多糖最為重要的來源,如油茶、大豆、花生等餅粕[5-6]。生物多糖具有清除自由基的作用,補(bǔ)充多糖具有明顯的抗氧化功能[7-9]。植物多糖是極性大分子化合物,其提取工藝多以熱水法為基礎(chǔ)。在多糖提取的研究中采用溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、超濾法、超聲波法、微波法等多種方法。隨著微波技術(shù)和設(shè)備的日趨完善,微波輔助法提取植物多糖的工藝優(yōu)化為生產(chǎn)應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)[10-12]。張利霞等[13]通過響應(yīng)面法優(yōu)化測得牡丹皮多糖提取率為3.727%,王洪政等[14]、路祺等[15]分別測得牡丹果莢多糖提取率為8.77%和8.34%,湛志偉等[16]通過正交實驗測得牡丹種仁的提取率為3.825%,表明牡丹果莢、種皮和種仁中均含有多糖成分。王洪政等[14]用DPPH法證明牡丹莢果多糖有明顯的抗氧化活性。因此,對牡丹籽粕多糖在醫(yī)藥保健品和天然抗氧化劑等領(lǐng)域的深入研究,具有重要的理論和應(yīng)用價值。

目前,對牡丹籽油提取工藝研究較多[17-18],而對籽粕綜合利用研究的報道較少。本研究采用微波法輔助提取牡丹籽粕中粗多糖,通過正交實驗對提取多糖的工藝參數(shù)(微波處理時間、功率、籽粕粒度和料液比)進(jìn)行了優(yōu)化,并分析了牡丹籽粕多糖的體外抗氧化活性,以期為牡丹籽粕的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

‘鳳丹’牡丹籽 經(jīng)超臨界萃取牡丹籽油后的籽粕,密封保存于4 ℃冰箱備用;三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、碘、碘化鉀、硫酸亞鐵、三氯乙酸、抗壞血酸(VC)、二丁基羥基甲苯(BHT)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫代巴比妥酸(TBA) 均為國產(chǎn)分析純試劑。

格蘭仕WD800G-BL20微波爐 順德市格蘭仕電器實業(yè)有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;JA8102電子天平 上海精密電子儀器有限公司;TU1810 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;索氏抽提器 上海瀚赫國際貿(mào)易有限公司;LD4-2低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;XH-B渦旋混合器 無錫沃信儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 多糖的提取

1.2.1.1 多糖微波法提取工藝流程 稱取粉碎、過篩分級的牡丹籽粕適量,乙醚回流脫脂3 h(固液比1∶3,W/V),40 ℃烘干。準(zhǔn)確稱取合適粒度的牡丹籽粕2.00 g放入三角瓶,加入適量的蒸餾水,經(jīng)一定的微波功率下間歇處理一段時間,50 ℃保溫振蕩30 min,然后4000 r/min離心25 min,取上清液,再加入25%體積的Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1),劇烈振蕩20 min,4000 r/min離心20 min,取上清液重復(fù)脫蛋白,直至離心后無蛋白中間層出現(xiàn)。然后將上清液減壓濃縮至適量,再加入3倍體積的無水乙醇,靜置過夜。4000 r/min離心25 min,沉淀部分經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,靜置沉淀離心,棄上清后40 ℃干燥箱中干燥,即可獲得牡丹籽粕粗多糖(PS)。

1.2.1.2 多糖含量測定 以葡萄糖為對照品,采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定牡丹籽粕還原糖含量。將提取的牡丹籽粕粗多糖用蒸餾水溶解,定容至250 mL。準(zhǔn)確吸取稀釋液10 mL,加入6 mol/L HCl溶液5 mL,沸水浴中水解0.5 h,冷卻后用6 mol/L NaOH溶液中和至pH呈中性,然后用蒸餾水定容至100 mL。分別取1 mL糖提取液和糖水解液,測定還原糖含量。按下列公式計算樣品多糖提取得率:

還原糖(%)=C1V1/m×100

總糖(%)=C2V2N/m×0.9×100

多糖提取得率(%)=總糖-還原糖

式中:C1為還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/mL),V1為樣品總糖溶液的體積(mL),C2為水解后還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/mL),V2為樣品總糖水解液的體積(mL),N為稀釋倍數(shù),m為樣品的質(zhì)量(mg)。

1.2.2 牡丹籽粕多糖提取單因素實驗 根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果,影響牡丹籽粕多糖微波輔助提取的主要因素有微波處理時間、微波功率、籽粕粒度、料液比等。

1.2.2.1 微波處理時間 分別為1、2、3、4、5、6、7、8和9 min,在微波功率160 W、物料粒度60目、料液比1∶15 g/mL條件下提取一次,考察微波處理時間對多糖得率的影響。

1.2.2.2 微波功率 分別為160、320、480、640和800W,在微波處理時間7 min、物料粒度60目、料液比1∶15 g/mL條件下提取一次,考察微波功率對多糖得率的影響。

1.2.2.3 物料粒度 分別為20、40、60、80、100和120目,在微波處理時間7 min、微波功率480 W、料液比1∶15 g/mL條件下提取一次,考察物料粒度對多糖得率的影響。

1.2.2.4 料液比 分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35,在微波處理時間7 min、微波功率480 W、物料粒度80目條件下提取一次,考察料液比對多糖得率的影響。

1.2.3 牡丹籽粕多糖提取正交實驗 根據(jù)單因素實驗確定的條件范圍,進(jìn)行微波處理時間、功率、籽粕粒度和固液比4因素3水平的正交實驗,選用L9(34)正交實驗,確定提取多糖的最佳工藝參數(shù),水平因素見表1。結(jié)果由極差分析和SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析,確定各因素對多糖提取得率的影響大小和多糖最優(yōu)提取工藝。

表1 微波法提取牡丹籽粕多糖正交實驗因素水平表Table 1 The orthogonal test factors and levels of tree peony seed meal by Microwave extract

1.3體外抗氧化活性

1.3.1 DPPH自由基體系 按彭長連等[19]和Larrauri等[20]的方法加以改進(jìn)。將1 mL不同濃度的多糖水溶液加入2 mL 100 μmol/L DPPH乙醇溶液中,以等體積的雙蒸水代替多糖溶液作為對照,用乙醇溶液為空白對照調(diào)零。室溫放置30 min后,用分光光度計測定517 nm處的吸光值,實驗重復(fù)3次。清除DPPH自由基活性用抑制率(%)表示。

抑制率(%)=(對照管A517-樣品管A517)/對照管A517×100。

以脂溶性BHT(200 μg/mL)與水溶性VC(80 μg/mL)的乙醇溶液做陽性對照,繪制清除DPPH自由基的時間效應(yīng)曲線,對比60 μg/mL牡丹籽粕多糖(PS)溶液的作用時間效應(yīng)曲線,以此推斷牡丹籽粕多糖的抗氧化劑的作用特性。

1.3.2 卵黃脂蛋白PUFA過氧化體系中抗氧化活性的測定 按張爾賢等[21]和史國安等[22]方法,建立以Fe2+誘發(fā)卵黃磷脂C-2上的極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白PUFA的過氧化模型。

取新鮮的雞蛋黃加等體積的無菌蒸餾水,制備蛋黃懸浮液。 配制100 μg/mL PS水溶液和30%乙醇溶液,及80 μg/mL VC和 200 μg/mL BHT的乙醇溶液做陽性對照。反應(yīng)體系:0.2 mL蛋黃懸浮液,0.2 mL 25 mmol/L FeSO4,1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.0),0.1 mL 樣品溶液,將試管置于 37 ℃水浴中溫浴 60 min,然后加入 2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% TBA-20% TCA 溶液,沸水浴15 min,迅速冷卻,于 3500 r/min離心5 min,以空白管調(diào)零(以等量的蒸餾水代替),測定 532 nm處的吸光值。對照管以等量的提取介質(zhì)代替,其他同樣品管。樣品抗氧化活性(AOA)用卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率(%)表示。

AOA(%)=(對照管A532-樣品管A532)/對照管A532×100。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗,以p<0.05為差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1牡丹籽粕多糖的單因素提取實驗

2.1.1 微波處理時間對牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖1可知,相同條件下,牡丹籽粕多糖得率隨微波處理時間延長而升高,當(dāng)微波處理時間超過7 min時,牡丹籽粕多糖得率反而略有下降?？赡苡捎谠跇O性溶劑水中,植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到微波輻射的破壞,使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高更容易破壁,而微波處理時間長導(dǎo)致較多雜質(zhì)溶出和多糖水解的緣故。由于微波處理時間7 min 時優(yōu)勢顯著,因此選擇微波處理時間7 min為最佳處理時間。

圖1 微波處理時間對多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave time on polysaccharide yield

2.1.2 微波功率對牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖2可知,牡丹籽粕多糖隨微波功率的提高呈現(xiàn)升高趨勢,當(dāng)微波功率480 W時,多糖得率最高,之后反而下降?？赡苡捎诠β蔬^大加速了提取液的流動和物料的溫度,在提高多糖浸出的同時加速了多糖的水解。故選擇微波功率320～640 W范圍內(nèi)進(jìn)一步優(yōu)化實驗。

圖2 微波功率對多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharide yield

2.1.3 物料粒度對牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖3可知,隨著物料粒度的增大粒徑減小,牡丹多糖得率迅速升高。當(dāng)粒度20～80目范圍內(nèi),多糖得率增加明顯,而物料粒度超過80目,則多糖得率反而下降。可能粒徑過大則細(xì)胞壁破壞困難,多糖溶出擴(kuò)散運動阻力也隨之增加;粒度過小多糖容易溶出,但也亦導(dǎo)致提取液粘度增大的緣故。故選擇物料粒度60～100 目范圍內(nèi)進(jìn)一步優(yōu)化實驗。

圖3 物料粒度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of material size on polysaccharide yield

2.1.4 料液比對牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖4可知,當(dāng)料液比由1∶15 g/mL增加到1∶30 g/mL時,牡丹籽粕多糖得率不斷升高,當(dāng)料液比大于1∶30 g/mL時,多糖得率趨于穩(wěn)定不再升高。在一定范圍內(nèi),提取液用量越大,多糖得率越高;但當(dāng)提取液用量過多時,多糖的浸出趨于完全,可能由于此時細(xì)胞壁破壞徹底,多糖溶出較完全的原因。故此選擇料液比為(1∶20～1∶30) g/mL進(jìn)一步優(yōu)化實驗。

圖4 料液比對多糖得率的影響Fig.4 Effect of material to liquid ratio on polysaccharide yield

2.2牡丹籽粕多糖的提取工藝優(yōu)化

根據(jù)表2可知,微波法輔助提取工藝中,各因素對牡丹籽粕多糖提取得率的影響力大小依次為為:料液比>微波功率>籽粕粒度>微波處理時間。最佳提取工藝條件為A3B2C3D2:微波提取時間8 min,微波功率480 W,粒度100目,料液比1∶25。

由表3可見,微波處理功率、固液比、籽粕粒度對提取結(jié)果的影響差異極顯著,微波處理時間對提取結(jié)果影響差異顯著。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

由于正交實驗所得的最佳工藝條件A3B2C3D2不在正交實驗表中,故做驗證實驗,與正交表中多糖得率最高的工藝條件A1B2C2D2進(jìn)行對比實驗。按照最佳提取工藝驗證實驗,牡丹籽粕多糖最高提取得率為9.21%,實驗結(jié)果表明最佳工藝條件仍為A3B2C3D2。

表3 微波法提取結(jié)果的方差分析Table 3 Analysis of variance of microwave extraction results

注:*p<0.05,差異顯著;**p<0.01,差異極顯著。

2.3體外抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基活性 從圖5時間效應(yīng)曲線可以看出,清除DPPH反應(yīng)體系中,水溶性抗氧化劑VC(80 μg/mL)能夠在短時間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)平衡,而脂溶性抗氧化劑BHT(200 μg/mL)達(dá)到反應(yīng)平衡的時間超過50 min。牡丹籽粕多糖(60 μg/mL PS)清除DPPH自由基的時間效應(yīng)曲線與VC類似,由此推測PS抗氧化作用的類型類似于水溶性抗氧化劑VC。

圖5 不同效應(yīng)物清除DPPH自由基的濃度和時間效應(yīng)曲線Fig.5 Time curves of scavenging effects of different effectors on DPPH

由圖6可知,牡丹籽粕多糖清除DPPH自由基的能力呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。隨著反應(yīng)體系中牡丹籽粕多糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg/mL時,清除率達(dá)80%以上。PS的IC50為43.22 μg/mL,大于VC的IC50(4.52 μg/mL)和BHT的IC50(21.20 μg/mL)。說明PS對DPPH自由基的亦有較強(qiáng)的清除能力,揭示PS具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖6 牡丹籽粕多糖對DPPH自由基的清除效應(yīng)Fig.6 Scavenging effects of crude polysaccharide on DPPH

2.3.2 卵黃脂蛋白PUFA過氧化體系中抗氧化活性 圖7示出,100 μg/mL PS水溶液的抗氧化活性略高于體積分?jǐn)?shù)30%乙醇多糖溶液,兩種溶液(100 μg/mL)的AOA值為20%～30%,但低于陽性對照VC(80 μg/mL)和BHT(200 μg/mL)。提示PS具有一定的抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成的能力,生物抗氧化效應(yīng)明顯。

圖7 牡丹籽粕多糖(PS)抗脂質(zhì)過氧化活性Fig.7 Antilipoperoxidation activity of polysaccharides from tree peony seed meal

3 結(jié)論

本研究以‘鳳丹’牡丹籽粕為原料,采用微波輔助法提取牡丹籽粕中多糖,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過正交實驗設(shè)計,優(yōu)化了最佳的提取工藝條件。正交實驗表明,各因素對多糖得率的影響大小依次為固液比>微波功率>籽粕粒度>微波處理時間,最佳微波提取工藝條件為:提取時間8 min,微波功率480 W,粒度120目,固液比1∶25 g/mL。在最佳工藝條件下,一次牡丹籽粕多糖提取率達(dá)到9.21%。微波輔助法是提取牡丹籽粕中水溶性多糖的一種簡單高效的好方法。

牡丹籽粕含有豐富的生物多糖。體外抗氧化實驗發(fā)現(xiàn),牡丹籽粕多糖(PS)對DPPH的清除能力呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系,抑制卵黃脂蛋白PUFA過氧化能力明顯,具有較強(qiáng)的抗氧化能力。表明牡丹籽粕多糖有可成為一種新的天然抗氧化劑。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討牡丹籽粕多糖做為食品添加劑、天然抗氧化劑等中的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]史國安,焦封喜,焦元鵬,等.中國油用牡丹的發(fā)展前景及對策[J].中國糧油學(xué)報,2014,29(9):124-128.

[2]王瑞元. 發(fā)展木本油料產(chǎn)業(yè)是提高我國食用油自給率的重要舉措[J]. 糧食與食品工業(yè),2016,23(4):1-4.

[3]史國安,郭香鳳,金寶磊,等.牡丹籽油超臨界 CO2萃取工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究[J].中國糧油學(xué)報,2013,28(4):93-98.

[4]常改,楊溢,霍飛,等.植物多糖的研究進(jìn)展及保健功能[J].中國公共衛(wèi)生,2003,19(11):1394-1395.

[5]吳雪輝,黃永芳,向汝莎,等. 微波提取油茶餅粕中多糖的工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(9):197-199.

[6]陳紅,王大為,李俠,等.不同方法提取大豆多糖的工藝優(yōu)化研究[J].食品科學(xué),2010,31(4):6-10.

[7]Matth?us B.Antioxidant activity of extracts obtained from residues of different oilseed[J].Journal of Agricultural and Food chemistry,2002,50(12):3444-3452.

[8]謝明勇,聶少平.天然產(chǎn)物活性多糖結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報,2013,10(2):1-11.

[9]方積年,丁侃.天然藥物——多糖的主要生物活性及分離純化方法[J].中國天然藥物,2007,5(5):338-347.

[10]Ganzler K,Szinai I,Salgo A.Effective sample preparation method for extracting biologically active compounds from different matrices by a microwave technique[J].Journal of Chromatography A,1990,520:257-262.

[11]王磊,劉秀鳳,邱芳萍,等.微波輔助提取玉米須多糖及其組成的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2009,28(1):72-75.

[12]柯樂芹,張東旭,肖建中.杏鮑菇深加工殘渣多糖酶法微波輔助提取工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2014,30(21):332-338.

[13]張利霞,常青山,侯小改,等.牡丹皮中多糖提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,47(6):118-124.

[14]王洪政,李媛媛,劉偉,等.響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹果莢多糖提取工藝及其抗氧化活性評估[J].植物研究,2015,35(1):127-132.

[15]路祺,高悅,項鳳影,等.牡丹種莢多糖提取工藝研究[J].植物研究,2015,35(1):154-157.

[16]諶志偉,滕文佳,劉選選,等.牡丹種仁多糖提取最佳工藝研究[J].中國釀造,2012,32(2):57-59.

[17]王順利,任秀霞,薛璟祺,等. 牡丹籽油成分、功效及加工工藝的研究進(jìn)展[J]. 中國糧油學(xué)報,2016,31(3):139-146.

[18]毛善巧,李西俊. 牡丹籽油的研究進(jìn)展及油用牡丹綜合利用價值分析[J]. 中國油脂,2017,42(5):123-126.

[19]彭長連,陳少薇,林植芳,等.用清除有機(jī)自由基DPPH法評價植物抗氧化能力[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2000,27(7):658-661.

[20]Larrauri J A,Sanchez-Moreno C,Saura-Calixto F. Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J].Joural of Agricltural Food Chemstry,1998,46(7):2694-2697.

[21]張爾賢,俞麗君,周意琳,等.Fe2+誘發(fā)脂蛋白PUFA過氧化體系及對若干天然產(chǎn)物抗氧化作用的評價[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,1996,28(2):218-222.

[22]史國安,郭香鳳,高雙成,等.牡丹花發(fā)育過程中花瓣抗氧化活性的變化[J].園藝學(xué)報,2009,36(11):1685-1690.