石墨烯熒光生物傳感器

姬丁坤　賀曉鵬　陳國(guó)榮

關(guān)鍵詞：氧化石墨烯 熒光 生物傳感器 核酸 多肽 糖類 細(xì)胞

材料科學(xué)的飛速發(fā)展使得由碳、氫、氧等元素組成的“碳素材料”成為未來“綠色有機(jī)材料”的重要組成部分。其中，以石墨烯為代表的新材料，由于其優(yōu)異的光學(xué)、力學(xué)、熱學(xué)及化學(xué)性質(zhì)而在生命科學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

21世紀(jì)以來，材料科學(xué)的飛速發(fā)展使包括化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)及電子科學(xué)在內(nèi)的諸多學(xué)科發(fā)生了翻天覆地的變化。傳統(tǒng)意義上的材料一般由無機(jī)化合物組成（如金屬等），然而考慮到部分重金屬無機(jī)物投入大規(guī)模生產(chǎn)后可能帶來的環(huán)境污染與對(duì)人類健康的損害，科學(xué)家開始注重發(fā)展“綠色有機(jī)材料”。其中，由碳、氫、氧這些人體必備元素所組成的“碳素材料”成為近年來學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)，并被證明它們?cè)陔娮悠骷?、先進(jìn)功能材料。尤其是可對(duì)生物分子活動(dòng)產(chǎn)生識(shí)別信號(hào)的生物傳感材料或器件的構(gòu)建中廣泛適用。

石墨烯的發(fā)現(xiàn)

2004年，英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的海姆（A.Geim）研究組采用微機(jī)械力處理石墨，從層狀石墨中成功剝離出單原子層石墨，即石墨烯（graphene）。石墨烯的出現(xiàn)很快在物理學(xué)界引起轟動(dòng)并激發(fā)了各學(xué)科領(lǐng)域的極大興趣，被國(guó)內(nèi)外研究人員寄予“引領(lǐng)傳感器新時(shí)代前進(jìn)步伐”的殷切厚望。自此，這種“二維”碳晶體猶如聚光燈下的一顆閃亮新星活躍在自然科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，并獲得2010年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。

石墨烯是一種由許多單個(gè)sp²雜化碳原子組成、呈蜂窩狀六方晶格的二維平面結(jié)構(gòu)，是迄今為止最薄、最硬的材料，它是形成零維（如富勒烯）和一維（如碳納米管）碳素材料的基礎(chǔ)。其優(yōu)異的光學(xué)、力學(xué)、熱學(xué)及化學(xué)性質(zhì)使其在生命科學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

氧化石墨烯是石墨烯的一種重要衍生物。主要通過化學(xué)法剝離氧化石墨獲得，即使用濃硫酸處理石墨鱗片，將硫酸分子插于石墨烯層間并用高錳酸鉀對(duì)其氧化，最后用過氧化氫除去未反應(yīng)的高錳酸鉀得到邊緣含有羧基和羥基、層間含有環(huán)氧和羰基等含氧基團(tuán)的氧化石墨，氧化石墨在溶劑中通過超聲剝離即可得到單層氧化態(tài)石墨烯。

起初，氧化石墨烯僅被用作化學(xué)法制備石墨烯的一種中間體，然而隨著研究的深入，其自身的獨(dú)特性質(zhì)越發(fā)受到關(guān)注。相比純凈的石墨烯。氧化石墨烯不但擁有一定的平面結(jié)構(gòu)，而且含有較多的氧官能團(tuán)（如環(huán)氧基、羥基、羧基）。這使得氧化石墨烯更容易在水中擴(kuò)散，極大拓展了其在生物傳感領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。

基于氧化石墨烯的生物傳感器構(gòu)建

氧化石墨烯具有良好的熒光猝滅能力，即可使得熒光染料的熒光減弱乃至消失，因此它在熒光生物傳感器的構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用為一類熒光猝滅平臺(tái)。氧化石墨烯的熒光猝滅性質(zhì)主要依賴于“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”效應(yīng)。這種效應(yīng)是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)之間，當(dāng)一個(gè)熒光基團(tuán)（供體）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體）的吸收光譜有一定重疊且分子間距離小于10納米的情況下，供體分子自身的熒光將比獨(dú)立存在時(shí)明顯減弱，而受體分子的熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)。此外，如受體分子的熒光可忽略不計(jì)，則僅發(fā)生供體分子的熒光猝滅現(xiàn)象。

相比其他材質(zhì)，氧化石墨烯在利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)構(gòu)建生物傳感器方面有如下優(yōu)點(diǎn)。

首先，對(duì)比碳納米管、金納米顆粒、碳纖維等，由于氧化石墨烯具有更大的分子吸附平面與空間，使其成為卓越的能量受體，從而具備更高的熒光猝滅效率。其次，得益于其特殊的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，氧化石墨烯可猝滅一系列不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光分子，是一種普遍適用的熒光猝滅劑。第三，由于氧化石墨烯較大的比表面積，它可同時(shí)吸附多種不同的熒光分子，從而實(shí)現(xiàn)多樣化的生物檢測(cè)。第四，氧化石墨烯表面和邊緣同時(shí)含有大量氧官能團(tuán)。不僅使氧化石墨烯具備了很好的水溶性和生物相容性。也為其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾提供了可能。

基于氧化石墨烯的熒光生物傳感器主要有三部分組成：探頭分子、熒光染料與氧化石墨烯。探頭部分可由不同生物分子如核酸、多肽和糖類等組成，用以靶向識(shí)別生物靶標(biāo)分子（如癌細(xì)胞特有的疾病相關(guān)蛋白）。而熒光染料和氧化石墨烯協(xié)同為探頭分子與生物靶標(biāo)間的識(shí)別提供了信號(hào)輸出。此類新型生物傳感器的構(gòu)建簡(jiǎn)易、高效且成本低廉，有望發(fā)展成為新一代經(jīng)濟(jì)型的疾病探測(cè)新技術(shù)。

基于氧化石墨烯的生物傳感器應(yīng)用

基于多肽與氧化石墨烯復(fù)合材料的生物傳感器

肽是氨基酸以酰胺鍵連接而成的多聚物，由三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物即可稱為多肽。利用化學(xué)和生物學(xué)的手段研究多肽與其識(shí)別蛋白之間的相互作用有利于對(duì)人體健康與疾病問題的深入理解。隨著科技的進(jìn)步，多肽合成手段愈發(fā)成熟，且越來越多的多肽結(jié)構(gòu)被鑒定為疾病相關(guān)蛋白的特殊配體（即可與相應(yīng)蛋白質(zhì)高選擇性地牢固結(jié)合）。于是，多肽作為探頭部分被廣泛應(yīng)用于氧化石墨烯熒光生物傳感器的構(gòu)建，并主要扮演“識(shí)別”與疾病相關(guān)蛋白或水解酶的角色。

此類傳感器的工作原理在于以熒光標(biāo)記的多肽作為探頭，通過與氧化石墨烯表面的吸附使熒光猝滅。當(dāng)加入可與多肽特異性結(jié)合的蛋白時(shí)，目標(biāo)蛋白通過與多肽的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使探頭脫離氧化石墨烯表面同時(shí)恢復(fù)熒光。此類傳感器易于構(gòu)建，且高效、經(jīng)濟(jì)，僅需改變多肽探頭的種類即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同疾病蛋白的檢測(cè)。

自20世紀(jì)以來，癌癥持續(xù)威脅著人類的生命健康，對(duì)癌癥的早期診斷和監(jiān)控至關(guān)重要。對(duì)血清中腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)是現(xiàn)有癌癥化驗(yàn)中創(chuàng)傷最小的一種方法，不但規(guī)避了對(duì)病人的輻射式（超聲、磁共振等）與侵入式（活檢取樣）體檢，還有利于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)。前列腺特異性抗原（PSA）是一種前列腺癌細(xì)胞分泌的蛋白酶，它是診斷前列腺癌的重要腫瘤標(biāo)志物。血清中分布有活性與惰性PSA，研究表明，活性PSA可作為更有效的腫瘤標(biāo)志物來預(yù)警惡性腫瘤。研究人員合成了可被活性PSA分解的熒光多肽探頭并與氧化石墨烯結(jié)合形成PSA復(fù)合材料生物傳感器，通過與PSA的酶切作用可游離出傳感器熒光。此項(xiàng)研究還可以對(duì)尿液中活性PSA作定量檢測(cè)，為前列腺癌的診斷和治療提供了新技術(shù)。

艾滋病是一種由感染人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的危害性極大的傳染病，可通過攻擊人體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞使人體喪失免疫功能。至今世界范圍內(nèi)已有1200萬(wàn)人死于艾滋病，并有超過3000萬(wàn)人受艾滋病毒感染。尋找可快速靈敏診斷HIV的方法成為學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。gp120蛋白是艾滋病病毒顆粒表面一種特有糖蛋白，在病毒入侵中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。利用這一特點(diǎn)，研究人員設(shè)計(jì)了一種對(duì)gp120具有高度結(jié)合能力的多肽并標(biāo)記上熒光團(tuán)，繼而構(gòu)建出與氧化石墨烯復(fù)合的生物傳感器，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)抗gp120蛋白抗體的高靈敏檢測(cè)，為艾滋病診斷提供了新途徑和新方法。此外，運(yùn)用此類傳感器平臺(tái)也可實(shí)現(xiàn)對(duì)血清內(nèi)凝血酶，細(xì)胞內(nèi)半胱天冬酶，酪蛋白激酶等一系列多肽特異性識(shí)別蛋白的檢測(cè)。

基于核酸與氧化石墨烯復(fù)合材料的生物傳感器

脫氧核糖核酸是染色體的主要化學(xué)成分，四種堿基根據(jù)互補(bǔ)原則排列成一定的序列，從而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成?；趬A基互補(bǔ)配對(duì)原則，核酸的單鏈間結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，因此核酸單鏈可作為一種探頭。用以定向檢測(cè)可與其相互作用的生物靶標(biāo)（如蛋白酶）。由于雙鏈核酸和單鏈核酸與氧化石墨烯具有不同的結(jié)合能力，單鏈核酸可強(qiáng)有力地吸附于氧化石墨烯表面，而雙鏈核酸由于其結(jié)構(gòu)特征與氧化石墨烯的結(jié)合力相對(duì)較弱。基于這一特性，科學(xué)家發(fā)展了一系列基于核酸與氧化石墨烯復(fù)合的熒光生物傳感器。

重癥急性呼吸綜合征（SARS）是一種由SARS冠狀病毒（SCV）引起的急性呼吸道傳染病，曾在世界范圍內(nèi)引起恐慌并嚴(yán)重威脅人類生命健康。尋找能夠抑制SARS冠狀病毒活力的藥物是治愈疾病的關(guān)鍵策略。SCV解旋酶可以水解冠狀病毒的相關(guān)基因，被認(rèn)為是抗SCV病毒藥物的潛在重要靶標(biāo)。研究人員發(fā)展了基于核酸與氧化石墨烯復(fù)合的SCV生物傳感器，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)于這種解旋酶的熒光定量分析。相比傳統(tǒng)檢測(cè)手段，該平臺(tái)可以根據(jù)熒光變化對(duì)酶活性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且更為經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定。

內(nèi)切酶是一類核酸水解酶。除參與核糖核酸轉(zhuǎn)錄后剪切、修飾和降解等過程外，還與人體的免疫、腫瘤發(fā)展及病毒復(fù)制等事件有關(guān)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可以通過對(duì)DNA鏈上的甲基轉(zhuǎn)移來對(duì)核酸進(jìn)行修飾，在細(xì)胞的生理學(xué)與病理學(xué)過程中扮演著重要的角色。因此對(duì)這兩種酶的活性分析可指導(dǎo)疾病的臨床診斷和新藥物發(fā)現(xiàn)。利用核酸氧化石墨烯復(fù)合材料熒光傳感器，研究人員實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性的協(xié)同分析（即一種傳感器同時(shí)檢測(cè)兩種酶的活性），為相關(guān)領(lǐng)域提供了快速、便捷的新技術(shù)。利用此類平臺(tái)，還可以對(duì)核酸外切酶、脫氧核糖核苷酶以及核酸酶等一系列可識(shí)別核酸的蛋白酶檢測(cè)，拓展了對(duì)丙肝病毒的檢測(cè)。

基于糖類與氧化石墨烯復(fù)合材料的生物傳感器

糖類最初被認(rèn)為是生命體內(nèi)的儲(chǔ)能分子，然而隨著學(xué)科的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面所覆蓋的寡糖類物質(zhì)可通過參與細(xì)胞間的糖一蛋白質(zhì)識(shí)別作用而駕馭細(xì)胞的命運(yùn)。這些識(shí)別在一系列生理和病理學(xué)過程中扮演著廣泛而重要的角色，調(diào)控著如細(xì)胞黏附，病原體感染，植物與病原菌相互作用，細(xì)胞凋亡，受精，癌細(xì)胞異常增生、轉(zhuǎn)移，免疫反應(yīng)及細(xì)菌感染和病毒入侵等生物學(xué)過程。自然界中凡能與糖類特異性結(jié)合的非酶類和抗體類蛋白均可稱為凝集素。近年來植物凝集素作為自然界中存在的一種糖識(shí)別蛋白，被廣泛用作模型來研究糖與蛋白質(zhì)的識(shí)別作用。

研究人員初步研究出熒光標(biāo)記的糖類與氧化石墨烯的復(fù)合材料，實(shí)現(xiàn)了對(duì)選擇性凝集素的熒光傳感，可區(qū)分不具備選擇性的一系列蛋白質(zhì)。隨后進(jìn)一步發(fā)展出基于甘露糖（一種單糖）的氧化石墨烯復(fù)合傳感器，通過簡(jiǎn)單易操作的熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)，其傳感原理取決于大腸桿菌表面所含甘露糖凝集素與復(fù)合材料上甘露糖探頭的選擇性識(shí)別，為細(xì)菌的熒光檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。筆者在上述基礎(chǔ)上發(fā)展了乙酰氨基半乳糖（另一種單糖）作為探頭、羅丹明染料作為熒光團(tuán)的氧化石墨烯復(fù)合材料傳感器，可對(duì)一種含有乙酰氨基半乳糖凝集素的肝癌細(xì)胞進(jìn)行專一的熒光檢測(cè)，為癌細(xì)胞熒光檢測(cè)提供了經(jīng)濟(jì)、快速的平臺(tái)。

展望

基于氧化石墨烯良好的水溶性、高生物相容度與廣泛的熒光猝滅能力等特質(zhì)，氧化石墨烯復(fù)合材料熒光生物傳感器的構(gòu)建近年來得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，并被成功應(yīng)用于一系列疾病蛋白、病原體及癌細(xì)胞的檢測(cè)。同時(shí)，基于石墨烯的電化學(xué)傳感器構(gòu)建也在學(xué)術(shù)界引起極大的興趣㈣。這些傳感體系為疾病的診斷提供了新的經(jīng)濟(jì)型技術(shù)平臺(tái)。然而，這類生物傳感技術(shù)在理論與實(shí)踐層面仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

首先，氧化石墨烯可強(qiáng)有力地吸附各種化合物，但也造成一部分與傳感無關(guān)的物質(zhì)的非特異性吸附，降低了傳感的靈敏度與選擇性。因此在傳感器構(gòu)建中氧化石墨烯復(fù)合材料的穩(wěn)固性及特異性的提升是一個(gè)挑戰(zhàn)。其次，氧化石墨烯的制備工藝有待更進(jìn)一步優(yōu)化。目前所制備的氧化石墨烯結(jié)構(gòu)不均一化現(xiàn)象較為嚴(yán)重，造成傳感器潛在的標(biāo)準(zhǔn)化問題（批次與批次間的傳感效果或存在差異），這一問題關(guān)系到此類材料的市場(chǎng)化前景。第三，氧化石墨烯的尺寸、形貌與結(jié)構(gòu)（如含氧量）的改變是否會(huì)導(dǎo)致其傳感活性改變，這一問題一直被學(xué)術(shù)界所忽略，而它的突破將有利于更好地制備出更精確完美的石墨烯復(fù)合材料。最后，無論應(yīng)用于體外診斷還是體內(nèi)靶向治療，氧化石墨烯復(fù)合材料對(duì)人體的毒副作用應(yīng)得到系統(tǒng)性的評(píng)價(jià)。

上述若干問題意味著基于氧化石墨烯的復(fù)合熒光傳感器距離市場(chǎng)化應(yīng)用還有不少差距，但不可否認(rèn)氧化石墨烯已給包括化學(xué)、材料科學(xué)、生物學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)在內(nèi)的多學(xué)科交叉領(lǐng)域帶來了前所未有的機(jī)遇。期待第一例基于氧化石墨烯的經(jīng)濟(jì)型生物傳感器早日問世。