基因工程雞α—干擾素純化制品在雞體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律

趙風(fēng)立 劉光曉 姜德仟 楊靜 王俊超 于靜靜 林娜

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.79+7 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）05-0043-03

干擾素（interferon，IFN）是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。干擾素是在特定的誘導(dǎo)劑作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白，當(dāng)它再作用于其他細(xì)胞時(shí)，使其它細(xì)胞立即獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面的免疫力[2]。α-干擾素是單核細(xì)胞產(chǎn)生的相對(duì)分子量18000的多肽，因其蛋白質(zhì)分子的變異及肽鏈23位和34位氨基酸序列的組分不同，又可分為α2a、α2b、α2c等[3]。干擾素的活力具有相對(duì)的種屬特異性，α-干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對(duì)DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用[4]。

在干擾素研究中，不論在理論和實(shí)踐上均有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步探討。而當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)基因工程重組干擾素在動(dòng)物體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律尚未見(jiàn)報(bào)道，因此我們開(kāi)展了基因工程雞α-干擾素純化制品在雞體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，注射1倍劑量的雞α-干擾素后8h后達(dá)到峰值;2、4、6、8和12h肉仔雞內(nèi)源性α-干擾素含量顯著高于注射前、注射后0.5、1、48、96h和168h內(nèi)源性α-干擾素含量（P<0.05）。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗(yàn)動(dòng)物 ?20只32日齡健康A(chǔ)A肉仔雞，購(gòu)自萊陽(yáng)春雪集團(tuán)。

1.1.2 ?藥品與試劑 ?雞α-干擾素注射液由青島匯豐動(dòng)物保健品有限公司提供（40MU/瓶×4ml）;雞α-干擾素檢測(cè)試劑盒由BPB Biomedicals，Inc提供，批號(hào)70621S。Penta-His HRP Conjugate Kit、Tetra-His HRP Conjugate Kit由QIAGEN公司提供。

1.1.3 ?儀器設(shè)備 ?臺(tái)式高速離心機(jī)（U.S.A）、水浴恒溫?fù)u床（U.S.A）、ZW-A微量振蕩器（江蘇億通）、ELX800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（U.S.A.）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗(yàn)動(dòng)物處理 ?選擇20只32日齡健康A(chǔ)A肉仔雞，肌肉注射1個(gè)劑量雞α-干擾素，試驗(yàn)期為7d。

分別在肌肉注射雞α-干擾素注射液前、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、96、168h時(shí)每次隨機(jī)取4只受試雞，心臟采血分離血清，用BPB Biomedicals，Inc生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定內(nèi)源性雞α-干擾素，用Penta-His HRP Conjugate Kit測(cè)定外源性基因雞α-干擾素。

1.2.2 ?雞內(nèi)源性α-干擾素含量的測(cè)定 ?試驗(yàn)步驟：①取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中;②分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加入100μl樣品于空白微孔中;③在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入50μl的酶標(biāo)記溶液;④18～25℃孵育反應(yīng)90min;⑤洗滌液洗5次，每孔250μl，每次靜置10～20s;⑥每孔加入底物A、B液各50μl;⑦18～25℃下避光孵育反應(yīng)15min;⑧每孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)。

由標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線后求出方程，把樣品OD450nm值代入方程求值。

1.2.3 ?基因工程雞α-干擾素含量的測(cè)定 ?試驗(yàn)步驟：①取出酶標(biāo)板，將被測(cè)血清和對(duì)照樣品用pH10.6的碳酸鹽緩沖液依次倍比稀釋后依照次序分別加入相應(yīng)的孔中，200μl/孔，4℃包被過(guò)夜;②PBS（pH7.2）洗4次，每孔200μl，每次10～60s;③在每樣品孔中加入250μl Blocking buffer;④室溫（20～25℃）置搖床2h;⑤PBS（pH7.2）洗4次，每孔200μl，每次10～60s;⑥每孔加入PBS/BSA稀釋的Penta-His HRP各200μl;⑦室溫（20～25℃）孵育2h;⑧PBS（pH7.2）洗4次，每孔200μl，每次10～60s;⑨每孔加入200μl底物溶液，在室溫（20～25℃）下避光孵育反應(yīng)15min;⑩測(cè)定OD值：反應(yīng)結(jié)束后每孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)后在492nm波長(zhǎng)測(cè)定各反應(yīng)孔的OD值，記錄結(jié)果。

2 ?結(jié)果

2.1 ?注射雞α-干擾素對(duì)肉仔雞內(nèi)源性α-干擾素含量的影響 ?結(jié)果顯示，注射1倍劑量的雞α-干擾素8h后達(dá)到峰值;2、4、6、8h和12h肉仔雞內(nèi)源性α-干擾素含量顯著高于注射前，以及注射后0.5、1、48、96h和168h內(nèi)源性α-干擾素含量（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 ?基因工程雞α-干擾素含量的測(cè)定

2.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 ?將基因工程雞α-干擾素做不同濃度的稀釋?zhuān)凑?.2.3中描述的方法測(cè)定不同干擾素濃度下對(duì)應(yīng)的OD值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)（x），以干擾素濃度（y）為縱坐標(biāo)回歸，建立回歸方程為y=5525.9x2-513.28x+15.106，r2=0.9911，如圖1所示?？梢钥闯龈蓴_素濃度在0.05-0.15時(shí)，基本呈線性關(guān)系。

2.2.2 ?基因工程雞α-干擾素的藥時(shí)曲線 ?給雞肌肉注射基因工程雞α-干擾素后血藥濃度如圖2所示。可以看出在2h血藥濃度達(dá)到峰值，之后逐漸減低，在24h降為零。

2.2.3 ?基因工程雞α-干擾素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) ?基因工程雞α-干擾素藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)中國(guó)藥理學(xué)會(huì)推薦的3p97軟件處理，分別用單室、雙室、三室模型按最好二乘法進(jìn)行擬合后，基因工程雞α-干擾素雞體內(nèi)的代謝過(guò)符合一室開(kāi)放模型，權(quán)重為1/C2。

基因工程雞α-干擾素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表2所示。

3 ?討論

本試驗(yàn)中由于沒(méi)有合適的試驗(yàn)盒來(lái)區(qū)分內(nèi)源性的天然雞IFN-α和外源性的重組雞IFN-α，因此我們采用了分別檢測(cè)內(nèi)源性的天然雞IFN-α和外源性的重組雞IFN-α來(lái)進(jìn)行對(duì)比，在研究外源性的重組雞IFN-α對(duì)內(nèi)源性的天然雞IFN-α的影響的同時(shí)探討外源性的重組雞IFN-α在體內(nèi)的代謝規(guī)律。此次試驗(yàn)表明，血清中的內(nèi)源性的雞IFN-α在im（肌肉注射）注射重組雞IFN-α后也發(fā)生變化，表現(xiàn)在im注射重組雞IFN-α后8h達(dá)到峰值，在12h時(shí)可檢測(cè)的干擾素濃度開(kāi)始緩慢降低，約在4d后降低到使用前水平;而對(duì)血清中外源性重組雞IFN-α使用表達(dá)標(biāo)簽6-His tag的抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明外源性重組雞IFN-α在im注射后約1～2h時(shí)達(dá)到較高的濃度，之后血清中的濃度逐漸降低，在注射后8h后血清水平降低至檢測(cè)限度以下（Penta-His HRP Conjugate Kit檢測(cè)范圍≥10pg），因此根據(jù)OD值計(jì)算的外源性重組雞IFN-α可能會(huì)存在較大的誤差，需要建立更敏感的檢測(cè)方法來(lái)對(duì)外源性重組雞IFN-α的消長(zhǎng)規(guī)律，并在高峰期縮小采血間隔以獲得標(biāo)準(zhǔn)的藥代曲線。

參考文獻(xiàn)：

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[5] ?楊漢春.獸醫(yī)免疫學(xué)[M].第3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003，11.