紅豆杉針葉中黃酮類化合物的提取與鑒定

湯曉 朱建華 童燕

摘 要： 利用超聲輔助技術(shù)提取紅豆杉針葉中的黃酮類化合物，并利用HPLC法進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，液料比為15∶1，提取時(shí)間為45 min時(shí)，總黃酮的提取率最高；紅豆杉針葉中的黃酮類化合物以苷類為主，尤其是槲皮素苷類。

關(guān)鍵詞： 紅豆杉； 針葉； 黃酮類化合物； 超聲輔助提??； HPLC

中圖分類號(hào)： R 284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1671-2153（2015）06-0102-03

0 引 言

紅豆杉是世界公認(rèn)的天然珍稀抗癌植物，它的根、皮、枝、葉等部位中含有紫杉醇、紫杉烷類等化合物，具有良好的抗癌效果[1]，亦含有二萜類、黃酮類、揮發(fā)油等其他組分[2]。

紫杉醇等成分多存在于根皮中，但由于紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，因此，如果只開(kāi)發(fā)利用根皮易造成紅豆杉資源匱乏。與根皮相比，針葉中的有效成分也較多，且可以不斷生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)植物的循環(huán)利用。研究表明，黃酮類化合物具有多種生理活性[3]，而它們往往富集于葉片中，可幫助植物免受紫外線損害[4]，因此，如能從黃酮類的角度開(kāi)發(fā)利用紅豆杉針葉資源，則能達(dá)到保護(hù)與開(kāi)發(fā)該植物的雙重作用。本研究旨在提取紅豆杉針葉中的黃酮類化合物，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，以期更好地開(kāi)發(fā)利用紅豆杉針葉資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

紅豆杉取自寧波慈城妙山，采摘后的紅豆杉針葉，經(jīng)干燥后，粉碎處理（80目篩）。

1.2 儀器與試劑

752N型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，超聲清洗器，數(shù)顯恒溫水浴鍋，LC-20AT高效液相色譜儀。

蘆丁、槲皮素-3-O-β-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷、槲皮素、金絲桃苷、芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純（純度>98%），乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮的超聲提取工藝優(yōu)化

稱取干燥后的紅豆杉針葉粉末10 g，分別加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇和一定液料比（體積質(zhì)量比）的水溶液冷浸30 min，再利用超聲輔助提取一定時(shí)間，提取溫度為40℃，提取兩次，合并提取液。依次優(yōu)化乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比及超聲提取時(shí)間。

1.3.2 總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為510nm，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

1.3.3 總黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定

最佳超聲輔助提取工藝下的總黃酮提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃蒸發(fā)濃縮至干后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)[6]。

色譜柱為C18（150 mm×6.0 mm， 5 μm）；流速為1.0 mL/min；波長(zhǎng)為360 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。流動(dòng)相A為水/乙腈/甲酸（87/3/10），流動(dòng)相B為乙腈；進(jìn)樣量20 μL。

采用梯度洗脫：0～45 min，3%～25%B相；46 min，30%B相；47 min，3%B相。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)

乙醇體積分?jǐn)?shù)的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，當(dāng)用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇水溶液超聲提取紅豆杉針葉中的總黃酮時(shí)，總黃酮的提取率最高。這表明，紅豆杉針葉中的黃酮類化合物可能為中等極性。

2.2 總黃酮提取的最佳乙醇液料比

液料比的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示（此時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%）。

由圖2可以看出，當(dāng)液料比為15∶1時(shí)，紅豆杉針葉中的總黃酮提取率最高。這表明，此時(shí)紅豆杉細(xì)胞內(nèi)外的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)可能已達(dá)到平衡，因此，繼續(xù)增加液料比時(shí)，總黃酮提取率不再增加。

2.3 總黃酮提取的最佳提取時(shí)間

超聲提取時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示（此時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，液料比為15∶1）。

由圖3可以看出，當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)，紅豆杉針葉中的總黃酮提取率最高。這表明，此時(shí)紅豆杉細(xì)胞內(nèi)外的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)可能已達(dá)到平衡，因此，繼續(xù)增加提取時(shí)間，黃酮類化合物不再被浸出。

2.4 紅豆杉針葉中黃酮類化合物的鑒定結(jié)果

利用體積分?jǐn)?shù)為65%乙醇水溶液再次超聲輔助提取紅豆杉針葉中的總黃酮，液料比為15∶1，提取時(shí)間為45 min。提取液中的黃酮類化合物HPLC定性定量分析結(jié)果分別如圖4及表1所示。

HPLC鑒定結(jié)果顯示，紅豆杉針葉中含有8種黃酮類化合物，其中以苷類為主（6種），尤其是槲皮素苷類（4種），而質(zhì)量濃度最高的為山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷。紅豆杉針葉中測(cè)得的游離黃酮類化合物僅有槲皮素與芹菜素，且質(zhì)量濃度較低。

3 結(jié)果與討論

超聲輔助提取作為一種現(xiàn)代技術(shù)，具有縮短提取時(shí)間、節(jié)約能源、節(jié)省溶劑用量、避免高溫破壞提取物結(jié)構(gòu)等多種優(yōu)點(diǎn)，超聲波輻射所產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化應(yīng)效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)可顯著提高有效成分的提取率[7]。有學(xué)者利用超聲波技術(shù)提取了紅豆杉枝葉中的總黃酮，并進(jìn)行了工藝優(yōu)化[8]。但是，由于紅豆杉品種的差異，以及枝葉與針葉中黃酮類化合物的種類差異等因素，本研究的超聲提取最佳工藝條件并不同于他人的研究。此外，由于本研究的目的著重在于分析紅豆杉針葉中所存在的黃酮類化合物種類及其含量，以期為后期開(kāi)發(fā)利用該植物奠定基礎(chǔ)，因此，并未對(duì)提取工藝做進(jìn)一步的探討（提取方法及工藝參數(shù)的深入優(yōu)化）。

紅豆杉針葉中的黃酮類化合物以苷類（尤其是槲皮素苷類）為主，這表明，如同其他植物[4]，紅豆杉針葉亦需要槲皮素苷類等有效成分幫助其抵抗紫外線輻射等外界氧化因素。但是，紅豆杉針葉中的游離黃酮類化合物并不多，推測(cè)針葉中的黃酮類化合物在其生物代謝途徑中，游離的黃酮類可能結(jié)合了植物中的糖類，代謝成苷類，以便更好地發(fā)揮此類有效成分的抗氧化作用。

紅豆杉針葉中含有多種黃酮苷類，開(kāi)發(fā)利用針葉資源可起到保護(hù)紅豆杉資源的作用。利用超聲輔助提取法可有效提取紅豆杉針葉中的黃酮類化合物，提取工藝條件的優(yōu)化值得進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)：

[1] 衛(wèi)強(qiáng)，張國(guó)升，劉金旗，等. 紅豆杉枝葉中化學(xué)成分及含量研究進(jìn)展[J]. 廣州化工，2014，42（6）：17-23.

[2] 曾慧英，謝建春，盧立晃，等. 南方紅豆杉葉揮發(fā)性成分[J]. 精細(xì)化工，2011，28（11）：1112-1116.

[3] CONFORTI F，SOSA S，MARRELLI M，et al. The protective ability of mediterranean dietary plants against the oxidative damage：the role of radical oxygen species in inflammation and the polyphenol，flavonoid and sterol contents[J]. Food Chemistry，2009，112（3）：587-594.

[4] 湯曉，邱從平，賈娟，等. 加拿大一枝黃花黃酮成分的動(dòng)態(tài)分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（5）：961-966.

[5] 黃澤元，王海濱，劉志偉. 芝麻葉中總黃酮的最佳提取工藝研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2004，20（6）：201-204.

[6] 湯曉，倪翠陽(yáng)，王麗英，等. 煮制時(shí)間與二次煮制對(duì)紫娟普洱茶抗氧化性的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（8）：141-147.

[7] 張貴明，王繼文，王文澤，等. 朝鮮產(chǎn)東北紅豆杉樹(shù)皮中多糖提取工藝的比較研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，2008，10（6）：32-34.

[8] 衛(wèi)強(qiáng)，張國(guó)升，劉金旗，等. 皖南地區(qū)紅豆杉枝葉中總黃酮的超聲波提取工藝研究[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（11）：886-889.

Abstract： The flavonoids in needles of Taxus Mairei were extracted by ultrasonic assisted technology. HPLC was used for qualitative and quantitative analysis of these flavonoids. The results showed that when 65% ethanol was used for 45 min of extraction under 15：1 of liquid-solid ratio， the total flavonoids extraction rate was the highest. The major flavonoids in needles of Taxus Mairei were glycosides， especially quercetin glycosides.

Key words： Taxus Mairei； needles； flavonoids； ultrasonic assisted extraction； HPLC

（責(zé)任編輯：徐興華）