番鴨呼腸孤病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋 梅建國(guó) 王金良 姚春陽(yáng) 王玉茂

摘 ?要：番鴨呼腸孤病毒病是危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種重要傳染病。本文概述了番鴨呼腸孤病毒（MDRV）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。在細(xì)胞生物學(xué)方面，主要依靠病毒分離培養(yǎng)、ELISA法、血清中和試驗(yàn)等病毒特異性抗原及其抗體的檢測(cè)等。在分子生物學(xué)方面，主要依靠國(guó)內(nèi)外相繼建立起的RT-PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)、LAMP技術(shù)和核酸雜交技術(shù)等。介紹和比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)用性，為臨床科技工作者建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測(cè)方法提供參考。

關(guān)鍵詞：番鴨;呼腸孤病毒;檢測(cè);研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S858.324.4+3 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）06-0050-06

番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）病俗稱“肝白點(diǎn)病”、“花肝病”，是由番鴨呼腸孤病毒引起的番鴨的一種以軟腳、肝脾灰白色壞死點(diǎn)為特征的急性病毒性傳染病。禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）和MDRV均是呼腸孤病毒科正呼腸病毒屬的成員。正呼腸孤病毒屬包括哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒和禽呼腸孤病毒。根據(jù)最新國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)第七次分類報(bào)告（2000）：哺乳類呼腸孤病毒（MRV）為I亞群，禽類呼腸孤病毒為II亞群，納爾遜海灣病毒（NBV）和沸沸呼腸孤病毒（BRV）為III亞群。雞感染ARV的臨床癥狀表現(xiàn)為病毒性關(guān)節(jié)炎。MDRV主要危害10～40日齡的雛番鴨以及雛半番鴨，發(fā)病率和死亡率較高，日齡愈小病死率愈高，發(fā)病鴨耐過(guò)后生長(zhǎng)發(fā)育受阻或成為僵鴨。該病主要影響番鴨的育雛及存活率，流行勢(shì)態(tài)日趨嚴(yán)重，感染宿主范圍不斷擴(kuò)大且有呈多致病型發(fā)生的態(tài)勢(shì)，是危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文就近年來(lái)MDRV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述，以期為病毒的進(jìn)一步深入研究和疾病的有效防控提供參考。

1 ?病毒分離與鑒定

MDRV可以在禽胚卵黃囊、尿囊腔和絨毛尿囊膜中復(fù)制增殖。初次分離MDRV通常選用卵黃囊途徑接種禽胚，一般可在接種后3～5d致死胚，表現(xiàn)為胚胎蜷縮，胚體全身皮下出血，呈紫紅色;肝、脾有時(shí)可見腫大和壞死;死亡胚尿囊液清亮等。MDRV也可以在多種禽胚原代細(xì)胞（肝、肺、腎和成纖維細(xì)胞等）培養(yǎng)物中增殖，其中最常用的是番鴨胚成纖維細(xì)胞（MDEF）和雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）。不同分離株的MDRV感染MDEF或CEF產(chǎn)生的病變有所差異：Malkinson等（1981）[1]證明MDRV能在MDEF上增殖，其細(xì)胞病變（CPE）為細(xì)胞融合和崩解;陳志勝等[2]（2005）、陳仕龍等[3]（2013）證明MDRV感染MDEF后細(xì)胞融合形成體積巨大含多個(gè)細(xì)胞核的合胞體，細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生嗜酸性或嗜堿性包涵體;吳寶成等[4]（2001）證明其分離毒在MDEF和CEF上繁殖的CPE為細(xì)胞融合和崩解;胡奇林等[5]（2004）證明MDRV能在MDEF和CEF上繁殖，CPE為細(xì)胞圓縮和崩解，無(wú)細(xì)胞融合現(xiàn)象。MDRV病毒具有較廣的細(xì)胞親嗜性，能在雞胚成纖維細(xì)胞的傳代細(xì)胞系（DF1）、非洲綠猴腎細(xì)胞（vero）、恒河猴腎細(xì)胞（Marc145）、犬腎細(xì)胞（MDCK）、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、豬睪丸細(xì)胞（ST）、人胚腎細(xì)胞（AD293）等多種傳代系細(xì)胞中增殖并產(chǎn)生CPE。待病毒增殖后可通過(guò)電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)以及分析理化特性進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。病毒分離與鑒定雖然十分準(zhǔn)確可靠，但是存在整個(gè)操作過(guò)程比較復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，而且常常出現(xiàn)病毒分離不成功或CPE長(zhǎng)時(shí)間不出現(xiàn)的情況。

2 ?血清學(xué)方法

2.1 ?瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP） ?AGP操作簡(jiǎn)單、快捷、便于推廣，可用于檢測(cè)MDRV的群特異性抗體，易于與其他病毒區(qū)分。該方法還可以用于病毒感染史的檢測(cè)、分離株的鑒定以及血清學(xué)的監(jiān)測(cè)等。王錫壟等[6]（1985）率先建立了AGP試驗(yàn)用于檢測(cè)ARV抗原。隨后，朱萬(wàn)光等[7]（1996）利用vero細(xì)胞、原代CEF細(xì)胞制備ARV的AGP抗原，建立了雞病毒性關(guān)節(jié)AGP試驗(yàn)，用于雞感染ARV的普查。陳士友等[8]（1991）、單松華等（1993）[9]先后建立了檢測(cè)ARV抗體的AGP方法。AGP可以用于MDRV抗體的流行病學(xué)調(diào)查，但是該方法敏感性不高，不適用于檢測(cè)低滴度的抗體。

2.2 ?血清中和試驗(yàn)（SN） ?血清中和試驗(yàn)主要用于對(duì)MDRV進(jìn)行血清型的鑒定，是經(jīng)典的血清學(xué)檢測(cè)方法。Kawamura[10]（1965）通過(guò)對(duì)其分離到的77株ARV進(jìn)行SN試驗(yàn)并將這些毒株分為5個(gè)血清型。Wood等[11]（1980）認(rèn)為ARV至少存在13個(gè)血清型。Robertson等[12]（1986）應(yīng)用交叉中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各型間存在大量的交叉反應(yīng)，因此有些只能作為亞型而不能作為獨(dú)立的血清型。SN試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，但程序復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，不能用于快速診斷及大批血清樣品的檢測(cè)。

2.3 ?免疫熒光試驗(yàn)（IF） ?免疫熒光試驗(yàn)分為直接免疫熒光試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA），前者適用于感染組織中抗原的檢測(cè)，后者可以用于抗原和抗體的檢測(cè)。該方法與AGP相比更敏感，同時(shí)可用于病毒和ARV群特異性抗體的定量分析。肖成蕊等[13]（1990）制備了ARV熒光抗體，建立了檢測(cè)ARV抗原的直接免疫熒光試驗(yàn)方法，對(duì)人工感染雞和自然發(fā)病雞的主要臟器進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟和脾臟的檢出率可達(dá)100%，而心臟和腎臟等的檢出率為40%左右，說(shuō)明該方法可以用于臨床樣品的檢測(cè)，并且肝臟和脾臟是檢測(cè)ARV的首選器官。王瑩[14]（2010）、謝志勤等[15]（2012）也先后建立了檢測(cè)ARV抗原的直接免疫熒光試驗(yàn)方法，表明該方法具有很好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。高春亮等[16]（2012）制備了具有免疫熒光特性的抗MDRV單克隆抗體，建立了檢測(cè)MDRV抗原的間接免疫熒光（Mab-IFA）方法，表明該方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、檢測(cè)只需要2h，可用于MDRV感染的快速檢測(cè)，為臨床MDRV的快速診斷奠定了基礎(chǔ)。

2.4 ?酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） ?ELISA是目前應(yīng)用最為廣泛的一種免疫學(xué)監(jiān)測(cè)方法。國(guó)內(nèi)外已建立了檢測(cè)MDRV抗原或抗體的多種ELISA方法，從而使大量樣品的篩檢更加快速化和自動(dòng)化。Slaght等[17]（1979）最先建立了檢測(cè)ARV抗體的ELISA方法。朱萬(wàn)光等[18]（1998）將ARV感染CEF和vero細(xì)胞后制備了ARV抗原，并建立了檢測(cè)ARV抗體的間接ELISA方法。Liu等[19]（2000）用σC和σA的單克隆抗體E9和H3，建立了Dot-ELISA方法，可檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物和鍵組織樣品中的ARV。Hung等[20]（2000）用純化的σB蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)ARV抗體的σB-ELISA檢測(cè)方法。該方法可以克服全病毒包板產(chǎn)生的非特異性，與SN相比，檢測(cè)靈敏度更高。Liu等[21]（2002）用原核表達(dá)的σC和σB蛋白作包被抗原，建立了檢測(cè)DRV抗體的σC-σB-ELISA檢測(cè)方法，與SN的符合率達(dá)到100%，可以減少傳統(tǒng)ELISA的非特異性結(jié)合。耿宏偉等[22]（2006）以原核表達(dá)的MDRV重組σC蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)鴨血清中MDRV抗體的間接ELISA方法。用該方法對(duì)50份鴨血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，與AGP法相比，ELISA具有良好的特異性和敏感性，為MDRV抗體檢測(cè)試劑盒的研制和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。鄒光盛[23]（2007）、張?jiān)频萚24]（2008）、孫美玉[25]（2012）也先后建立了σC蛋白為抗原的檢測(cè)DRV抗體的間接ELISA方法，具有較高的臨床使用價(jià)值，可以用于DRV感染的流行病學(xué)調(diào)查以及群體DRV抗體水平的診斷和監(jiān)控。Yang等[26]（2010）通過(guò)在酵母中表達(dá)的σC和σB蛋白作為包被抗原，建立了用于檢測(cè)ARV抗體的ELISA方法。共建立了兩種試劑盒，分別為1071的σC蛋白和S1133的σB蛋白等量混合作為抗原以及S1133 σC-σB融合蛋白作為抗原，結(jié)果表明建立的ELISA方法比常規(guī)ELISA具有更高的陽(yáng)性率。Chen等[27]（2004）建立了非結(jié)構(gòu)蛋白σNS的單克隆抗體（MAb）捕獲ELISA方法用以檢測(cè)ARV抗體。該方法比常規(guī)ELISA的非特異性結(jié)合更低，免疫過(guò)滅活苗的呈陽(yáng)性，可用于ARV滅活苗的免疫狀況監(jiān)測(cè)。謝芝勛等[28]（2007）以非結(jié)構(gòu)蛋白P17建立了P17-ELISA檢測(cè)方法，可用于鑒別ARV滅活疫苗免疫和活病毒感染。Xie等[29]（2010）利用原核表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白σNS和P17建立了檢測(cè)抗體的ELISA方法，該方法可用于區(qū)分疫苗免疫的雞群和野毒感染的雞群。秦宇[30]（2005）、謝芝勛等[31]（2007）先后以表達(dá)的ARV σ3融合蛋白純化后作為抗原，建立了檢測(cè)ARV抗體的間接ELISA方法。秦春香等[32]（2009）建立了能檢測(cè)ARV抗體的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2兩個(gè)蛋白同時(shí)包被的σ3-σ2-ELISA檢測(cè)方法。分別用上述3種方法對(duì)制備的33份ARV SPF雞陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性檢出率分別為90.91%、69.70%和100%。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗體檢測(cè)方面具有較高的敏感性。謝志勤等[33]（2013）建立了檢測(cè)ARV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。孫陳莉[34]（2013）分別建立了檢測(cè)MDRV抗原和抗體的方法，包括兩個(gè)方面：一是以大腸桿菌表達(dá)的MDRV σB蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)MDRV抗體的間接ELISA方法;二是研制針對(duì)MDRV的單克隆抗體，建立了檢測(cè)MDRV抗原的雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）方法。焦玉蘭等[35]（2013）通過(guò)氯仿抽提卵黃抗體方法，經(jīng)ELISA法檢測(cè)雞卵黃和血清中ARV抗體的相關(guān)性試驗(yàn)，確定卵黃抗體和血清抗體的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并依此建立了ELISA試劑盒檢測(cè)卵黃抗體的檢測(cè)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)。雖然采用ELISA作為診斷手段具有快速、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)，但由于存在血清型之間交叉反應(yīng)性強(qiáng)弱的問(wèn)題，容易造成漏診或誤診。

2.5 ?乳膠凝集試驗(yàn)（LAT） ?LAT簡(jiǎn)便、快速、敏感，特異，既可以從攻毒或鴨的糞便中檢出MDRV抗原，又可以檢測(cè)血清中的抗體。王全溪[36]（2004）建立了檢測(cè)MDRV抗原的反向LAT方法，適合于獸醫(yī)基層臨床對(duì)MDRV的檢測(cè)。但是該方法需要特定的條件，而且與ARV雞源毒株發(fā)生凝集反應(yīng)，特異性不是很好。吳異健等[37]（2005）用純化的抗MDRV抗體致敏乳膠成功地建立了檢測(cè)MDRV的反向LAT方法。結(jié)果表明，MDRV抗體致敏的乳膠無(wú)自凝性，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，質(zhì)量可靠。檢測(cè)10份MDRV尿囊液與AGP方法進(jìn)行比較，二者的陽(yáng)性符合率為100%，這對(duì)臨床上診斷與防治MDRV感染具有重要的參考意義。韓典霖[38]（2007）利用原核表達(dá)、純化的MDRV-YB株的重組σC蛋白作為抗原致敏乳膠，建立了檢測(cè)MDRV抗體的LAT方法，該方法檢測(cè)抗體的敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好。

2.6 ?免疫組化技術(shù) ?免疫組化法是一種使用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織中的特異性抗原進(jìn)行定性和定位檢測(cè)的方法，其中酶標(biāo)法應(yīng)用最為廣泛應(yīng)用，具有敏感性高、特異性強(qiáng)且可以檢測(cè)組織中極微量的病原體等優(yōu)點(diǎn)。包漢勛等[39]（2009）利用純化的兔抗MDRV多克隆抗體，建立了檢測(cè)MDRV的間接酶免疫組化方法。應(yīng)用該法對(duì)雛番鴨人工感染MDRV，研究MDRV在番鴨體內(nèi)的分布規(guī)律，結(jié)果表明病毒對(duì)肝臟、脾臟、盲腸的組織嗜性最強(qiáng)，為該病毒的主要靶器官，這為闡明MDRV感染的發(fā)病機(jī)理提供了理論依據(jù)。王全溪等[40]（2009）通過(guò)對(duì)雛番鴨人工感染MDRV后，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，證實(shí)MDRV可以誘導(dǎo)免疫抑制。

3 ?分子生物學(xué)方法

3.1 ?RT-PCR技術(shù) ?RT-PCR技術(shù)快速、敏感、特異性強(qiáng)，已被廣泛應(yīng)用于MDRV的檢測(cè)。Lee等[40]（1998）通過(guò)對(duì)ARV的S3基因設(shè)計(jì)引物，建立了RT-PCR方法，最低可以檢測(cè)到0.2pg的RNA。謝芝勛等[41]（2001）根據(jù)S1133株Sl基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立了檢測(cè)ARV的半巢式RT-PCR，最低能檢測(cè)到1pg的病毒RNA。廖敏等[42]（2004）建立的一步法RT-PCR最低則能檢測(cè)到0.16ng的病毒RNA。胡奇林等[43]（2004）建立了檢測(cè)MDRV的RT-PCR方法，檢測(cè)靈敏度為1pg，但檢測(cè)的樣品須為細(xì)胞毒或尿囊液，不能檢組織病料，病毒培養(yǎng)需要時(shí)間長(zhǎng)，因此不適合作為臨床快速診斷的手段。Liu等[44]（2004）建立了一種RT-PCR結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）的方法，有助于鑒定禽群中是否存在變異株，或檢測(cè)特定株在禽群中的水平傳播情況。Bruhn等[45]（2005）根據(jù)ARV 52和54基因建立的RT-PCR方法，適用于檢測(cè)疫苗中污染的外源ARV。林鋒強(qiáng)等[46]（2007）建立了半套式RT-PCR方法檢測(cè)MDRV，敏感度達(dá)1pg，檢測(cè)人工感染MDRV的樣品和臨床疑似樣品與病毒分離相比較，二者的符合率為100%。王劭等[47]（2011）建立了RT-PCR方法檢測(cè)NDRV，敏度達(dá)2pg。李啟強(qiáng)[48]（2012）建立了檢測(cè)MDRV的套式RT-PCR方法，靈敏度可達(dá)0.1pg。周五朵等[49]（2014）根據(jù)MDRV YB株P(guān)10蛋白基因和YJL株P(guān)17蛋白基因分別設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，建立了可鑒別診斷2個(gè)毒株的雙重PCR方法，為臨床檢測(cè)ARV、MDRV提供借鑒，對(duì)生產(chǎn)具有很強(qiáng)的實(shí)用性。卿柯香等[50]（2014）根據(jù)S3基因設(shè)計(jì)引物，建立了能夠同時(shí)快速檢測(cè)MDRV和NDRV的雙重RT-PCR方法。

3.2 ?熒光定量RT-PCR技術(shù) ?熒光定量PCR與傳統(tǒng)的PCR相比，能有效減少試驗(yàn)中的污染，具有檢測(cè)快速、批量、靈敏度高、特異性強(qiáng)、可以定性和定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。Guan等[51]（2006）在RT-PCR的基礎(chǔ)上，建立了能定量研究ARV的Light Cycler熒光定量PCR方法，該方法的靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的1000倍以上，且不需要進(jìn)行巢式PCR的二次加樣，能很好地避免加樣造成的污染。童桂香等[52]（2007）應(yīng)用SYBR Green I染料法在ARV σC蛋白序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了熒光定量RT-PCR方法，該方法檢測(cè)病毒RNA的量可達(dá)到5.2×102個(gè)拷貝，具有較高的靈敏度，但是熒光染料能與非特異的雙鏈DNA結(jié)合，使試驗(yàn)產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。嚴(yán)進(jìn)等[53]（2009）根據(jù)MDRV的σNS基因序列設(shè)計(jì)引物及TaqMan探針，建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，可以檢測(cè)到1.0×102拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品，比普通PCR至少高100倍。該方法對(duì)MDRV人工感染番鴨肝臟組織檢出率達(dá)到100%。熊文婕等[54]（2010）建立了定量檢測(cè)ARV σC和σNS基因的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。孫美玉[55]（2012）建立了針對(duì)ARV σC基因TaqMan熒光定量RT-PCR方法。Guo等[56]（2011）建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法可檢測(cè)到5個(gè)拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品，靈敏度約為常規(guī)RT-PCR的150倍，相比Light Cycler熒光定量PCR方法，既能滿足檢測(cè)的要求，也能進(jìn)行病毒的定量分析。楊旭[57]（2011）建立了檢測(cè)MDRV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法，對(duì)收集的80份人工感染樣品和10份臨床樣品分別用常規(guī)RT-PCR和建立的熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，人工感染樣品中，熒光定量RT-PCR檢出率（52.5%）高于常規(guī)RT-PCR（45%）;臨床樣品中，熒光定量RT-PCR檢出率（60%）也高于常規(guī)RT-PCR（30%）。表明其所建立的熒光定量RT-PCR比RT-PCR敏感性高，可以為MDRV感染提供快速而準(zhǔn)確的診斷方法。袁遠(yuǎn)華等[58]（2013）建立了針對(duì)新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）S3基因的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法，可以實(shí)時(shí)定量分析病毒核酸在動(dòng)物體內(nèi)的含量，從而明確NDRV感染程度，并能夠?yàn)镹DRV的早期檢測(cè)提供重要參考。

3.3 ?環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) ?環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）在靈敏度、特異性、擴(kuò)增時(shí)間、檢測(cè)范圍上都優(yōu)于常規(guī)PCR技術(shù)，而且不需要精密儀器，一般用恒溫水浴鍋就可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，檢測(cè)成本低于熒光定量PCR，該方法簡(jiǎn)便快捷，省時(shí)省力，是一種適用于基層實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確檢測(cè)MDRV的方法。董嘉文等[59]（2011）針對(duì)ARV S1基因設(shè)計(jì)1套LAMP引物，建立了檢測(cè)ARV的LAMP方法。馬利等[60]（2013）使用2種熒光顯色劑（SYBR Green Ⅰ和鈣黃綠素）建立了檢測(cè)ARV的LAMP方法。在對(duì)80份臨床樣本的檢測(cè)中，使用LAMP和PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣本的數(shù)量分別為68份和55份。認(rèn)為基于熒光顯色的LAMP方法可以應(yīng)用于ARV的快速檢測(cè)，具有在科研機(jī)構(gòu)、基層實(shí)驗(yàn)室特別是檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)推廣和應(yīng)用的潛力。

3.4 ?核酸探針技術(shù) ?核酸探針技術(shù)是在己獲得的病毒特異片段上標(biāo)記放射性同位素或生物素作為探針而建立的一種分子雜交方法，是定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA序列的有力工具，已被廣泛應(yīng)用于ARV的檢測(cè)上。Liu等[61]（1997）通過(guò)地高辛標(biāo)記建立的cDNA探針技術(shù)，可直接檢測(cè)組織切片及細(xì)胞中的微量RNA，最低檢測(cè)量為0.78ng。該方法不僅能定位感染組織中的ARV，還能在臨床癥狀出現(xiàn)前檢測(cè)到ARV，具有較高的靈敏性。Yin等[62]（1998）建立的以放射性32P標(biāo)記的核酸探針，最低檢測(cè)劑量達(dá)0.2ng，特異性較強(qiáng)，但該放射性探針具有使用不安全的缺點(diǎn)，很難推廣。謝芝勛等[63]（2001）也建立了地高辛標(biāo)記的cDNA探針技術(shù)，但其靈敏度較Liu建立的方法高，最低檢出量為0.45ng。造成這種差異的原因可能與探針的設(shè)計(jì)存在關(guān)系。王蕾等[64]（2007）用地高辛標(biāo)記ARV S1基因中編碼σC蛋白的基因片段作為核酸探針，在斑點(diǎn)分子雜交中可檢測(cè)到1.6pg的RNA。表明其建立的核酸探針檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)便，適于批量樣品的檢測(cè)。核酸探針技術(shù)敏感，但操作較繁瑣，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及其出入境動(dòng)物的檢疫。

4 ?小結(jié)

MDRV在我國(guó)番鴨群中普遍存在，常常與其他細(xì)菌或病毒的繼發(fā)感染或并發(fā)感染，引起常規(guī)疫苗的免疫效果不佳。MDRV和AIV對(duì)法氏囊均有一定程度的免疫抑制，共感染后引發(fā)更為嚴(yán)重的免疫抑制，對(duì)于防控禽流感將是更嚴(yán)峻的問(wèn)題。因此，做好番鴨呼腸孤病的防控將會(huì)對(duì)其他疾病起到積極的作用。另外，MDRV和NDRV在流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化等方面存在較大差異。MDRV易感動(dòng)物主要是雛番鴨，而NDRV的宿主范圍較廣，各品種鴨都易感。明確這兩種不同疾病型水禽呼腸孤病毒病的病原學(xué)特征，將為研究?jī)刹《疽鸬闹虏⌒圆町惖臋C(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為水禽呼腸孤病毒病的有效防控和實(shí)用疫苗的設(shè)計(jì)提供科學(xué)依據(jù)。黃瑜等[65]（2009）將我國(guó)感染MDRV相關(guān)的疾病歸結(jié)為4種，即鴨多臟器壞死癥、多臟器出血癥、肝壞死癥和脾壞死癥。導(dǎo)致這一結(jié)果的因素，很可能與病毒的毒力、基因型、血清型、抗原性、組織親嗜性或者致病性等有關(guān)。建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，開發(fā)有針對(duì)性的新型疫苗等防控產(chǎn)品，是控制該病頻發(fā)和暴發(fā)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，具有十分重要的意義。上述MDRV的血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，需要根據(jù)不同的場(chǎng)合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。雖然上述檢測(cè)方法為MDRV的檢測(cè)提供了有效的技術(shù)手段，但是隨著人們對(duì)MDRV深入研究，相信現(xiàn)有的檢測(cè)方法將不斷的得到改進(jìn)或者新的檢測(cè)方法將很快研制出來(lái)，以使其檢測(cè)技術(shù)更簡(jiǎn)便化、快速化和準(zhǔn)確化，這將對(duì)番鴨呼腸孤病毒病的有效防控產(chǎn)品及技術(shù)的研制奠定基礎(chǔ)。

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