鼠類膝骨關(guān)節(jié)炎模型評(píng)價(jià)方法現(xiàn)狀分析

周凱等

【摘 要】 膝骨關(guān)節(jié)炎為臨床常見(jiàn)疾病，目前對(duì)其病理生理變化、發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然不甚明了，而動(dòng)物膝骨關(guān)節(jié)炎模型是膝骨關(guān)節(jié)炎防治研究的重要手段。目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)動(dòng)物膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立的具體方法討論較多，但對(duì)采用何種動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍然缺乏統(tǒng)一的觀點(diǎn)，常采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為鼠和兔。文章就鼠類膝骨關(guān)節(jié)炎模型評(píng)價(jià)方法作一總結(jié)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；鼠類；模型；評(píng)價(jià)方法

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.07.018

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床常見(jiàn)的退行性關(guān)節(jié)疾病，隨著我國(guó)人口老齡化加劇，KOA發(fā)病率也隨之增高。目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)KOA的認(rèn)識(shí)尚未明了，直接在人類身體基礎(chǔ)上探究其病理生理變化、發(fā)病及防治機(jī)制具有極大的局限性，且與人類倫理沖突。因此，對(duì)KOA防治機(jī)制的探索在極大程度上依賴動(dòng)物模型。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇上，由于鼠類關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)與人類相近，且在罹患KOA時(shí)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及形態(tài)學(xué)方面與人類患者類似，符合相關(guān)性、適當(dāng)性、實(shí)用性原則，因而臨床上選用鼠類建立KOA模型較多[1-2]。鼠類KOA模型根據(jù)建模方法的不同可分為自發(fā)性模型及誘發(fā)性模型兩大類，前者是指實(shí)驗(yàn)鼠不接受任何有意識(shí)的人為干預(yù)，在自然情況下所發(fā)生的KOA，抑或是由于基因變異并通過(guò)遺傳育種技術(shù)，傳代保留下來(lái)的骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）動(dòng)物模型：STRPort小鼠和Hartley 豚鼠等；而誘發(fā)性模型是指通過(guò)各種人為操作誘導(dǎo)產(chǎn)生的OA動(dòng)物模型，包括Hulth法和半月板不穩(wěn)定術(shù)等。目前國(guó)內(nèi)外研究中對(duì)動(dòng)物KOA模型建立方法的探討較多[3]，具體建模方法已經(jīng)頗為成熟。然而，在相關(guān)論述中，討論評(píng)價(jià)動(dòng)物模型建立成功與否的方法卻顯得相對(duì)較少。能否恰當(dāng)?shù)剡x擇評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，往往可能左右整個(gè)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。本文對(duì)鼠類KOA模型評(píng)價(jià)方法作一綜述，以期為同道選擇運(yùn)用評(píng)價(jià)方法時(shí)提供參考。

1 活體觀察指標(biāo)評(píng)價(jià)

有研究者認(rèn)為，建模后可通過(guò)直接觀察活體實(shí)驗(yàn)鼠類膝關(guān)節(jié)局部狀況、步態(tài)改變及關(guān)節(jié)活動(dòng)的變化[4]或直接以游標(biāo)卡尺測(cè)量關(guān)節(jié)腫脹程度[5]，并與建模前的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，來(lái)判斷造模是否成功。如需對(duì)上述觀察指標(biāo)進(jìn)行量化，則可在記錄上述觀察指標(biāo)后，運(yùn)用Lequesne MG[6]進(jìn)行評(píng)分。在行為學(xué)指標(biāo)上可觀察實(shí)驗(yàn)鼠類在建模前后，活動(dòng)時(shí)步態(tài)及休息時(shí)體位有無(wú)變化，活動(dòng)有無(wú)增減，活動(dòng)靈活性是否降低以及進(jìn)食的時(shí)間，進(jìn)食總量是否受到影響，以判斷實(shí)驗(yàn)鼠類模型是否成功[7]。也有學(xué)者把鼠類膝關(guān)節(jié)外觀分級(jí)，協(xié)助判斷KOA模型的程度，如平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)（MAI）采用關(guān)節(jié)炎評(píng)分（0～4分共5級(jí)）：0分，無(wú)關(guān)節(jié)炎；1分，關(guān)節(jié)有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹；2分，關(guān)節(jié)中度紅腫；3分，關(guān)節(jié)重度紅腫；4分，關(guān)節(jié)嚴(yán)重紅腫且不能負(fù)重。每只實(shí)驗(yàn)鼠類的關(guān)節(jié)炎評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為四肢關(guān)節(jié)評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)之和[8]。通過(guò)活體觀察、行為學(xué)及外觀的觀察可在不對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠類造成損傷的情況下，對(duì)KOA模型成功與否進(jìn)行初步判斷，更符合客觀實(shí)際，可充分還原人類患病后診療過(guò)程。但此類指標(biāo)相對(duì)缺乏具體、客觀的標(biāo)準(zhǔn)，在KOA定性上尚可，但在KOA病理分期上相對(duì)較差，且由于鼠類個(gè)體較小，干擾因素較多，導(dǎo)致上述觀察指標(biāo)在鼠類模型上的采集有一定的難度。

2 病理學(xué)觀察指標(biāo)評(píng)價(jià)

2.1 大體觀察 大體觀察指標(biāo)可在處死實(shí)驗(yàn)鼠類后行病理取材，將所取標(biāo)本置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。主要觀察目標(biāo)包括：鼠類膝關(guān)節(jié)表面光滑度、透明度及色澤，關(guān)節(jié)表面有無(wú)新生物，關(guān)節(jié)軟骨表面是否有裂隙、軟化或潰瘍等，還應(yīng)觀察軟骨的缺損程度，軟骨下骨是否存在裸露情況[9]。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下（0～4分共5級(jí)）：0分，關(guān)節(jié)面光整，色澤如常；1分，關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2分，關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨淺中層；3分，關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達(dá)軟骨深層；4分，軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露[10]。還可在顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)的滑膜增生情況，軟骨磨損程度及周圍骨贅形成數(shù)目等內(nèi)容[11-12]，上述觀測(cè)指標(biāo)對(duì)KOA鼠類模型具有確切的指示作用，能具體觀察到實(shí)驗(yàn)鼠類KOA病變程度，且操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)室資源消耗較小。但此類評(píng)價(jià)方法均為離體觀察法，必須處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，有一定的局限性。

2.2 組織和細(xì)胞學(xué)觀察 組織和細(xì)胞學(xué)觀察法是在處死實(shí)驗(yàn)鼠類后，切取部分膝關(guān)節(jié)軟骨，將標(biāo)本制成切片后置于光鏡下觀察軟骨組織的層次、軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)、潮線等的變化，并進(jìn)行Mankin's評(píng)分[13]或改良Mankin's評(píng)分[14]以量化相關(guān)指標(biāo)。Mankin's評(píng)分從整體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、番紅染色、潮線完整性4個(gè)方面分不同等級(jí)進(jìn)行評(píng)分，最高14分，最低0分。0～1分為正常軟骨；2～6分為早期OA；7～10分為中期OA；11～14分為晚期OA。但Mankin's評(píng)分建立于晚期OA病理模型且缺乏分期系統(tǒng)，對(duì)早期或輕微的OA不甚適用。

針對(duì)Mankin's評(píng)分系統(tǒng)的缺陷，國(guó)際OA研究學(xué)會(huì)建立的OOCHAS法對(duì)軟骨組織病理學(xué)進(jìn)行分級(jí)評(píng)分[15-16]。OOCHAS法將KOA分為以下7級(jí)：0級(jí)，軟骨表面平整，軟骨完整；1級(jí)，軟骨表面淺層纖維形成，且不均勻；2級(jí)，軟骨表面不連續(xù)，伴有細(xì)胞增殖，在Ⅱ～Ⅲ層異染物質(zhì)增加或減少；3級(jí)，軟骨皸裂擴(kuò)散至Ⅲ層或出現(xiàn)侵蝕；4級(jí)，軟骨侵蝕加重，關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)損害；5級(jí)，關(guān)節(jié)軟骨剝脫；6級(jí)，關(guān)節(jié)變形。

Chambers評(píng)分[17]，切取關(guān)節(jié)取內(nèi)、外側(cè)股骨髁與內(nèi)、外側(cè)脛骨平臺(tái)4個(gè)部分各12張切片，經(jīng)番紅O-固綠染色后，將標(biāo)本置于光鏡下對(duì)其進(jìn)行觀察。Chambers評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)細(xì)則為：0分，正常軟骨；0.5分，軟骨正常，但軟骨染色減弱；1分，關(guān)節(jié)表面平整，有少量纖維覆蓋；2分，關(guān)節(jié)軟骨淺層纖維組織覆蓋，并且可見(jiàn)薄層軟骨剝脫；3分，軟骨層輕度磨損（< 20%全層軟骨）；5分，軟骨層中度磨損（20%～80%全層軟骨）；6分，軟骨層嚴(yán)重磨損（> 80%全層軟骨）。

上述觀察方法可對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KOA進(jìn)行量化，利于實(shí)驗(yàn)后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，有很強(qiáng)的可操作性，但是此類方法觀察指標(biāo)過(guò)于細(xì)化，在組內(nèi)以及組間差異經(jīng)過(guò)重復(fù)觀測(cè)后，可能導(dǎo)致差異相對(duì)較大，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏倚。

2.3 免疫組織化學(xué)、Western blot及PCR觀察 采用免疫組織化學(xué)、Western blot及PCR觀測(cè)軟骨中的目標(biāo)基因如MMP、ZIP及Caspase等在退行性變軟骨中的表達(dá)情況。觀測(cè)結(jié)果判定可通過(guò)計(jì)算每個(gè)觀察視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，目標(biāo)基因的表達(dá)量用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行量化[18]，具體標(biāo)準(zhǔn)為：0分，陰性；1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%；2分，10%<陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤50%；

3分，50%<陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分乘染色強(qiáng)度評(píng)分即為乘積分?jǐn)?shù)，將乘積分?jǐn)?shù)≤4分定為陰性，> 4分定為陽(yáng)性[19]?；蛘甙辞衅娜旧珡?qiáng)度評(píng)分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為

3分[19]。此類觀察方法針對(duì)性極強(qiáng)，在KOA相關(guān)機(jī)制研究中具有不可替代的作用，有望在KOA的發(fā)生、發(fā)展與治療的研究中帶來(lái)巨大契機(jī)；但其不是操作技術(shù)相對(duì)復(fù)雜且成本較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求也相對(duì)較高。

2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 超微結(jié)構(gòu)觀察是指在電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、大分子水平的變化，用以了解組織和細(xì)胞最細(xì)微的病變。Lippiello等[20]報(bào)道，通過(guò)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物食物中添加Omega-3脂肪酸，用以代替必需脂肪酸Omega-6會(huì)導(dǎo)致其軟骨纖維變性，軟骨超微結(jié)構(gòu)退化。此方法可深入認(rèn)識(shí)KOA的基本病變、病因和發(fā)病機(jī)制，但是目前在KOA動(dòng)物模型研究中運(yùn)用較少，經(jīng)驗(yàn)相對(duì)缺乏。

2.5 細(xì)胞化學(xué)觀察 將實(shí)驗(yàn)鼠類脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨組織制備成適宜厚度冰凍切片后，經(jīng)過(guò)一系列處理與干預(yù)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鋅離子、錳離子等的成像[21]。此類觀察方法針對(duì)性極強(qiáng)，可運(yùn)用于KOA相關(guān)機(jī)制研究中，但其缺點(diǎn)與免疫組織化學(xué)、Western blot及PCR觀察相似。

3 影像學(xué)觀察評(píng)價(jià)

核磁共振成像（magnetic resonance imaging，

MRI）檢查，將實(shí)驗(yàn)鼠類麻醉后固定雙膝，在核磁共振儀上進(jìn)行雙膝掃描檢查，在鼠類股骨髁負(fù)重處軟骨的3個(gè)不同地方進(jìn)行測(cè)量，取其平均值[22-24]。

此方法可以在不對(duì)動(dòng)物帶來(lái)?yè)p傷的情況下，對(duì)KOA動(dòng)物模型進(jìn)行早期、精確的判斷，尤其在關(guān)節(jié)軟骨病變上具有特殊優(yōu)勢(shì)，此外，本檢測(cè)方法還可對(duì)軟骨下骨、骨髓、半月板、滑膜炎及關(guān)節(jié)滲出及肌腱功能不全等進(jìn)行觀察[25]。

X線檢查，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠類雙膝關(guān)節(jié)行X線檢查膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙是否均勻一致，股骨髁、脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)面輪廓清晰、光整，骨密度均勻

與否[26-27]，X線片是早期研究者證實(shí)關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)最直接、最有效的工具[25]。

光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）具有較高的空間分辨率，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠類軟骨形態(tài)的掃描[28]，但是此技術(shù)僅能提供二維圖像，不利于對(duì)軟骨形態(tài)進(jìn)行整體評(píng)價(jià)。此技術(shù)改進(jìn)為利用Micro-CT關(guān)節(jié)造影術(shù)（活體膝關(guān)節(jié)腔注射離子造影劑）掃描重建髕骨軟骨，以觀察離體鼠類髕骨軟骨成分和形態(tài)學(xué)變化[29-30]；但是仍然存在圖像為2D的問(wèn)題。

由于OCT的不足，有學(xué)者主張采用增強(qiáng)納米聚焦X 射線計(jì)算機(jī)斷層成像（contrast enhanced nanofocus X ray computed tomography，CE nano CT），認(rèn)為該法可對(duì)鼠類關(guān)節(jié)軟骨和骨組織結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)等3D進(jìn)行可視化同步成像和評(píng)價(jià)[31]。

4 實(shí)驗(yàn)室觀察指標(biāo)評(píng)價(jià)

大鼠血清iNOS、SOD濃度[32-33]，PⅡCP[34]及關(guān)節(jié)滑液內(nèi)白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、基質(zhì)金屬蛋白酶-3和血清中丙二醛、一氧化氮含量[35]。此類檢測(cè)指標(biāo)較多，因具體實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)不同而不同，目前實(shí)驗(yàn)研究中運(yùn)用較多，檢查方法成熟，成本較低，但鼠類關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本選取相對(duì)困難。

5 討 論

目前，醫(yī)學(xué)界通過(guò)KOA動(dòng)物模型對(duì)KOA的病因病機(jī)、防治方法做了大量的研究工作，也取得了階段性的成果。對(duì)其發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)及造模方式的選擇，醫(yī)學(xué)界至今尚未達(dá)成統(tǒng)一意見(jiàn)。KOA患者臨床及病理表現(xiàn)復(fù)雜，在臨床診斷及療效評(píng)估中需要考慮患者癥狀、體征、生存質(zhì)量等，目前KOA療效評(píng)估已經(jīng)有行業(yè)內(nèi)認(rèn)可的評(píng)分量表，但這些量表在觀察指標(biāo)上無(wú)法施行于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)用中。動(dòng)物KOA模型評(píng)價(jià)方法主要由實(shí)驗(yàn)本身決定，如動(dòng)物選擇、觀察指標(biāo)、實(shí)驗(yàn)方法及設(shè)計(jì)等因素決定，因此，在評(píng)價(jià)的實(shí)際運(yùn)用中，我們實(shí)時(shí)關(guān)注評(píng)價(jià)方法的進(jìn)展，并根據(jù)自身研究的預(yù)期目的，結(jié)合實(shí)驗(yàn)觀察目標(biāo)、經(jīng)費(fèi)運(yùn)算及實(shí)驗(yàn)室條件等來(lái)選擇合理評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以期獲得最為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為臨床實(shí)踐提供更好的支持。

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收稿日期：2015-04-09；修回日期：2015-05-20