枇杷細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)熊果酸的調(diào)控

李惠華　劉小英　常強　王偉　姚德恒　蘇明華

摘 要 以枇杷懸浮培養(yǎng)細胞的生長量及熊果酸（UA）的含量為考察指標(biāo)，從蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、溫度、光照強度、搖床轉(zhuǎn)速、激素等開展培養(yǎng)參數(shù)的篩選。結(jié)果表明：接種量8 g/100 mL，pH6.0，蔗糖30 g/L，25 ℃，白熾燈400 lx，轉(zhuǎn)速130 r/min，裝液量130 mL/250 mL，MS+NAA 0.5 mg/L，15 d收獲，細胞鮮重是起始的3.577倍，UA含量為34.993 mg/g DW，是自然界枇杷葉的約3.5倍。

關(guān)鍵詞 枇杷；熊果酸；細胞懸浮培養(yǎng)

中圖分類號 S667.3 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Ursolic acid（UA）is an activate component found in loquat and it has high economic value. The traditional UA extraction methods has limitations. A novel approach of producing UA using loquat cell suspension culture technique would have a significant benefit theoretically and practically. Different culture conditions on cell growth and UA accumulation in loquat cells， including sucrose concentration， plant growth regulators， pH， media volume， inoculums quantity， temperature， light intensity and shaking speed were investigated. The results showed that the weight of fresh cell were 3.577 times under optimal protocol after harvesting for 20 days when compared with the initial inoculums， and the UA content obtained reached 34.993 mg/g DW（Dry weight）. The optimal protocol was executed by transferring 8 g/100 mL of initial inoculums to a 130 mL liquid medium containing 30 g/L of carbon source， 0.5 mg/L plant hormone 1-Naphthaleneacetic acid（NAA）with pH6.0. Then loquat cell suspension was kept in a 25 ℃ shaker with 400 lx light intensity and shaking at 130 r/min for 15 days. The reulsts would provide foundations for future industrialized extracting UA from loquats in a large scale.

Key words Eriobotrya japonica L.； Ursolic acid； Cell suspension culture

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.011

枇杷（Eriobotrya japonica L.）為薔薇科（Rosaceae）枇杷屬植物，葉、花、果等都是傳統(tǒng)中藥，枇杷葉中富含有三萜酸等生物活性物質(zhì)，其中以熊果酸（Ursolic acid，簡稱UA）為主要藥用成分，被證明具有廣泛的生物活性：抗癌[1]，抗氧化[2]，抗抑郁[3]，保護神經(jīng)[4]，治療糖尿病[5]，是高價值的天然藥物和化妝品原料。

天然植物中UA的含量低（每克干重植物中含有：枇杷葉9.987 mg，車前3.164 mg，女貞3.401 mg）[6]，生產(chǎn)上多以成熟枇杷葉，用有機溶劑提取，存在費時、費力、成本高等局限性[7-9]。因此，開辟新的UA提取途徑十分必要。植物細胞懸浮培養(yǎng)途徑生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是目前中藥生產(chǎn)中重要的技術(shù)路線[5，10-11]，懸浮培養(yǎng)的細胞一般不含或少含色素、脂質(zhì)等，在提取分離方面具有更便捷經(jīng)濟的優(yōu)勢。此外，良好的植物細胞懸浮細胞系也被廣泛用于植物生物轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、細胞代謝、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究[10-11]。Ho等[12]通過植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)調(diào)控其總?cè)坪?，并?jīng)過體外小鼠試驗表明細胞培養(yǎng)物對糖尿病、高血脂有抑制作用[13]。但UA作為生產(chǎn)上枇杷葉提取加工中最重要的目標(biāo)產(chǎn)物，以枇杷UA為目標(biāo)產(chǎn)物進行細胞懸浮培養(yǎng)，有針對性地研究枇杷細胞懸浮培養(yǎng)參數(shù)與UA產(chǎn)量的關(guān)系少見報道。本研究擬在已有枇杷適合懸浮培養(yǎng)愈傷組織的基礎(chǔ)上[14]，開展細胞培養(yǎng)生產(chǎn)枇杷UA的研究。對蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、溫度、光照強度、搖床轉(zhuǎn)速、激素等培養(yǎng)參數(shù)進行篩選，盡可能提高UA的含量，為今后枇杷細胞懸浮培養(yǎng)提取UA規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)，同時也為枇杷UA的調(diào)控機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

適合枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織建立自早鐘6號幼胚，具體方法參見文獻[14]。將上述愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，于100 mL培養(yǎng)液/250 mL容量的三角錐瓶中，以MS培養(yǎng)液附加2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸）1 mg/L，KT（6-Furfurylamino-purine，6-糠基氨基嘌呤）0.5 mg/L，蔗糖2%，pH5.8，轉(zhuǎn)速110 r/min，黑暗培養(yǎng)，長期繼代保存，作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗起始材料的制備 每次試驗的起始材料，在適合的滅菌容器中充分混勻，用移液器吸取適量體積的混合材料加入到培養(yǎng)液中。

1.2.2 培養(yǎng)條件的篩選 為了確定最佳的培養(yǎng)條件及參數(shù)，以1.1中培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件為初始，順序進行了蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、光照強度、搖床轉(zhuǎn)速、激素（生長素、分裂素、生長素與分裂素的組合）的不同梯度試驗，前一個因子的梯度試驗確定的最佳參數(shù)應(yīng)用到后一個因子的梯度試驗中。濃度范圍通過預(yù)試驗得以確定。①蔗糖的濃度梯度為10、15、20、25、30、35 g/L，對照為20 g/L。②裝液量：250 mL的三角錐瓶分別裝入40、70、100、130、160、190 mL的培養(yǎng)液（新培養(yǎng)液與起始接入的培養(yǎng)材料的比例為1 ∶ 1，即確保試驗處理的細胞濃度是均一的），對照為100 mL。③pH值：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，對照為5.8。④接種量：每100 mL中分別為2、4、6、8、10、12 g。⑤溫度：15、20、25、30、35、40 ℃，對照為25 ℃。⑥白熾燈光強設(shè)為0、400、1 000、2 000、4 000 lx，對照為0 lx。⑦往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速：50、70、90、110、130、150、170 r/min，對照為110 r/min。⑧生長素2，4-D、NAA（1-naphthlcetic acid，a-萘乙酸）、IBA（Indole-3-Butytric acid，3-吲哚丁酸）設(shè)為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/L，分裂素6-BA（6-Benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤）、KT設(shè)為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L，對照為不添加激素。⑨在⑧中篩選到的生長素NAA和分裂素KT，梯度組合：NAA 0.5、1.0、2.0 mg/L與KT 2.0 、4.0、6.0 mg/L分別組合，共9個組合，對照為不添加激素。

1.2.3 項目測定 細胞生長的測定：培養(yǎng)材料過濾收集，并用濾紙吸干水份，測定鮮重?？疾熘笜?biāo)：鮮重生長倍數(shù)=收獲時100 mL細胞鮮重/起始100 mL材料的鮮重。

UA的提取及測定：測量完鮮重的細胞于50 ℃烘箱干燥至恒重，超聲波提取，高效液相色譜測定，標(biāo)樣購自中國食品藥品檢定研究院，批號110742-201220。

收獲UA總量測定：（細胞鮮重/10）g×UA的含量mg/g DW，10為細胞鮮重與干重的折算系數(shù)，由預(yù)試驗確定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗3次生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行生統(tǒng)分析。試驗數(shù)據(jù)用Duncan法進行多重比較，表示為3次重復(fù)的平均值±SE。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

蔗糖屬于碳源的一種。在固體培養(yǎng)的枇杷愈傷組織偏好蔗糖[15-18]，在此基礎(chǔ)上，本試驗著重確定適合枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的蔗糖濃度，結(jié)果見表1。培養(yǎng)3 d，10 g/L的處理首先發(fā)生褐變，培養(yǎng)5 d，15 g/L的處理發(fā)生褐變，可見較低濃度的蔗糖濃度不能滿足細胞快速分裂生長的需求。30 g/L的處理鮮重是起始的3.309倍，顯著高于其他處理，最適宜枇杷懸浮細胞的分裂增殖。同時，25 g/L時UA含量最高，是初始材料的1.194倍，是對照的1.142倍，與其他處理UA含量的差異顯著。其次為35、30 g/L，此兩者之間無顯著性差異。綜上，以收獲的UA總量及培養(yǎng)液蔗糖成本考慮，30 g/L為最佳蔗糖濃度。

2.2 裝液量對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

裝液量對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響見表2，100 mL處理，鮮重生長倍數(shù)最大，為最初鮮重的4.091倍，最適宜枇杷懸浮細胞的增殖。液體量太少（40 mL），細胞生長空間有限，液體量太多（160、190 mL），培養(yǎng)液無法保持一定的振幅，影響細胞養(yǎng)分的傳導(dǎo)及溶氧，均不適宜枇杷懸浮細胞的增殖。UA含量，裝液量100 mL是最低的，裝液量40、130 mL時為較佳。以總收獲UA總量為衡量指標(biāo)，130 mL/250 mL為最佳的裝液量體積。

2.3 pH值對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

pH值對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響見表3，鮮重的生長倍數(shù)在pH6.0達到最大值，是起始材料的3.617倍，與對照pH5.8（液體繼代培養(yǎng)的pH）沒有顯著性差異，與其他處理有顯著性差異。而在pH4.0、4.5及6.5時，細胞生長較差，可知弱酸性培養(yǎng)液較適宜枇杷細胞的生長。UA的累積，在pH4.0～6.5區(qū)間均呈現(xiàn)了下降-上升-下降的趨勢，pH6.0時，UA含量為最高值，也最適合細胞生長。pH4.0時，UA的含量也較高，UA在植物中主要是以游離態(tài)或糖苷鍵的形式存在[19]，可能在一定的酸性條件下有利于糖苷鍵的分解。綜上，pH6.0為最適的pH值，此時細胞增殖快，UA含量最高。

2.4 接種量對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

接種量對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響見表4，在考察接種量的影響時，當(dāng)接種量太小的時候（2 g），懸浮細胞活力較低，生長緩慢。接種量過大時（12 g），細胞由于生長空間有限、營養(yǎng)物質(zhì)供給不足，72 h出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，在懸浮培養(yǎng)后期大量死亡。接種量為4、6、8 g時，鮮重生長倍數(shù)較高，這3個處理之間不存在顯著差異，與其他處理均存在顯著性差異；接種量為8、12 g時，UA含量為試驗中較佳，這2個處理之間無顯著差異，與其他處理均存在顯著性差異。細胞的生長與UA的累積并不一致，接種量為12 g的處理，72 h褐變明顯，在收獲期細胞大量死亡，但UA的累積卻是最高的。綜上，試驗結(jié)果表明8 g/100 mL的接種量最適宜枇杷細胞懸浮培養(yǎng)，細胞增殖最快，UA含量最高。

2.5 培養(yǎng)溫度對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

培養(yǎng)溫度對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響見表5，溫度40 ℃時，枇杷懸浮細胞受到嚴重的熱脅迫，48 h內(nèi)，枇杷懸浮細胞由嫩黃色轉(zhuǎn)為褐色且死亡，在溫度15 ℃到溫度35 ℃區(qū)間內(nèi)，枇杷懸浮細胞較起始對照均有增長，25 ℃時達到最大的生長量，為起始材料的6.081倍，與其他處理有顯著的差異；20、30 ℃細胞的生長情況次之，兩者之間沒有顯著性差異。UA含量在35、15 ℃出現(xiàn)較高值，分別為對照的1.710倍和1.629倍，20～30 ℃之間，UA含量均高于對照，20、25 ℃兩處理間，UA的含量沒有顯著差異。以總收獲的UA質(zhì)量為衡量標(biāo)準(zhǔn)，枇杷細胞懸浮培養(yǎng)最適宜的溫度為25 ℃。

2.6 光照強度對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

光照強度對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響，以白熾燈光照強度作為考察因子，光照強度對鮮重生長倍數(shù)的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（見表6）。光照4 000 lx時最不適宜細胞的增殖及UA的積累。光照強度為400 lx時，枇杷懸浮細胞的鮮重生長倍數(shù)、UA含量最高，分別為起始的4.423倍、1.063倍，與其他處理差異顯著。因而白熾燈光照強度400 lx最適宜枇杷細胞懸浮培養(yǎng)UA的積累。

2.7 搖床轉(zhuǎn)速對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

搖床轉(zhuǎn)速對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響見表7，鮮重生長倍數(shù)及UA含量在130 r/min時均達到了最大值，此時細胞增殖速度最快，為起始細胞的6.180倍，UA含量為對照的1.138倍。50、70 r/min不適宜枇杷懸浮細胞的生長，轉(zhuǎn)速過低，細胞內(nèi)通氣狀態(tài)差導(dǎo)致細胞貼壁現(xiàn)象嚴重，部分細胞死亡，細胞鮮重生長情況不及對照。150、170 r/min時，細胞受強大的剪切力作用，細胞部分破碎，也不利于細胞的增殖。轉(zhuǎn)速50 r/min時，細胞生長狀態(tài)最差，UA含量的積累卻僅次于最佳轉(zhuǎn)速時期（130 r/min）。綜上，枇杷細胞懸浮培養(yǎng)應(yīng)以轉(zhuǎn)速130 r/min最適宜。

2.8 激素對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響

2.8.1 生長素對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響 考察生長素對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響見表8，與起始材料相比，處理后細胞生長倍數(shù)及UA含量生長倍數(shù)分別為（Naphthaleneacetic acid，NAA 3.742倍，4.014倍；2，4-D 2.332倍，1.486倍；IBA 1.427倍，1.196倍），與對照相比，（NAA 3.994倍，3.304倍；2，4-D 2.332倍，1.218倍；IBA 1.534倍，0.982倍）。生長素的處理使起始材料有一定的增長及UA的累積，生長素種類的效果NAA>2，4-D>IBA。

隨NAA濃度的增加，枇杷懸浮細胞的生長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，收獲時細胞的生長均達到起始材料的3.5倍以上，NAA1.0，NAA2.0，NAA4.0枇杷細胞增殖速度較快，3個處理間沒有顯著性差異，NAA6.0時細胞生長速度次之，NAA0.5再次之，但總體差距不大。而NAA濃度對UA含量的影響較大，隨著NAA濃度的增加，基本呈現(xiàn)出下降的趨勢，以NAA0.5最適宜UA的積累，是對照的3.964倍，與其他處理存在顯著差異。

隨著2，4-D添加濃度的增加，枇杷懸浮細胞的鮮重生長倍數(shù)逐漸降低，可見低濃度的2，4-D較適宜枇杷懸浮細胞的培養(yǎng)。UA含量的積累，在2，4-D0.5-4.0時，UA含量逐漸下降，2，4-D4.0 UA含量低于對照，但在2，4-D6.0時，UA含量又出現(xiàn)一定幅度增長。

IBA不適宜枇杷細胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液整體較灰暗。從表8可知，隨著IBA濃度的增加，細胞生長倍數(shù)也相應(yīng)增加，IBA6.0的細胞生長倍數(shù)最大，為初始的1.678倍，但效果不如2，4-D及NAA，遠小于NAA2.0（3.809倍），IBA1.0的UA含量最高，僅是初始的1.245倍，遠小于NAA0.5的4.829倍。因而，IBA是試驗中最不適宜枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的生長素。

綜上，3種生長素對枇杷細胞懸浮培養(yǎng)鮮重生長影響和UA含量的影響并不一致，從獲得UA總量角度考慮，NAA0.5為最適宜的枇杷細胞懸浮培養(yǎng)所需的生長素濃度。

2.8.2 分裂素對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響 分裂素對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響見表9，與起始材料相比，處理后細胞生長倍數(shù)及UA含量生長倍數(shù)分別為（BA 1.158倍，1.932倍；KT 1.557倍，3.123倍），與對照相比為（BA 1.227倍，2.374倍；KT 1.649倍，3.838倍），分裂素的處理使起始材料有一定的生長和UA的累積，分裂素種類效果為KT>BA。

枇杷細胞鮮重生長倍數(shù)隨著KT濃度的增大而增加，各處理顯著高于對照，KT4.0時，枇杷細胞懸浮增殖最快，是對照的1.936倍。UA的含量，隨KT濃度變化，含量先小幅下降而后逐漸增大，各處理均顯著高于對照及起始材料。KT4.0時，達到最大值，即分別為初始材料及對照的3.526倍、4.333倍。因而，高濃度的分裂素KT較適用于枇杷細胞懸浮培養(yǎng)。是否超出試驗范圍的更高的KT濃度更適合，本試驗中有進一步的激素組合及激素橫向比較分析。

枇杷懸浮細胞的生長隨著BA濃度的增大而增加，在BA濃度為0.25～0.5 mg/L較低范圍，細胞的鮮重較起始材料有所下降，與對照相比沒有顯著性差異。在濃度1.0 mg/L以上時，細胞開始增殖，在本試驗范圍內(nèi)，以BA4.0的增殖速度最快，為處理前的1.565倍，是對照的1.605倍。UA含量以BA1.0為較佳，在此濃度下，UA含量分別為處理前的2.083倍，為對照的2.177倍，與BA其他濃度處理差異顯著。

2.8.3 生長素與分裂素組合對懸浮培養(yǎng)中細胞生長量及UA累積的影響 在激素單因子試驗中篩選到的生長素NAA最適濃度0.5，分裂素KT最適濃度4.0，在此基礎(chǔ)上進行組合試驗，試驗組合及結(jié)果見表10。各處理的細胞鮮重生長倍數(shù)和UA含量均顯著高于對照，但UA含量僅有處理NAA0.5/KT2.0顯著高于起始材料。當(dāng)NAA濃度為0.5、2.0 mg/L時，枇杷鮮重生長倍數(shù)無較大差異；NAA濃度為1.0時， 2.0 mg/L的處理細胞鮮重明顯高于4.0、6.0 mg/L。在NAA濃度一定時（即NAA0.5、NAA1.0、NAA2.0），UA的含量隨著KT濃度的增加而下降。綜上， NAA1.0/KT2.0為最適宜枇杷細胞懸浮培養(yǎng)及UA累積。

以收獲的UA總量為衡量標(biāo)準(zhǔn)，橫向比較激素對細胞生長及UA累積的影響的表8～10發(fā)現(xiàn)，NAA0.5>2，4-D0.5>NAA1.0/KT2.0。因而，激素單獨作用效果明顯優(yōu)于激素組合。

3 討論與結(jié)論

3.1 懸浮脅迫培養(yǎng)與次生代謝物含量

在本研究中，脅迫產(chǎn)生后一般出現(xiàn)細胞鮮重生長倍數(shù)降低即細胞生長減緩，UA含量增加現(xiàn)象。如考察接種量與UA含量聯(lián)系時，接種量12 g時，72 h褐變明顯，在收獲期細胞大量死亡，但UA含量卻是最高；考察裝液量與UA含量聯(lián)系時，裝液量40 mL較佳，但此處理的細胞生長情況僅中等水平；自然狀態(tài)下，枇杷植株的最適合生長溫度為25 ℃，年均溫度15 ℃以上能生長，35 ℃以上容易產(chǎn)生日灼傷害，考察溫度與UA含量聯(lián)系時，UA含量在35、15 ℃出現(xiàn)較高值；在考察轉(zhuǎn)速時，轉(zhuǎn)速50 r/min的處理細胞生長狀態(tài)最差，UA含量的積累卻僅次于最佳轉(zhuǎn)速時期（130 r/min）?？赡苡捎谏L空間有限、營養(yǎng)物質(zhì)供給不足，細胞處于類似脅迫狀態(tài)，此時的次生代謝途徑大量開啟，UA增加累積以更好地適應(yīng)環(huán)境。

在其他研究中也有類似報道。如：在非最適生長溫度下，玉米向光面的葉片中積累花青素，以避免光抑制造成的傷害[20]。滲透脅迫下多種植物在體內(nèi)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)甜菜堿[21]。茉莉酸甲酯和水楊酸誘導(dǎo)的氧脅迫增加了人參根細胞懸浮液中酚的含量[22]。

今后，可在本研究的基礎(chǔ)上，于枇杷細胞的對數(shù)生長期的中期或后期（當(dāng)細胞增長到一定的程度），適時設(shè)計適度的脅迫促進目標(biāo)產(chǎn)物UA的累積，如低溫15 ℃或高溫35 ℃；低轉(zhuǎn)速50 r/min；高濃度的CO2等。同時UA屬于五環(huán)三萜化合物，此類化合物在生物體內(nèi)的代謝途徑也已有一定的研究，進行脅迫與UA研究時可以同時關(guān)注代謝途徑中的關(guān)鍵性的酶，進行相關(guān)機理的探索。

3.2 培養(yǎng)因子與次生代謝物含量

本研究順序考察了蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、光照強度、搖床轉(zhuǎn)速、激素對枇杷懸浮細胞生長及UA含量的影響，在確定前一個因子的最佳水平后應(yīng)用到后一因子的試驗中，由此逐步獲得各個影響因子的最佳值，經(jīng)調(diào)控UA含量逐漸升高，最終平均值為23.609 mg/g DW（所有激素處理樣品的平均值），為所有因子中最高，但不加激素的對照UA的含量僅為8.181 mg/g DW。由此可以看出，激素是所涉及試驗因子中最重要的因子，且激素單獨使用的效果好于激素組合。

激素對植物細胞的生長和代謝產(chǎn)物的形成具有特殊的調(diào)節(jié)作用[23-25]。Villarreal等[26]發(fā)現(xiàn)多裂水茄細胞在含有2 mg/L 2，4-D和2 mg/L KT 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，皂角苷含量達到14 mg/g，是自然植株的50倍。本研究中激素的調(diào)控效果最好，但單獨使用時，NAA 0.5> 2，4-D 0.5>激素組合NAA1.0/KT2.0。考慮到植物激素之間存在拮抗作用[27]，在設(shè)計試驗時不要忽略單激素使用效果可能優(yōu)于激素組合。

3.3 培養(yǎng)因子調(diào)控的效果及意義

枇杷葉UA含量相對其他植物較高[6]，因此生產(chǎn)中也是采用枇杷葉片提取UA。通過本試驗枇杷細胞的懸浮培養(yǎng)，其最佳調(diào)控為：接種量8 g/100 mL，pH6.0，碳源濃度30 g/L，溫度25 ℃，白熾燈400 lx，轉(zhuǎn)速130 r/min，裝液量130 mL/250 mL，MS培養(yǎng)液中添加NAA 0.5 mg/L。15 d收獲時，細胞的鮮重生長倍數(shù)達到起始材料的3.577倍，每克干重UA的含量為34.993 mg，是自然生長的枇杷葉的約3.5倍。

Ho等[12]在枇杷細胞懸浮培養(yǎng)調(diào)控三萜類化合物的研究中表明：在MS培養(yǎng)基中添加2.5 mg/L 6-BA，1 mg/L NAA和30 g/L蔗糖，（25±2）℃黑暗培養(yǎng)30 d，總?cè)坪繛椋?51.54±12.58）mg/g DW，其中UA的含量是15.56 mg/g DW。本研究側(cè)重于其中一種三萜類化合物——UA，培養(yǎng)參數(shù)與Ho等[12]在光照強度，調(diào)控激素的種類上有較大的區(qū)別：弱光更適合UA的累積，單激素低劑量的調(diào)控優(yōu)于激素的組合，同時UA的含量是Ho等[12]UA含量的2.25倍。鑒于研究目的是收集次生代謝產(chǎn)物，在優(yōu)先考慮細胞生長佳及次生產(chǎn)物收獲量大基礎(chǔ)上，本著對產(chǎn)物安全性的考慮，本研究在激素的選擇上以單個激素更小劑量更具優(yōu)勢。同時為今后通過枇杷細胞懸浮培養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)UA提供參考，為UA調(diào)控機制的研究奠定基礎(chǔ)。

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