法醫(yī)DNA常量檢材Chelex—100提取法探究

吳俊蓉 李宗壯

【摘要】目的：對Chelex-100提取法在常量檢材DNA提取中的應(yīng)用情況進行研究。方法：選取20份送檢的常量檢材，包括煙蒂、染血棉簽、紗條、FTA卡片等檢材，采用Chelex-100提取法對唾液、血痕進行檢測，并對檢測情況進行整理分析。結(jié)果：1組DAN濃度為2.31±0.2ng/μl；2組DNA濃度為2.28±0.4ng/μl；3組DNA濃度為2.49±0.3ng/μl，不同濃度的Chelex-100檢測的DNA濃度比較無明顯差異，且均能夠達到檢驗?zāi)康?。結(jié)論：低濃度Chelex-100在常量檢材DNA提取中即可取得良好的效果，能夠準(zhǔn)確的提取DNA。

【關(guān)鍵詞】常量檢材；Chelex-100提取法；DNA

法醫(yī)DNA檢驗技術(shù)是一種分子生物學(xué)檢驗方式，其主要是利用DNA的獨有性和個體識別性進行親子鑒定和嫌疑人鑒定。法醫(yī)DNA檢驗的主要對象為生物物證，也就是人體中的細(xì)胞核基因組，其通常存在于血液、唾沫中。目前，最常用的檢測方法為Chelex-100提取法，主要是由于此種檢測方式成本較低、操作方便、時間較短。筆者將對Chelex-100提取法在常量檢材DNA提取中的作用進行研究。

1.資料與方法

1.1一般資料

選取20份送檢的常量檢材，包括煙蒂、染血棉簽、紗條、FTA卡片等檢材，其中煙蒂5份、棉簽5份、紗條5份、FTA卡片5份。根據(jù)Chelex-100的濃度將所有檢材分為三組，濃度5%為1組；10%為2組；15%為3組。1組將5gchelex-100溶液加純水溶解至100ul；2組將10g chelex-100加純水溶解至100ul；2組將15g chelex-100溶液加純水溶解至100ul。

1.2檢測方法

1.2.1血液DNA檢測：將適量檢材放置于離心管內(nèi)震蕩30s，放置于溫室中浸泡，而后在13，000rpm條件下進行離心震蕩，留取20μl基底液，而后加入Chelex-100和PK5-20μl，在56攝氏度下放置30-90min；在100攝氏度下放置5-20分鐘，最后在10，000rpm條件下離心震蕩2min，取上層清液備用。

1.2.2唾液DNA檢測：將唾液斑檢材將之與離心管中，加入0.5ml純水，混勻，溫室中浸泡30min，在13，000rpm條件下離心震蕩3min，去除上清液；而后加入Chelex-100和PK5-20μl，在56攝氏度下放置30-90min；在98攝氏度下放置15分鐘，震蕩混勻，最后在13，000rpm條件下離心震蕩2min，在4攝氏度下保存。而后將所有樣本進行DNA擴增、電泳處理。

1.3效果比較

對三組檢測的DNA濃度進行比較。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用spss17.0軟件處理，計量資料采用±S表示，資料采用t值檢驗，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

三組DNA濃度比較無明顯差異，P<0.05（詳見表1）。

表1 三組DNA濃度比較

組別 濃度（ng/μl）

1組 2.31±0.2

2組 2.28±0.4

3組 2.49±0.3

P值 0.12

t值 1.23

3.討論

近年來由于醫(yī)學(xué)科技不斷的發(fā)展，DNA檢測技術(shù)逐漸普及，同時DNA檢測方式也越來越多，目前主要有Chelex-100提取法、有機法、二氧化硅法、堿裂解法和鹽析法。Chelex-100是一種樹脂，對多價金屬離子具有非常高的親和力，其在低離子強度、堿性溫浴的作用下能夠裂解細(xì)胞膜，改變與DNA結(jié)合蛋白的性質(zhì)[1]。通常來說，常量檢材基質(zhì)中含有大量的金屬離子，在低離子強度和加熱條件下能夠降解DNA，同時能夠抑制PCR反應(yīng)，因此在提取DNA時加入Chelex-100能夠阻止DNA降解，同時提升PCR擴增率[2]。但此種方式在臨床中也存在一定的不足，Chelex-100提取法檢測很容易受到基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，導(dǎo)致部分DNA丟失。但其在實踐中操作非常方便，且時間非常短，在提取的過程中無需更換試管，大大降低了污染發(fā)生率[3]。此外，在研究中也可以看出，低濃度的Chelex-100與高濃度Chelex-100提取的DNA濃度并無明顯差異，因此可以認(rèn)為低濃度Chelex-100能夠有效的提取常量檢材DNA，降低了不必要的浪費和污染。

有機提取法主要是采用飽和酚、氯仿等物質(zhì)按照不同比例進行混合，而后提取DNA的方式。DNA非常容易溶于水中，但不溶于有機溶劑中[4]。此種提取方式提取的DNA純度非常高，不會受到雜質(zhì)干擾，但此種方式由于在提煉過程中需要利用大量有機試劑進行輔助，有機試劑多存在較大的毒性，會對人體造成影響，且容易造成環(huán)境污染。此外，有機提取方式操作復(fù)雜、提取時間較長，已經(jīng)很少被采用。

二氧化硅法在提取DNA的過程中同樣存在操作復(fù)雜的特點，且此種檢測方式的改良方式主要應(yīng)用于微量檢材的檢測中，很少應(yīng)用于常量檢材的檢驗中[5]。堿裂解法在提取DNA時必須要及時進行DNA擴增處理，但對于法醫(yī)檢驗來說，通常要將DNA模板保存一段時間，以進行重復(fù)檢驗和鑒定，因此堿裂解法在實踐中不具備較強的可行性。鹽析法的操作成本較低，非常適合進行大批量樣本檢測，且此種方式的提取的DNA純度非常高，可以視為結(jié)果無蛋白質(zhì)干擾。但此種方式在使用中也存在較大的限制，鹽析法不僅需要大量的檢材，同時無法對低于3cm×3cm的檢材進行檢測，此外，鹽析法雖然提取的DNA純度較高，但其DNA提取率非常低，因此利用率也非常低。

總的來說，Chelex-100常量檢材DNA提取方式具有較高的可行性，是一種有效的DNA提取手段。

參考文獻

[1]楊電.接觸DNA檢材提取純化方法的比較及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用[D].南方醫(yī)科大學(xué)，2010.

[2]成振.Chelex-100 DNA模板用于H19印記基因座遺傳多態(tài)性的檢測及其在山西漢族人群中分布研究[D].山西醫(yī)科大學(xué)，2012.

[3]Katie L， William， RMark D，et a1.Developmental validationof a multiplex qPCR assay for assessing the quantity and quality ofnuelegr DNA in forensic samples [J].Forensic Sci Int， 2007，170，35—45.

[4]姜伯瑋，趙興等.Qubit快速熒光定量系統(tǒng)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].證據(jù)科學(xué)，2009，17（1），123-128.

[5]袁麗，魯滌，劉耀.低拷貝DNA模板檢驗方法研討[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2010，24（06），383-385.