乳腺癌人表皮生長(zhǎng)因子受體-2基因擴(kuò)增的意義

薛霜 趙躍武 許梅 宋曉霞 崔改華 孔令非

近來，乳腺癌成為女性最常見的惡性腫瘤之一，治療多采用手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向藥物治療等為主的綜合治療[1]。人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)在乳腺癌患者的高水平表達(dá)對(duì)臨床治療方案的選擇有指導(dǎo)作用，尤其是針對(duì)單克隆抗體赫塞?。℉erceptin）的臨床應(yīng)用,而雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達(dá)是應(yīng)用內(nèi)分泌藥物治療不可或缺的重要依據(jù)，因此，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌手術(shù)標(biāo)本中HER2、ER和PR的表達(dá)情況，分析它們與臨床病理特征的關(guān)系，并用FISH檢測(cè)乳腺癌手術(shù)標(biāo)本中HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)，比較IHC檢測(cè)與FISH 檢測(cè)的一致性程度，為臨床治療選擇用藥提供相關(guān)依據(jù)。

課堂教學(xué)時(shí)間是有限的，課文的內(nèi)容是有限的，課后的生字更是有限的，更多的還是要學(xué)生自己課外閱讀，拓寬學(xué)生的閱讀面，加大學(xué)生的識(shí)字量，不能局限于課文。班級(jí)可以開展組織朗讀活動(dòng)，如誦讀兒歌或精美小短文，也可以是自己寫的文章，評(píng)出一二等獎(jiǎng)，一等獎(jiǎng)的小朋友可在早讀課的時(shí)候給小朋友們領(lǐng)讀；班級(jí)內(nèi)也可組織“誰是識(shí)字王”的活動(dòng)，學(xué)生將自己一個(gè)月內(nèi)在閱讀的課外書中認(rèn)識(shí)的字寫在田字格中進(jìn)行評(píng)比，看誰寫的又多又好，每月選出十個(gè)“識(shí)字王”，這些“識(shí)字王”可利用自習(xí)課的時(shí)間將他們的閱讀和小朋友們分享；還可以在一些節(jié)日里像六一兒童節(jié)，元旦等舉行一些講故事比賽，朗讀表演……

1 資料與方法

1.1 臨床資料 95例乳腺癌標(biāo)本來自河南省人民醫(yī)院2010年1～12月間手術(shù)切除的標(biāo)本蠟塊?；颊吣挲g25～80歲，平均（51.2±6.1）歲，有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例。兔抗人單克隆抗體ER、PR、HER2及Max Vision TM試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，熒光顯微鏡為日本Olympas(BX41）。

取同一供試品6份（0.1 g），分別精密稱定重量，按樣品測(cè)定方法依法測(cè)定含氮量。結(jié)果分別為：3.0071%、3.0343%、2.9642%、2.9861%、2.9617%、3.0116%，平均值為2.9942%，RSD為1.0%（n=6），精密度結(jié)果良好。見表2。

1.2 方法

本研究結(jié)果提示,應(yīng)用利培酮對(duì)精神分裂進(jìn)行治療,能有效改善患者精神癥狀,且不良反應(yīng)輕,但可導(dǎo)致患者血脂異常及泌乳素水平上升。因此,在應(yīng)用利培酮對(duì)精神分裂癥患者進(jìn)行治療的過程中,需針對(duì)患者血脂和泌乳素實(shí)施定期的監(jiān)測(cè),加強(qiáng)相關(guān)危險(xiǎn)因素方面的評(píng)估。

1.2.1 乳腺癌組織學(xué)分型及分級(jí) 按照WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類(2003)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型、分級(jí)［2］，其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌84例，浸潤(rùn)性小葉癌11例。浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌分為3級(jí)，其中Ⅰ級(jí)18例，Ⅱ級(jí)56例，Ⅲ級(jí)21例。

1.2.3 免疫組織化學(xué)（IHC）采用Max VisionTM法，切片經(jīng)脫蠟、3%H2O2封閉后，置入pH6.0檸檬酸緩沖液中高壓鍋熱修復(fù)，滴加一抗（室溫2h），滴加二抗（37℃，20min）DAB顯色、蘇木精對(duì)比染色、封固。

1.2.2 熒光原位雜交（FISH） 標(biāo)本固定于10%中性甲醛中，24～48h后石蠟包埋，對(duì)照HE切片，選出浸潤(rùn)癌實(shí)驗(yàn)區(qū)切片厚3μm，65℃烤片2h，二甲苯脫蠟至無水乙醇→0.21mol/L HCL浸泡20min，去離子水洗3min→2×SSC緩沖液洗5min→50℃預(yù)熱的30%酸性亞硫酸鈉20min→去離子水洗2min，2×SSC洗5min→37℃蛋白酶K消化8～15min→2×SSC洗5min→切片45℃干燥2～5min→10%中性甲醛固定10min，2×SSC洗5min→78℃甲酰胺中變性5min→立即分別置入-20℃70%、85%、100%乙醇中2min，自然干燥。配制10μL探針，73℃水浴變性5min后置入46℃水浴中2～5min。滴加探針至組織切片上，蓋片后并封片膠封邊。置入40℃雜交濕盒過夜（14～18h）。將切片置洗滌液（2×SSC，0.1%NP40）洗去多余探針，室溫暗處干燥，加13μL DAPI顯色液對(duì)比染色。蓋玻片后熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2.2 HER2基因擴(kuò)增與HER2蛋白表達(dá)關(guān)系 95例乳腺癌組織標(biāo)本中，F(xiàn)ISH檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增28例（29.5%），其中12例HER2(+++)中有12例HER2基因擴(kuò)增（100%）；50例HER2(++)中有14例HER2基因擴(kuò)增（28%）；21例HER2(+)中有2例HER2基因擴(kuò)增（9.52%），其余均無擴(kuò)增，HER2基因擴(kuò)增在HER2表達(dá)強(qiáng)弱不同間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

1.3.2 IHC結(jié)果判斷 HER2表達(dá)顯示細(xì)胞膜呈棕黃色，ER、PR表達(dá)顯示細(xì)胞核呈棕黃色。按照美國(guó)乳腺癌HER2檢測(cè)指南［3］標(biāo)準(zhǔn)，HER2陽(yáng)性結(jié)果為+++（>30%浸潤(rùn)癌細(xì)胞的細(xì)胞膜呈完整的強(qiáng)著色），不確定結(jié)果為++（至少10%腫瘤細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜著色，但染色不均勻或強(qiáng)度較弱）。陰性結(jié)果為-或+（任何比例的腫瘤細(xì)胞有微弱的、不完整的細(xì)胞膜著色或無著色）。ER/PR陽(yáng)性認(rèn)定，強(qiáng)度：0為陰性，1為弱陽(yáng)性，2為中等陽(yáng)性，3為強(qiáng)陽(yáng)性；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0為陰性，1為陽(yáng)性細(xì)胞＜1%，2為陽(yáng)性細(xì)胞1%～10%，3為陽(yáng)性細(xì)胞11%～33%，4為陽(yáng)性細(xì)胞34%～66%，5為陽(yáng)性細(xì)胞≥67%。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)加起來≥3為陽(yáng)性。

1.3.1 FISH結(jié)果判斷 試劑盒中混合了兩種DNA探針，一是標(biāo)記為綠色熒光的17號(hào)染色體著絲粒，另一是標(biāo)記為橙紅色熒光的HER2基因，細(xì)胞核由DAPI染成藍(lán)色。所檢標(biāo)本中75%以上癌細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)。計(jì)數(shù)時(shí)選擇DAPI染色均一，細(xì)胞核邊界完整，無重疊的細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，紅色信號(hào)的總數(shù)與綠色信號(hào)的總數(shù)比值大于2.2時(shí)，為HER2基因擴(kuò)增，紅色信號(hào)為眾多信號(hào)連接成簇時(shí)可不用計(jì)算，即為基因擴(kuò)增。若比值介于1.8～2.2，再增加計(jì)數(shù)細(xì)胞，比值小于1.8則無HER2基因擴(kuò)增。17號(hào)染色體信號(hào)狀況，根據(jù)信號(hào)的數(shù)目分為單體、雙體和多體（著絲粒信號(hào)數(shù)＞2）。

知識(shí)產(chǎn)權(quán)不重視，那么基于旅游產(chǎn)業(yè)開發(fā)的重點(diǎn)動(dòng)漫IP、旅游產(chǎn)品、游戲等以虛擬形象在網(wǎng)絡(luò)傳播中就無法得到相應(yīng)的法律保護(hù)。

2.1 HER-2、ER、PR在乳腺癌組織中的表達(dá) 乳腺癌組織中HER-2、ER、PR表達(dá)率分別為87.4%、61.1%、54.7%，與不同年齡組、組織分級(jí)、病理類型、腋窩淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移間表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與腫瘤大小間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 HER2基因擴(kuò)增與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 84例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中有28例（33.3%）有HER2基因擴(kuò)增，11例浸潤(rùn)性小葉癌中無HER2基因擴(kuò)增，HER2基因擴(kuò)增在浸潤(rùn)性乳腺癌病理類型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HER2基因擴(kuò)增與ER和PR的IHC表達(dá)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HER2基因擴(kuò)增在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的組織學(xué)分級(jí)及有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2 結(jié)果

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R軟件（2.11.0版）的Pearsonχ2檢驗(yàn)（Pearson's Chi-squared test），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HER-2、ER、PR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（例）

1.3 結(jié)果判定

根據(jù)三維模型分析結(jié)果，在變壓器本體抽真空期間，等效于在箱壁內(nèi)側(cè)時(shí)間-101Kpa的載荷，在假定箱壁邊沿不發(fā)生位移的情況下，套管底座箱蓋所受應(yīng)力最大值為116.77Mpa，其最大變形量可達(dá)到1.6403mm；即在變壓器抽真空期間，油箱頂部的鋼板會(huì)向變壓器油箱內(nèi)側(cè)方向最大產(chǎn)生1.6403mm的形變量(在套管安裝固定的圓周范圍內(nèi)，由于現(xiàn)場(chǎng)條件可能產(chǎn)生不同的形變量，最大形變量計(jì)算為1.6403mm)。

表2 FISH檢測(cè)HER2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

HER2屬于酪氨酸激酶受體家族成員，是人類原癌基因。研究表明，在乳腺癌患者中，有25%～30%的患者會(huì)有HER-2蛋白的表達(dá)，而這其中有90%～95%HER2基因擴(kuò)增[4]。1998年美國(guó)FDA認(rèn)證了第一個(gè)治療乳腺癌的分子靶向藥物赫賽汀，基于HER2在乳腺癌診斷及治療中重要的指導(dǎo)意義，采用最準(zhǔn)確、合理的方法來檢測(cè)HER2表達(dá)狀態(tài)就尤為重要了。IHC和FISH為目前經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)并且在臨床上廣泛應(yīng)用檢測(cè)HER2的兩種方法，IHC是檢測(cè)HER2受體蛋白表達(dá)的情況，而FISH是檢測(cè)HER2基因的擴(kuò)增情況。

本研究比較河南省乳腺癌患者IHC和FISH檢測(cè)HER2狀態(tài)的一致性。研究結(jié)果顯示，兩種方法統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是IHC檢測(cè)HER2蛋白表達(dá)狀態(tài)不同時(shí)，兩者一致性有差別：對(duì)于IHC檢測(cè)HER2蛋白（+++），F(xiàn)ISH陽(yáng)性率為100%，（+～++）的患者FISH陽(yáng)性率僅為9.52%和28%，而（-）表達(dá)的患者陽(yáng)性率為0，這顯示了IHC結(jié)果為（+++）的患者，兩種檢測(cè)方法一致性較高，可以直接作為診斷的依據(jù)。

HER2基因擴(kuò)增在乳腺癌組織學(xué)類型間有明顯差別，84例浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中HER2基因擴(kuò)增28例（33.3%），11例浸潤(rùn)性小葉癌中無HER2基因擴(kuò)增；IHC檢測(cè)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中HER2蛋白陽(yáng)性表達(dá)75例（89.3%），浸潤(rùn)性小葉癌中HER2蛋白陽(yáng)性表達(dá)8例（72.7%），說明IHC檢測(cè)HER2蛋白陽(yáng)性狀態(tài)與乳腺癌病理類型無相關(guān)性[5]。這兩種檢測(cè)結(jié)果有差別，可能與檢測(cè)方法的準(zhǔn)確程度以及IHC判讀標(biāo)準(zhǔn)的差別有關(guān)。本研究結(jié)果中HER2基因擴(kuò)增率在乳腺癌患者組織學(xué)分級(jí)I、II、III中的表達(dá)率分別為22.2%、35.7%、19.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]，分析可能與我們所選病例中組織學(xué)分級(jí)II級(jí)浸潤(rùn)性癌所占比例高有關(guān)系。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ER、PR蛋白均陰性表達(dá)時(shí)，HER2基因擴(kuò)增率較高，提示ER、PR和HER2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上存在某些關(guān)聯(lián)，當(dāng)ER表達(dá)降低時(shí)HER2表達(dá)增強(qiáng)[7]，從而抑制了內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)。

綜上所述，免疫組化檢測(cè)可作為HER2表達(dá)狀態(tài)的初篩，對(duì)于IHC檢測(cè)為（++）的患者，可以重點(diǎn)的進(jìn)行FISH的檢測(cè)，對(duì)于（-）和（+）的患者，可以選擇性地進(jìn)行FISH檢測(cè)，指導(dǎo)乳腺癌的分子靶向治療。

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