液相色譜法測定辣椒中克百威農(nóng)藥殘留量的不確定度評定

魏維杰　王麗芳

摘要 [目的]了解測定蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留量不確定度的主要來源，通過一些方法對不確定度貢獻度大的進行改善修正，從而進一步提升檢測結(jié)果的可靠性。[方法]對辣椒中克百威農(nóng)藥殘留的不確定度進行評定和分析，找出影響不確定度的因素，對各個不確定度分量進行評估并比較各分量對總不確定度的貢獻，從而給出測定結(jié)果的置信區(qū)間。[結(jié)果]分析得出影響結(jié)果的主要不確定度分量是色譜儀峰面積的測定和總重復(fù)性。[結(jié)論]在檢測過程中，需在檢測前做好儀器平衡和調(diào)試，確保儀器處于良好的工作狀態(tài)，并在重復(fù)檢測時盡可能排除其他干擾。

關(guān)鍵詞：液相色譜法；克百威；不確定度

中圖分類號：S481+.8 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-089-03

近年來，食品安全問題日益凸顯，蔬菜農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為人們最關(guān)心話題之一，因此農(nóng)藥殘留檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。為了提供更公正、更準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)，測量不確定度作為判定測量結(jié)果準(zhǔn)確度的一個重要依據(jù)，是實驗室質(zhì)量體系建立的重要部分，實驗室認證時也對其有明確要求，因此受到了各檢測實驗室的重視，各實驗室對其進行了廣泛的研究與討論[1-6]?？税偻俑叨練⑾x劑，被農(nóng)業(yè)部禁止在蔬菜上使用，但偷用、濫用現(xiàn)象屢有發(fā)生，辣椒在南方需求量非常大，但病蟲害多，農(nóng)藥檢出率較高，為此，筆者選擇對辣椒中克百威農(nóng)藥殘留量進行了測量不確定度評定，旨在為農(nóng)藥殘留檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。鮮辣椒為市售。

1.1.2 試劑。乙腈，甲醇，二氯甲烷，氯化鈉，超純水（哇哈哈純凈水經(jīng)純水器過濾所得）。

1.1.3 主要儀器。島津LC-20A液相色譜儀（氨基甲酸酯分析系統(tǒng)）；檢測器為熒光檢測器（λex 330 nm，λem 465 nm）；柱子為C8（4.0 mm×250.0 mm），5 μm。

1.2 分析條件 柱溫及衍生溫度：50 ℃；柱后衍生：0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，流速0.3 ml/min；OPA試劑，流速0.3 ml/min；反應(yīng)器溫度：100 ℃。保留時間定性，外標(biāo)單標(biāo)法峰面積定量。檢測時，室溫（25±3）℃。

1.3 方法 依據(jù)NY/T761-2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定第3部分：蔬菜和水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》改動的非標(biāo)方法測定。

將鮮辣椒用打樣機打碎混勻，稱取10.00 g樣品放入50 ml離心管中，加入5.00 g氯化鈉，再加入25.00 ml乙腈，充分混勻，用低速離心機4 500 r/min離心4 min，使乙腈相和水相充分分層，室溫下靜置5 min。從離心管中吸取5.00 ml乙腈溶液，放入10 ml試管1中，將試管放在氮吹儀上氮吹，設(shè)置水浴溫度70 ℃，緩緩?fù)ㄈ氲獨猓瑢⒁译娴嫡舭l(fā)至近干，加入2.00 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）溶解殘渣，待凈化。將氨基柱用4.0 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）預(yù)洗條件化，當(dāng)溶液液面到達柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化溶液，用10 ml試管2收集洗脫液，用2 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）洗試管1后過柱，并重復(fù)1次。將試管2置于氮吹儀上，水浴溫度50 ℃，氮吹蒸發(fā)至近干，用2.00 ml 10%甲醇溶解殘渣。樣品在混勻器上混勻后，經(jīng)0.2 μm有機針式過濾器過濾，吸取10.0 μl凈化后的樣品溶液注入液相色譜儀中待分析。

1.4 計算公式

ω=C標(biāo)×A樣×V1×V3×1 000/（A標(biāo)×m×V2×R×1 000）

式中，ω——樣品中農(nóng)藥的含量，mg/kg；

C標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)溶液中克百威濃度，μg/ml；

A標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)溶液中克百威峰面積，mV*s；

A樣——樣品中克百威峰面積，mV*s；

m——樣品的質(zhì)量，g；

V1——提取溶液總體積，ml；

V2——提取溶液分取的體積，ml；

V3——樣品溶液定容體積，ml；

R——樣品加標(biāo)回收率，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 識別不確定度的來源 液相色譜法檢測辣椒中克百威的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ω）主要來源：① 檢測方法總重復(fù)性導(dǎo)致的相對不確定度urel（rep）；② 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C標(biāo)）；③ 樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）；④ 樣品前處理溶液體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）；⑤ 標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積測定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（A標(biāo)）；⑥ 樣品峰面積測定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（A樣）；⑦ 樣品加標(biāo)回收率引入的不確定度urel（R）。

從測定方法看，各影響參數(shù)相對獨立，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可用相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成：

2.2 量化不確定度分量

2.2.1 檢測方法總重復(fù)性導(dǎo)致的相對不確定度urel（rep）。

按照該方法對樣品加標(biāo)中的克百威含量分別進行測定，檢測結(jié)果為

0.170、0.173、0.169、0.167、0.165、0.168、0.171、0.169、0.167和0.170 mg/kg。

=0.168 9（mg/kg） s（w）=0.002 283（mg/kg）

實際測量時，一般對樣品測定2次作為測量結(jié)果，則：

u（w）=s（）=s（w）2=0.001 614（mg/kg）

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel（rep）=u（w）=0.009 56（mg/kg）

2.2.2 克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C標(biāo)）。

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C′標(biāo)）。

克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液母液由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所（天津）制備，濃度為100 μg/ml，1 ml/瓶，其定值擴展不確定度為±0.08 μg/ml，k=2。屬于B類評定，計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u（C′標(biāo)）=ak=0.04（μg/ml）

urel（C′標(biāo)）=u（C′標(biāo)）C=0.000 40

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定。

將1 ml安瓿瓶中的克百威標(biāo)準(zhǔn)母液移至10 ml容量瓶（A級）中，用1 ml甲醇沖洗安瓿瓶移至容量瓶中，重復(fù)5次，然后用甲醇定容，配成10 μg/ml克百威標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液槍吸取10 μg/ml克百威標(biāo)準(zhǔn)儲備液500 μl移至25 ml容量瓶（A級）中，用甲醇定容，配成0.2 μg/ml克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液。

因克百威標(biāo)準(zhǔn)母液未能完全轉(zhuǎn)移至容量瓶中而產(chǎn)生的不確定度由于5次清洗已經(jīng)可以忽略不計。

移液槍為Eppendorf（20～200 μl），根據(jù)檢定證書提供的信息其200 μl時的測量重復(fù)性為1.0%，按矩形分布處理（屬于B類評定）：

urel（DE1）=0.005 77

移液槍為Eppendorf（100～1 000 μl），根據(jù)檢定證書提供的信息其500 μl時的測量重復(fù)性為0.5%，按矩形分布處理（屬于B類評定）：

urel（DE2）=0.002 89

根據(jù)GB12806-1991《實驗室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶》規(guī)定：單標(biāo)線10 ml容量瓶的容量允許差為±0.02 ml。按三角分布處理（屬于B類評定）：

urel（DF1）=0.000 82

根據(jù)GB12806-1991《實驗室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶》規(guī)定：單標(biāo)線25 ml容量瓶的容量允許差為±0.03 ml。按三角分布處理（屬于B類評定）：

urel（DF2）=0.000 49

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel（D）=

u2rel（DE1）+u2rel（DE2）+u2rel（DF1）+u2rel（DF2）=0.006 52

2.2.2.3 克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的合成相對不確定度評定。

urel（C標(biāo)）=u2（C′標(biāo)）+u2rel（D）=0.006 53

2.2.3 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）評定。

樣品稱量所用天平最小分度值為0.01 g電子天平，準(zhǔn)確稱量樣品10.00 g，由于天平精度不是很高，數(shù)顯非常穩(wěn)定，故稱量重復(fù)性引入的不確定度忽略不計。該準(zhǔn)確級的天平在（0～50 g）稱量范圍的最大允許誤差為±0.01 g，由稱量誤差導(dǎo)致的不確定度按矩形分布計算（B類評定）：

u2rel（m）=0.000 58

2.2.4 樣品前處理過程溶液體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）評定。

2.2.4.1 提取溶液總體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V1）。

用A級25 ml單標(biāo)線胖肚移液管移取25.00 ml（V1）乙腈，根據(jù)GB12808-1991《實驗室玻璃儀器單標(biāo)線吸量管》規(guī)定：A級25 ml單標(biāo)線胖肚移液管的容量允許差為±0.03 ml。按三角分布處理（屬于B類評定）：

3 討論

總重復(fù)性（rep）、標(biāo)準(zhǔn)液（C標(biāo)）、樣品量（m）、前處理體積（V）、峰面積（A）、回收率（R） 6項參數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量值分別為

0.009 56、0.006 53、0.000 58、0.006 08、0.012 44、0.006 91。

由各個相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量值可知，影響結(jié)果的主要不確定度分量是色譜儀峰面積的測定；其次是總重復(fù)性、回收率、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、前處理體積；樣品量可以忽略不計。因此，在標(biāo)準(zhǔn)進樣和樣品檢測過程中應(yīng)嚴格按照儀器操作規(guī)程進行測定，在測定前做好儀器平衡和調(diào)試準(zhǔn)備工作，盡量排除儀器的不確定因素，同時在樣品檢測過程中應(yīng)嚴格控制樣品前處理的各個步驟，減少因定容、取液等引入的不確定度，從而減小測定結(jié)果的不確定度。

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