續(xù)骨酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

胡翼安等

摘要 [目的]建立續(xù)骨酒的定量定性檢測(cè)方法，為續(xù)骨酒質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。[方法]采用薄層色譜法（TLC）對(duì)續(xù)骨酒中的梔子、地黃定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定梔子苷的含量。[結(jié)果]TLC鑒別分離度好、專屬性強(qiáng)；含量測(cè)定中梔子苷在0.151 1～2.518 0 mg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=925 558X- 11 386，r=0.999 9（n=7），平均回收率為99.4%，RSD%為1.4。[結(jié)論]該試驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好，可作為續(xù)骨酒的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：續(xù)骨酒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；地黃；梔子苷

中圖分類號(hào)：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-047-03

續(xù)骨酒是廣州市正骨醫(yī)院的一個(gè)常用制劑。續(xù)骨酒主要由鬧羊花、續(xù)斷、梔子、姜黃、生地黃、獨(dú)活等中藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛、驅(qū)風(fēng)祛濕、舒筋通絡(luò)的功效，對(duì)各種骨折腫痛、跌打損傷、風(fēng)濕骨痛有確切的療效。續(xù)骨酒是一安全、有效、使用方便的外用噴霧劑，很受患者歡迎，卻至今缺乏一個(gè)全面、完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)行的續(xù)骨酒內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有2010年版中國(guó)藥典中有關(guān)噴霧劑通則項(xiàng)下的檢查，包括外觀、總固體、乙醇量、裝量、微生物限度等項(xiàng)目，這些檢查項(xiàng)既不能保證制劑的質(zhì)量，亦保障不了臨床用藥的有效性和安全性，因此很有必要對(duì)續(xù)骨酒中的藥材和有效成分進(jìn)行鑒別，并測(cè)定其有效成分的含量，以提高續(xù)骨酒的質(zhì)量和臨床用藥的有效性。筆者采用薄層色譜法對(duì)梔子、地黃進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法對(duì)續(xù)骨酒中梔子苷進(jìn)行了含量測(cè)定，為續(xù)骨酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)，也為續(xù)骨酒后期在臨床上的發(fā)展應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀（LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、CTO-10ASvp柱溫箱、CBM-20A控制器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC solution化學(xué)工作站）；KQ-300型超聲波清洗器（功率300 W，頻率40 kHz，東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；AUW220D型萬分之一分析天平（日本SHIMADZU公司）；Goodlook-1000型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?；薄層層析硅膠G板（德國(guó)MACHEREY-NAGEL公司，批號(hào)006153）。

1.2 試藥 梔子對(duì)照藥材（批號(hào)120986-201309，中國(guó)藥品生物制品檢定所），地黃對(duì)照藥材（批號(hào)121180-201005，中國(guó)藥品生物制品檢定所），梔子苷對(duì)照品（批號(hào)110749-201316，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；續(xù)骨酒（廣州市正骨醫(yī)院，批號(hào)20140101、20140201、20140301、20140401、20140501）和續(xù)骨酒梔子陰性溶液（廣州市正骨醫(yī)院）；甲醇為色譜純，其余為分析純。

1.3 方法

1.3.1 梔子的TLC鑒別 。取本品20 ml，蒸干，加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液；取缺梔子的陰性對(duì)照樣品20 ml，同法制成缺梔子陰性對(duì)照溶液；再取梔子對(duì)照藥材1 g，加50%甲醇10 ml，超聲40 min，濾過，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液；另取梔子苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各4 ml、對(duì)照藥材溶液及對(duì)照品溶液各2 ml，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）為展開劑[2]，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。在日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照應(yīng)無干擾。

1.3.2 地黃的TLC鑒別。取續(xù)骨酒原液作為供試品溶液。取地黃對(duì)照藥材1 g，加80%甲醇50 ml，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀? ml使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次10 ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5 ml，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）為展開劑[3]，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。在日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，應(yīng)陰性對(duì)照無干擾。

1.3.3 梔子苷的含量測(cè)定。

1.3.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。色譜柱為迪馬ODS色譜柱（250×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（20∶80），流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

1.3.3.2 供試品溶液的制備。精密吸取續(xù)骨酒10 ml，置于25 ml容量瓶，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 mm孔徑微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.3.3 對(duì)照品溶液的制備。取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含251.8 mg/ml的對(duì)照品溶液；精密吸取上述對(duì)照品溶液5 ml，置于20 ml容量瓶，加入甲醇至刻度，搖勻，制得含62.94 mg/ml的梔子苷對(duì)照品溶液。

1.3.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備。按缺梔子的陰性對(duì)照樣品，按“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備，即得缺梔子陰性對(duì)照溶液。

1.3.3.5 測(cè)定方法。分別精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

1.3.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性考察。精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液（251.8 mg/ml）各0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分別注入高效液相色譜儀，按“1.3.3.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)。將按“1.3.3.2”項(xiàng)制備的供試品溶液（批號(hào)20140101）于0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣10 μl，按“1.3.3.1”色譜條件測(cè)定。

1.3.3.8 精密度試驗(yàn)。精密取梔子苷對(duì)照品溶液10 μl，采用高效液相色譜法，連續(xù)測(cè)定6次。

1.3.3.9 重復(fù)性試驗(yàn)。取供試品溶液（批號(hào)20140101）按“1.3.3.5”項(xiàng)下方法，連續(xù)測(cè)定6次。

1.3.3.10 加樣回收試驗(yàn)。在已知含量的續(xù)骨酒加入一定量的梔子苷對(duì)照品溶液，按“1.3.3.5”項(xiàng)下方法測(cè)定，并計(jì)算回收率。

1.3.3.11 樣品測(cè)定。精密稱取續(xù)骨酒樣品，按“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μl，采用高效液相色譜法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子的TLC鑒別 從圖1可以看出，供試品色譜中，在與梔子對(duì)照藥材色譜和梔子苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺梔子陰性對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上沒有干擾。

2.2 地黃的TLC鑒別 從圖2可以看出，在與地黃對(duì)照藥材色譜顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺地黃陰性對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上沒有干擾。

2.3 梔子苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。在該色譜條件下檢測(cè)，繪制供試品、梔子苷對(duì)照品和缺梔子陰性對(duì)照品色譜圖（圖3）。由圖3可見，供試品和梔子苷對(duì)照品在相同的保留時(shí)間（32.5 min），缺梔子陰性對(duì)照品在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間沒有影響。供試品所測(cè)定主峰附近無明顯雜峰，經(jīng)計(jì)算，樣品主峰與其他組分峰的分離度>1.5。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性考察。通過“1.3.3.1”色譜條件測(cè)定梔子苷對(duì)照品，以梔子苷進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出線性回歸方程為Y=925 558X- 11 386（r=0.999 9），結(jié)果表明，梔子苷在0.151 1～2.518 0 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.3.3.7”項(xiàng)，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定續(xù)骨酒中的梔子苷。測(cè)得24 h內(nèi)平均峰面積為662 523，RSD=2.1%（n=6），表明被測(cè)樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 精密度試驗(yàn)。按“1.3.3.8”項(xiàng)，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得平均峰面積為590 545，RSD=1.1%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.3.3.9”項(xiàng)，連續(xù)測(cè)定6次。測(cè)得同一批號(hào)中，平均峰面積為660 066，梔子苷平均濃度為173.7 μg/ml，RSD=1.2%，結(jié)果顯示重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn)。由表1可見，該試驗(yàn)方法中梔子苷的平均回收率達(dá)99.4%，RSD為1.4%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于續(xù)骨酒中梔子苷的含量測(cè)定。

2.3.7 樣品測(cè)定。由表2可知，3批續(xù)骨酒中梔子苷含量為155.1～176.6 μg/ml，平均含量為163.6 μg/ml，RSD為0.20%～0.49%。

3 小結(jié)與討論

（1）梔子的薄層色譜鑒別中，按藥典方法的展開系統(tǒng)分離效果較差，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，改用乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）為展開劑，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰、分離度好，可作為續(xù)骨酒的定性鑒別指標(biāo)。

（2）地黃的薄層色譜鑒別中，按藥典方法的展開系統(tǒng)分離效果較差，斑點(diǎn)模糊，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，改用正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）為展開劑，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰、分離度好，可作為續(xù)骨酒的定性鑒別指標(biāo)。

（3）該研究采用HPLC法測(cè)定了續(xù)骨酒中梔子苷的含量，樣品分離度高，測(cè)定方法重復(fù)性良好、回收率高、專屬性強(qiáng)，可作為該制劑質(zhì)量控制的含量測(cè)定指標(biāo)。

（4）該研究測(cè)得續(xù)骨酒中梔子苷的平均含量為163.6 μg/ml，考慮到藥材來源、制劑生產(chǎn)等因素，暫規(guī)定本品每毫升中含梔子以梔子苷（C17H24O10）計(jì)，不得少于90 μg/ml。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010：231， 附錄34-35.

[2] 方道碩， 鐘亞玲， 宋英. 清熱瀉火膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中國(guó)藥師， 2008， 11（4）： 406- 408.

[3] 馮文濤， 謝穎， 張榕. 涼血顆粒所用藥材的薄層鑒別[J]. 華西藥學(xué)雜志， 2008， 23（4）： 502.