小麥及其近緣物種中類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin瞝ike基因的克隆綜述

摘要 介紹了小麥的品質(zhì)及品質(zhì)的形成、小麥的儲(chǔ)藏蛋白及儲(chǔ)藏蛋白的分類。綜述了近年來關(guān)于類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like基因發(fā)現(xiàn)、Avenin-like基因的胚乳特異性表達(dá)的時(shí)空表達(dá)模式以及Avenin-like基因的啟動(dòng)子的作用元件和時(shí)空表達(dá)特異性研究。

關(guān)鍵詞：Avenin-like基因；胚乳特異性表達(dá)；啟動(dòng)子

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-040-03

小麥的品質(zhì)主要包含營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)[1]。其中小麥的營養(yǎng)品質(zhì)主要是指所含的營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)生物體營養(yǎng)需要的適合性和滿足程度，包括營養(yǎng)成分含量的多少和各種營養(yǎng)成分是否全面和均衡。小麥的加工品質(zhì)是指小麥籽粒對(duì)制粉以及制作不同食品的適應(yīng)性和滿足程度，主要包括一次加工品質(zhì)即磨粉品質(zhì)和二次加工品質(zhì)即食品加工品質(zhì)。磨粉品質(zhì)是指籽粒在輾磨為面粉的過程中，品質(zhì)對(duì)磨粉工藝的滿足程度，主要包括籽粒容重、灰分、硬度、出粉率、面粉白度等。小麥的食品加工品質(zhì)包括烘烤和蒸煮后的質(zhì)量，烘烤品質(zhì)主要指出粉率、灰分、粉色、細(xì)度、沉降值、α-淀粉酶活性等指標(biāo)，蒸煮品質(zhì)主要指吸水率、攪拌特性、面筋延伸性和抗延性[2]。物質(zhì)組成決定加工品質(zhì)，小麥加工品質(zhì)很大程度上取決于面團(tuán)流變學(xué)特性，與小麥儲(chǔ)藏蛋白的組分關(guān)聯(lián)密切[3-8]。

面粉加水之后經(jīng)過攪拌后形成面團(tuán)，其大致的分子機(jī)理為：谷蛋白亞基通過分子間二硫鍵交聯(lián)，然后形成纖維狀大分子聚合體，從宏觀上表現(xiàn)為彈性的形成。醇溶蛋白在分子內(nèi)在二硫鍵、氫鍵等的共同作用下形成球狀結(jié)構(gòu)，通過非共價(jià)鍵穿插在谷蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架中，在宏觀上表現(xiàn)為面團(tuán)具有延展性[9]。面團(tuán)的彈性和黏性用面團(tuán)的流變學(xué)特性來描述。

1924年，Osborne[10]根據(jù)種子中貯藏蛋白的溶解條件，將貯藏蛋白分為兩大類。其中第一大類為面筋蛋白，主要含有麥谷蛋白和麥醇溶蛋白。麥谷蛋白約占45%，可以溶于稀酸或稀堿，由17～20條多肽鏈構(gòu)成，呈纖維狀，水合時(shí)無黏性，彈性好，決定面團(tuán)彈性。麥醇溶蛋白約占40%，醇溶性，由一條多肽鏈構(gòu)成，僅有分子內(nèi)二硫鍵和較緊密的三維結(jié)構(gòu)，呈球形，多由非極性氨基酸組成，富含谷氨酰胺和脯氨酸，故水合時(shí)黏性好，參與面團(tuán)延展性[11]。第二大類主要為非面筋蛋白，主要包括清蛋白和球蛋白。清蛋白可溶于水或低濃度鹽溶液，約占蛋白總量的2.5%；球蛋白可溶于稀釋的鹽溶液中但不能溶于水，約占蛋白總量的5%。

1 類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like基因及蛋白的發(fā)現(xiàn)

1.1 類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like基因的發(fā)現(xiàn) 2001年，Anderson等[12]將小麥?zhǔn)诜酆蟮姆N子與種子胚乳特異性EST進(jìn)行雜交，其cDNA文庫是小麥?zhǔn)诜酆?～30 d的種子cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了一類新的小麥胚乳特異性表達(dá)基因，然后BLAST對(duì)比分析，證明該小麥胚乳特異性表達(dá)的基因與燕麥Avenin儲(chǔ)藏蛋白基因相似度最高。

2004年，Li等[13]分別以小麥的胚、胚乳以及未授粉子房的RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA為探針，與小麥?zhǔn)诜酆?2 d的種子cDNA文庫進(jìn)行差異雜交，結(jié)果證明4個(gè)基因類似于燕麥Avenin蛋白編碼基因，并研究了這類小麥Avenin-like蛋白編碼基因在各個(gè)組織中的表達(dá)模式，進(jìn)一步證明了該類基因只在胚乳中特異性表達(dá)。

2005年，Vensel等[14]通過質(zhì)譜技術(shù)以及雙向電泳技術(shù)，將小麥開花后10～36 d的胚乳中分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)序列比較分析后發(fā)現(xiàn)了5個(gè)類似于燕麥的蛋白質(zhì)，通過研究證明該類蛋白質(zhì)是小麥新型種子儲(chǔ)藏蛋白。

2005年，Drea等[15]應(yīng)用高通量原位雜交技術(shù)，檢測(cè)小麥胚乳發(fā)育早期基因表達(dá)模式，將檢測(cè)到種子發(fā)育期間有多個(gè)Avenin-like蛋白編碼基因在胚乳中特異性表達(dá)，這些表達(dá)產(chǎn)物被證明類似于小麥儲(chǔ)藏蛋白。

2005年Dupont等[16]從小麥種子胚乳中分離得到一個(gè)新型蛋白質(zhì)，然后通過試驗(yàn)表明小麥胚乳中這類蛋白與燕麥Avenin蛋白相似度很高。

1.2 類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like蛋白的研究 2006年，Kan等[17]利用構(gòu)建的小麥和山羊草開花后14 d的種子cDNA文庫與小麥胚乳特異性表達(dá)的EST芯片雜交，結(jié)果顯示為陽性克隆，將陽性克隆的基因序列和推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列經(jīng)BLAST比較分析后，因這種基因與小麥儲(chǔ)藏蛋白基因Avenin同源性較高，故將這種基因命名為Avenin-like基因，將其相應(yīng)的蛋白命名為Avenin-like蛋白。

依據(jù)Avenin-like蛋白的結(jié)構(gòu)差異，可以分為Avenin-like type a和Avenin-like type b 2種蛋白，分別含有約148和265個(gè)氨基酸殘基，分子量分別約為16 kDa和30 kDa[17]。已分離的小麥Avenin-like type a基因Avenin-like type b基因長度分別為450和855 bp。

2008年，陳鵬等[18-19]利用小麥及其近緣物種各種山羊草為研究材料，克隆得到了23個(gè)ALP type-b同源基因，然后利用半定量PCR技術(shù)及Western-blot雜交分析驗(yàn)證，結(jié)果表明，該基因在胚乳中特異性表達(dá)。并證明這些Avenin-like蛋白存在典型的“半胱氨酸-半胱氨酸”，即“Cys-Cys”結(jié)構(gòu)域。陳鵬等[20-21]利用實(shí)時(shí)熒光定量即RT-PCR技術(shù)證明Avenin-like基因的時(shí)空表達(dá)模式，Avenin-like基因在根、莖、葉、花等其他組織中均無表達(dá)，但在胚乳中特異性表達(dá)。

2 類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like基因的啟動(dòng)子研究

2.1 類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like基因啟動(dòng)子的克隆和元件分析 基于類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like基因在胚乳中特異性表達(dá)的特性，2012年，宋斐等[22]對(duì)ALP type-B基因啟動(dòng)子的克隆及其功能進(jìn)行了研究。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR即RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ALP type-B基因在小麥胚乳中表達(dá)，但在根、莖、葉和花等其他組織中均無表達(dá)，表明ALP type-B基因的表達(dá)具有胚乳特異性。運(yùn)用反向PCR技術(shù)，從小麥鄂恩1號(hào)中克隆得到ALP type-B基因的上游1.664 bp啟動(dòng)子序列。應(yīng)用PLACE和plantCARE等數(shù)據(jù)庫分析了該1.664 bp啟動(dòng)子元件，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除具備啟動(dòng)子的基本元件TATA-box、CAAT-box外，還含有胚乳特異性表達(dá)的元件，如GCN4元件、TGTAAAG元件、Skn-motif元件、AACA元件等[23]（圖1）。

基于對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件序列的生物信息學(xué)分析，為了進(jìn)一步分析鑒定上述啟動(dòng)子元件的作用，以載體pBI121為基本框架，構(gòu)建了包括ALP type-B基因上游1，664 bp序列及4個(gè)分別含有不同序列長度的5′端缺失啟動(dòng)子序列999、785、550和290 bp在內(nèi)的5個(gè)雙元表達(dá)載體，并以其長度為基礎(chǔ)分別命名為載體pALP-17、pALP-10、pALP-8、pALP-6和pALP-3，表達(dá)載體的報(bào)告基因均是GUS基因（圖2）。

2.2 類燕麥儲(chǔ)藏蛋白Avenin-like基因啟動(dòng)子的特異性表達(dá)分析 將上述5個(gè)pALP-17、pALP-10、pALP-8、pALP-6和pALP-3雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化于煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，其中轉(zhuǎn)化pALP-3、pALP-8和pALP-10表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株各5株，轉(zhuǎn)化pALP-6表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株4株，轉(zhuǎn)化pALP-17表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株19株。

對(duì)獲得的T0代陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢測(cè)，進(jìn)行定性研究，其原理是報(bào)告基因GUS（β-葡聚糖苷酶）可將X-Gluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，因此具有GUS活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點(diǎn)，可用肉眼或顯微鏡觀察到。證實(shí)ALP type-B基因啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在煙草胚乳中表達(dá)，但在煙草其他組織如根、莖、葉和花中并未檢測(cè)到報(bào)告基因GUS基因的表達(dá)。然后對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行GUS熒光定量分析，其中轉(zhuǎn)化有pALP-3的種子GUS活性達(dá)到273.06 nmol/（mg蛋白·hr），這個(gè)值是陰性對(duì)照種子[14.25 nmol/（mg蛋白·hr）]的近20倍，說明prolamin-box元件可以保持啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在胚乳中本底水平的表達(dá)；同時(shí)研究證明隨著啟動(dòng)子序列長度的增加，至-785 bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因達(dá)到最高GUS活性即447.86 nmol/（mg蛋白·hr），推測(cè)ESP-like元件與RY motif元件可能共同作用構(gòu)成一個(gè)強(qiáng)胚乳特異性上調(diào)元件；而后則逐漸降低直至173.68 nmol/（mg蛋白·hr），由此推測(cè)在-785 bp啟動(dòng)子上游和下游，分別有較強(qiáng)的下調(diào)和上調(diào)順式作用元件，而G-box并未發(fā)揮其遠(yuǎn)端上調(diào)作用[22]。

3 需要進(jìn)一步研究的工作

對(duì)各顯著啟動(dòng)子元件進(jìn)行缺失突變分析和點(diǎn)突變分析，并對(duì)含有潛在的顯著上調(diào)、下調(diào)順式作用元件的區(qū)段進(jìn)行更加精細(xì)地截取并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。

以轉(zhuǎn)基因小麥為材料，通過凝膠組織分析鑒定具有顯著上調(diào)、下調(diào)作用順式作用元件的特異結(jié)合蛋白，以期找到新的反式作用因子，為深入研究小麥胚乳特異性表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供新方向。

通過基因槍法將pALP-17載體轉(zhuǎn)入小麥，進(jìn)一步明確該小麥ALP type-B基因啟動(dòng)子在禾本科植物中的表達(dá)特性，為該啟動(dòng)子在基因工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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