三球懸鈴木果球離體培養(yǎng)與再生體系的建立*

崔明珠，張娜娜，田保明，李云玲，劉世超，曹剛強，位芳

(鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450001)

懸鈴木 (Platanus orientalis)為懸鈴木科 (Platanaceae)懸鈴木屬 (Platanus)落葉大喬木，原產(chǎn)于東南歐、印度及美洲，屬下約7種。中國引入栽培3種，分別為一球懸鈴木 (P.occidentalis Linn.)、二球懸鈴木 (P.acerifolia Willd.)、三球懸鈴木。三球懸鈴木又名法國梧桐，樹姿優(yōu)美，冠大蔭濃，遮蔭效果良好，是著名的行道樹;可吸塵、抗菌、凈化空氣，是良好的園林綠化樹種，且其木材也可用作建筑和家具用材［1］。

目前，國內(nèi)外已對多種園林綠化木本植物的離體植株再生和育種進行過研究，有關(guān)懸鈴木再生體系的研究也有多篇報道，鄒永梅等［2～3］、蔡曉明等［4］、Tao等［5］、Sun 等［6］分別以當年生枝條、2－3年生枝條和葉片為外植體建立了北美一球懸鈴木植株再生體系，查向浩等［7］、王磊等［8］、李思等［9］、Li等［10］、劉國鋒等［11～13］分別以二球懸鈴木的單芽莖段、葉片及下胚軸為起始外植體進行不定芽的誘導，建立了植株再生體系。其中，供試材料基因型及外植體來源較為復雜，且鮮有三球懸鈴木再生體系［14～15］的報道。鑒于此，本實驗以三球懸鈴木成熟果球為材料，探討了不同消毒方式、無機鹽濃度對其種子萌發(fā)的影響，以及葉齡、光照對葉片愈傷組織誘導和植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對不定芽分化的影響，初步建立三球懸鈴木果球離體培養(yǎng)技術(shù)及高效的葉片再生體系，以期為促進三球懸鈴木離體植株再生和苗木的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鄭州大學校園內(nèi)生長健壯的6年生三球懸鈴木的成熟果球。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子消毒

剝離果球中的種子，先用自來水沖洗1 h，再用含洗滌劑的溶液揉洗10 min，然后用自來水沖洗干凈。用無菌濾紙吸干種子表面水分后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用含少量Tween-20的10%H2O2進行不同時間 (5 min、10 min、15 min、20 min)的消毒處理，然后將種子分別播種于EX培養(yǎng)基(與李思等［9］的種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基成分相同)和MS［16］培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng) (光照強度1 500 Lx、光周期16時/天、溫度25℃)45天后，觀察無菌苗的生長狀況，統(tǒng)計種子的萌發(fā)率和污染率，分析消毒時間、無機鹽濃度對無菌苗種子萌發(fā)的影響。萌發(fā)率=(萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù))×100%，污染率=(污染種子數(shù)/種子總數(shù))×100%。每次處理統(tǒng)計30粒種子，重復3次。

1.2.2 愈傷組織誘導

將不同葉齡 (20天、30天、40天、50天、60天)的三球懸鈴木無菌苗葉片，用解剖刀去掉葉尖及葉柄，在遠軸面輕輕地劃3刀，遠軸面向下，分別接種于愈傷誘導培養(yǎng)基 (MS+IBA 0.1 mg/L+KT 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L)上，先在25℃黑暗條件下培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng) (光照強度1 500 Lx、光周期 16時/天、溫度 25℃)。其中，葉齡40天的葉片，光照條件設(shè)2個處理:A為直接光照培養(yǎng);B為黑暗培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。每2周繼代1次。30天后，統(tǒng)計葉片的愈傷組織誘導率，分析葉齡和光照條件對葉片愈傷組織誘導率的影響。愈傷組織誘導率=(出愈外植體數(shù)/接種總外植體數(shù))×100%。每次處理統(tǒng)計25個外植體，重復3次。

1.2.3 不定芽分化

誘愈培養(yǎng)30天后，將40天葉齡的經(jīng)暗培養(yǎng)處理的葉片愈傷組織分別接種于分化培養(yǎng)基 (MS基本培養(yǎng)基，添加 0.1～1.0 mg/L IBA、0.1～1.0 mg/L KT、0.5～1.5 mg/L 6-BA，蔗糖 30 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8)上，光照培養(yǎng) (光照強度1 500 Lx、光周期16時/天、溫度25℃)。每2周繼代1次。30天后，統(tǒng)計葉片愈傷組織的不定芽分化率，分析植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對葉片愈傷組織不定芽分化的影響。不定芽分化率=(出芽愈傷數(shù)/接種總愈傷數(shù))×100%。每次處理統(tǒng)計20塊愈傷組織，重復3次。

1.2.4 壯苗培養(yǎng)

待不定芽長至3～5 cm，于超凈工作臺中，用解剖刀將不定芽連帶少許愈傷組織單個切下，繼代于新鮮的分化培養(yǎng)基上，繼續(xù)光照培養(yǎng) (光照強度1 500 Lx、光周期16時/天、溫度25℃)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007統(tǒng)計分析作圖，并采用SPSS 21.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三球懸鈴木果球離體培養(yǎng)和無菌苗的獲得

2.1.1 污染問題

在培養(yǎng)初期，因三球懸鈴木種子較小，果毛較多，種皮較厚，利用常規(guī)的消毒方法 (0.1%HgCl2消毒10 min和 10%NaClO消毒20－30 min)消毒后，萌發(fā)過程中仍污染嚴重，即使延長消毒時間，污染仍然嚴重，且由于消毒劑對種子長時間的毒害作用，導致種子萌發(fā)率低，無菌苗長勢差，生長緩慢，褐化嚴重，阻止了離體培養(yǎng)無菌苗在短時間內(nèi)的獲得，成為系統(tǒng)構(gòu)建三球懸鈴木再生體系的重大障礙。H2O2毒性較小，且低濃度有打破種子休眠作用。圖1表明，使用H2O2作為消毒劑，隨著消毒時間的增加，種子污染率下降，萌發(fā)率也隨之降低，當消毒時間為10 min時，可在不影響萌發(fā)率的前提下將污染率降到最低，且無菌苗長勢較好，組培苗無褐化現(xiàn)象。

圖1 H2O2不同消毒時間對三球懸鈴木種子污染率和萌發(fā)率的影響注:圖中同組數(shù)據(jù)字母完全不同時，表示在P﹤0.05水平差異顯著，下同。Fig.1 Effect of sterilization time on seed contamination rate and germination rate of mature fruit seeds

2.1.2 種子萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選

N是構(gòu)成蛋白質(zhì)的重要元素，K是細胞的生化反應(yīng)緩液，兩者均是植物細胞正常生長的必需元素之一。不同的植物或同一植物的不同外植體的最適用量不同。本實驗三球懸鈴木的萌發(fā)培養(yǎng)基為EX和MS培養(yǎng)基，二者無機鹽含量不同 (表1)。

表1 MS和EX培養(yǎng)基中部分大量元素的濃度配比Tab.1 The concentration ratio of a part of macronutrien in the MS and EX medium mmol·L－1

圖2 不同培養(yǎng)基的無菌苗萌發(fā)注:a為MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的無菌苗;b為EX培養(yǎng)基上萌發(fā)的無菌苗Fig.2 Mature fruit seeds germinated on different media

圖2表明，在含低鹽成分的EX培養(yǎng)基上萌發(fā)的無菌苗葉片翠綠、健壯;而在含高鹽成分的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)的無菌苗葉片發(fā)黃、瘦弱。故EX培養(yǎng)基可選作三球懸鈴木種子萌發(fā)的培養(yǎng)基。

2.2 三球懸鈴木葉片愈傷組織的誘導

2.2.1 葉齡對葉片愈傷組織誘導率的影響

研究表明［9～12］，較幼嫩的外植體容易脫分化形成愈傷組織，再分化形成芽，可獲得較高的再生率。不同葉齡三球懸鈴木葉片愈傷組織的誘導結(jié)果見圖3。從圖3可知，葉齡為30天以下及50天以上的葉片，其愈傷組織誘導能力明顯低于30－50天葉齡的葉片;30－50天葉齡的葉片較易形成愈傷組織，且40天葉齡的葉片愈傷組織誘導率最高，可達89.33%。生長初期的低齡葉片，體積較小，接種后易卷曲，褐變而死亡;而苗齡增大到一定程度，葉片柔嫩度降低，纖維含量增大，組培苗逐漸木質(zhì)化，愈傷組織誘導率降低，分化能力也隨之下降。

圖3 葉齡對三球懸鈴木葉片愈傷組織誘導率的影響Fig.3 Effect of explant age on leaf callus induction rate

2.2.2 光照條件對葉片愈傷組織誘導率的影響

George等［17］認為黑暗條件下，可減少外植體酚類物質(zhì)的釋放，減輕褐化，從而利于再生。黑暗和光照條件下，三球懸鈴木葉片愈傷組織誘導結(jié)果見圖4。由圖4可知，光照條件對三球懸鈴木葉片的脫分化很重要，暗培養(yǎng)能顯著促進愈傷組織的形成。黑暗培養(yǎng)7天后葉片葉脈處開始明顯膨大，能夠快速形成青綠色、淡黃色或紅褐色的緊實、生長狀態(tài)良好的愈傷組織 (圖5b);直接光照培養(yǎng)的葉片則容易干枯、褐化，較難形成愈傷組織，且形成的愈傷組織脆化，延長培養(yǎng)時間，很容易死亡。經(jīng)過黑暗培養(yǎng)的葉片愈傷組織誘導率比光照培養(yǎng)的葉片高出約30.67%。

圖4 光照條件對葉片愈傷組織誘導率的影響Fig.4 Effect of light on leaf callus induction rate

圖5 三球懸鈴木離體植株再生注:a為種子萌發(fā)培養(yǎng)45天后的無菌苗;b為葉片葉脈處膨大，形成愈傷組織;c為葉片愈傷組織分化出叢生芽;d為不定芽壯苗培養(yǎng)后，形成單棵植株Fig.5 In vitro plantlet culture and shoot regeneration

2.3 三球懸鈴木葉片愈傷組織不定芽的分化

植物生長調(diào)節(jié)劑配比對葉片愈傷組織的不定芽分化影響大。由表2可知，各組合均能使葉片愈傷組織分化出不定芽。不同濃度的IBA對不定芽的分化存在差異。IBA濃度為0.1 mg/L時，不定芽分化率高，隨著IBA質(zhì)量濃度的增大，不定芽分化率明顯降低。本實驗最終以添加IBA 0.1 mg/L、KT 1.0 mg/L和6-BA 1.5 mg/L的培養(yǎng)基作為三球懸鈴木組培苗的分化培養(yǎng)基，其不定芽分化率為66.67%。愈傷組織在轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上后，便開始分化出不定芽，隨著培養(yǎng)時間的延長，不定芽數(shù)量增多，單生芽增殖為叢生芽 (圖5c)。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對葉片愈傷組織不定芽分化率的影響Tab.2 Effect of different hormone combinations on adventitious bud induction

3 結(jié)論與討論

選擇合適的外植體是建立再生體系的重要前提。植物不同時期、不同部位、不同來源的材料都可以作為再生體系建立的外植體。懸鈴木的再生多以當年生枝條［2，7～8］、2－3 年生枝條［6］、葉片［14～15，18］和下胚軸［12］為外植體，但當年生或2－3年生枝條的取材易受季節(jié)限制，而下胚軸又不易大量獲得。三球懸鈴木果球成熟后，可長期保存，本實驗采用無菌苗葉片作為再生外植體，將成熟果球上剝離的種子用75%乙醇浸泡30 s，含少量Tween-20的10%H2O2消毒10 min后，播種于低鹽成分的EX培養(yǎng)基上，可明顯提高其種子的萌發(fā)率，為組織再生提供大量的外植體。用10%H2O2消毒處理時，時間過短，種子污染率大，時間過長，種子的萌發(fā)率急劇下降，因此選擇合適的消毒時間 (10 min)，才能在保證萌發(fā)率的前提下降低污染，該結(jié)果與周曉玲等［18］的研究相似。周曉玲等［18］還發(fā)現(xiàn)，降低MS用量對二球懸鈴木幼苗玻璃化有很好的防止作用，且幼苗粗壯，枝條高。本研究分別以低鹽培養(yǎng)基EX和高鹽培養(yǎng)基MS進行三球懸鈴木無菌幼苗的萌發(fā)實驗，也得到了相同的結(jié)果，降低無機鹽含量，三球懸鈴木無菌苗生長狀況更佳，葉片翠綠、健壯。

不同葉齡的葉片，木質(zhì)化程度不同，通常，較幼嫩的外植體容易脫分化，也容易再分化形成不定芽，可以得到比較高的出芽率。在本研究中，葉齡為20天和60天的葉片，愈傷組織誘導率明顯低于30－50天葉齡的外植體，且以40天最高，這與王磊等［8］的研究結(jié)果葉齡35－60天的二球懸鈴木試管苗葉片適于再生，40天分化率最高相同。光照條件對葉片的脫分化有重要影響，葉片先經(jīng)過7天的黑暗培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，愈傷組織誘導率比直接光照培養(yǎng)的高約30.67%，且愈傷組織致密、生長狀態(tài)良好，不易褐化死亡。這與劉國鋒等［12］的研究結(jié)果強光會抑制愈傷組織的形成和生長，進而不利于芽的分化是一致的。此外，王磊等［8］也報道經(jīng)歷黑暗培養(yǎng)，可以促進不定芽的分化。

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響懸鈴木再生效果的關(guān)鍵因素之一。周曉玲等［18］研究發(fā)現(xiàn)生長素類似物NAA、IAA對二球懸鈴木子葉愈傷組織的分化有促進作用。本研究對三球懸鈴木葉片愈傷組織的不定芽誘導選取KT、IBA、6-BA等3種植物生長調(diào)節(jié)劑的不同組合進行實驗得出最佳配比，也發(fā)現(xiàn)生長素類似物IBA的濃度對三球懸鈴木愈傷組織的不定芽誘導有顯著影響，但隨著IBA濃度的增高，愈傷組織芽誘導率下降，該結(jié)果與查向浩等［7］、Liu 等［11］、范國強等［15］的研究結(jié)果一致。

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