我國(guó)假肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良征防控的技術(shù)路徑與優(yōu)生策略選擇

江雨 周裕林

（廈門市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建廈門 361003）

我國(guó)假肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良征防控的技術(shù)路徑與優(yōu)生策略選擇

江雨 周裕林*

（廈門市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，福建廈門 361003）

l 背景介紹

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良征（Duchenne and Becker muscular dystrophy，DMD／BMD）是全球最常見(jiàn)的X-連鎖隱性致死性基因疾病之一，男嬰發(fā)生率約為1／3500［1］。臨床上根據(jù)發(fā)病年齡及病程差異，將患者分為杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD），兩者都是由于編碼抗肌萎縮蛋白（dystrophin）的DMD基因存在缺陷而致病的。該基因定位于性染色體Xp21.2區(qū)域，是人類目前已知的最大基因，長(zhǎng)度約為2.4Mb，包含79個(gè)外顯子?；颊呋蛉毕莸闹饕愋桶ㄍ怙@子缺失、重復(fù)及基因微小突變。

自被定義以來(lái)的近一個(gè)半世紀(jì)，DMD至今仍無(wú)治愈方法，患者生存質(zhì)量普遍不佳［2］。因此，針對(duì)疾病遺傳機(jī)制及防控手段的研究一直是這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Konda及Tsubaki［3］于1973年首次報(bào)道了對(duì)DMD高危孕婦實(shí)施產(chǎn)前診斷。自此之后，伴隨臨床取材與診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，包括胎兒性別鑒定、胎兒肌肉活檢術(shù)、臍帶血肌酸磷酸激酶檢測(cè)、熒光原位雜交［4］及各類分子診斷技術(shù)先后被用于DMD的產(chǎn)前診斷中。對(duì)具有家族史的高危孕婦實(shí)施遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷，避免新生患兒出生成為現(xiàn)今全球DMD防控的基本策略。而隨著分子診斷技術(shù)的日趨成熟，基因檢測(cè)已成為當(dāng)前DMD疾病診斷及產(chǎn)前診斷的重要手段。

先天缺陷的防治是世界衛(wèi)生組織考量一國(guó)或一地區(qū)社會(huì)發(fā)展水平的重要指標(biāo)，目前全球不少發(fā)達(dá)國(guó)家及地區(qū)將控制先天性缺陷作為社會(huì)發(fā)展整體戰(zhàn)略規(guī)劃之一。但總體而言，世界各國(guó)及各地區(qū)在這一領(lǐng)域的發(fā)展水平極不均衡，尤其在發(fā)展中國(guó)家，受限于醫(yī)療資源短缺等因素，包括DMD在內(nèi)的眾多先天缺陷防控形式不容樂(lè)觀。作為全球最大的發(fā)展中國(guó)家，由于在疾病宣傳、保健、教育、預(yù)防等方面長(zhǎng)期滯后，中國(guó)在DMD患者的確診率、患者生存周期、家族成員接受遺傳優(yōu)生服務(wù)比率等諸多方面與發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)存在著較大差距。據(jù)估算，全國(guó)DMD患者累積數(shù)量至今已超過(guò)10萬(wàn)，且每年新出生患兒多達(dá)數(shù)千。本文之目的在于試圖分析導(dǎo)致這一現(xiàn)狀的根源，同時(shí)結(jié)合作者所在醫(yī)院的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，嘗試提出適應(yīng)我國(guó)國(guó)情的DMD分子診斷技術(shù)路徑及遺傳優(yōu)生策略，以期為我國(guó)DMD防控工作的推進(jìn)提供借鑒。

2 國(guó)內(nèi)DMD防控基礎(chǔ)薄弱因素

從20世紀(jì)70年代起，國(guó)內(nèi)陸續(xù)有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注于DMD的相關(guān)研究，此后在一些大中城市的高等級(jí)綜合醫(yī)院或婦幼保健院開(kāi)展了DMD臨床診斷或產(chǎn)前診斷服務(wù)。時(shí)至今日，雖歷經(jīng)40余年的探索與發(fā)展，且取得了一些成效，但相較于龐大的患者人群，我國(guó)在DMD的遺傳咨詢及優(yōu)生服務(wù)供應(yīng)能力上仍顯得十分薄弱?，F(xiàn)實(shí)中，患者往往需要輾轉(zhuǎn)數(shù)家醫(yī)院尋求確診。以作者單位所在的福建省為例，人口數(shù)量約4000萬(wàn)的全省僅有兩家醫(yī)療機(jī)構(gòu)具備DMD產(chǎn)前診斷能力。按照?qǐng)?bào)道的發(fā)生率估算，該省每年新出生的DMD患兒數(shù)約在50例左右，患者總數(shù)應(yīng)已累計(jì)達(dá)數(shù)千例。而實(shí)際上，作者所在醫(yī)院自2007年開(kāi)展DMD臨床基因檢測(cè)以來(lái)，至今僅確診32個(gè)DMD病例家系（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。因而有理由推斷，該省仍有為數(shù)眾多的患者可能由于各種原因而未能獲得及時(shí)準(zhǔn)確的診斷。作為經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展相對(duì)發(fā)達(dá)的沿海省份尚且如此，全國(guó)面臨的總體現(xiàn)狀可見(jiàn)一斑。事實(shí)上，我國(guó)至今未出臺(tái)罕見(jiàn)疾病的官方定義，未制定任何正式的遺傳咨詢相關(guān)政策及指導(dǎo)性文件，相關(guān)政策法規(guī)的欠缺和不完善是導(dǎo)致我國(guó)在類似DMD等罕見(jiàn)疾病防控基礎(chǔ)薄弱的根本原因。而政策法規(guī)的不完善進(jìn)而導(dǎo)致一系列與此相關(guān)的各環(huán)節(jié)進(jìn)展緩慢。這其中，以下兩個(gè)問(wèn)題顯得尤為突出：首先，人才儲(chǔ)備的不足已成為制約我國(guó)遺傳病防控的首要原因，目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)學(xué)院校未開(kāi)設(shè)專門的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)專業(yè)，同時(shí)也無(wú)專門的機(jī)構(gòu)進(jìn)行遺傳咨詢師的認(rèn)證與考核，致使全國(guó)至今幾無(wú)醫(yī)院設(shè)置專門的遺傳咨詢門診，絕大多數(shù)先天缺陷或遺傳病患者只能根據(jù)其臨床表征尋求對(duì)癥科室的診療，而由于并未受過(guò)系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)訓(xùn)練，多數(shù)臨床醫(yī)師對(duì)此類疾病的癥狀及發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)模糊，誤診、漏診現(xiàn)象十分常見(jiàn)［5，6］；其次，我國(guó)目前實(shí)施的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與產(chǎn)前診斷的的準(zhǔn)入機(jī)制事實(shí)上也已成為罕見(jiàn)病防控的另一阻礙因素，21世紀(jì)以來(lái)，臨床分子診斷水平極速發(fā)展，包括DMD在內(nèi)的不少先天疾病的臨床診斷技術(shù)已趨于成熟，然而因未能符合我國(guó)當(dāng)前實(shí)施的臨床技術(shù)準(zhǔn)入制度，以致大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)，尤其是公立醫(yī)院，即便已然具備技術(shù)儲(chǔ)備，卻因顧及法律及政策風(fēng)險(xiǎn)而不愿貿(mào)然開(kāi)展，拒診病患的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。

依上可見(jiàn)，相關(guān)行政部門應(yīng)盡快制訂先天缺陷、基因疾病的臨床應(yīng)用服務(wù)規(guī)范，扭轉(zhuǎn)長(zhǎng)期以來(lái)重治療、輕預(yù)防的固有思維模式，同時(shí)加大罕見(jiàn)病的宣傳、教育和投入，才能從根本上為患者及醫(yī)務(wù)人員提供保障。

3 DMD分子診斷技術(shù)選擇

除政策法律因素外，DMD遺傳異質(zhì)性及診斷技術(shù)的多樣性，客觀上也對(duì)準(zhǔn)備開(kāi)展此類服務(wù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)提出了較高的技術(shù)和管理要求。目前，臨床上常用的DMD的診斷方法包括血液生化檢測(cè)、肌電圖分析、肌肉活檢及分子診斷等。由于缺少權(quán)威的技術(shù)指導(dǎo)，國(guó)內(nèi)部分已開(kāi)展DMD臨床診斷服務(wù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)往往根據(jù)自身?xiàng)l件選擇一類或幾類技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)，并未形成統(tǒng)一的實(shí)施規(guī)范。其中，即便是如今已被普遍公認(rèn)為疾病確診主要依據(jù)的分子診斷技術(shù)，各自的選擇也往往并不一致，客觀上造成了不同診斷機(jī)構(gòu)在疾病確診率上的差異。目前常見(jiàn)的DMD分子診斷方法主要包括多重 PCR（multiplex- PCR，m PCR）、多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，ML PA），變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DH PLC）、Sanger測(cè)序及用以連鎖分析的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）技術(shù)。診斷機(jī)構(gòu)在選擇技術(shù)的過(guò)程中，需了解每一類技術(shù)在DMD診斷中存在各自的優(yōu)勢(shì)及缺陷，見(jiàn)表1。

3.1 多重 PCR 據(jù)統(tǒng)計(jì)，約50%～65%的DMD／BMD患者為DMD基因外顯子缺失所致，因而對(duì)此類基因型的排查往往成為臨床DMD分子診斷的優(yōu)先考量。由于無(wú)需復(fù)雜的大型儀器設(shè)備，且具備操作簡(jiǎn)易、成本低的優(yōu)勢(shì)，多重 PCR成為國(guó)內(nèi)部分開(kāi)展DMD臨床分子診斷醫(yī)院的選擇［7-9］。相較于優(yōu)勢(shì)，該方法的缺點(diǎn)亦較突出，一是檢測(cè)范圍無(wú)法覆蓋DMD基因所有外顯子；二是無(wú)法檢出女性攜帶者。此外，凝膠電泳過(guò)程也較易導(dǎo)致 PCR產(chǎn)物的污染，并進(jìn)而影響到后續(xù)診斷的可靠性。

3.2 連鎖分析 連鎖分析的原理是通過(guò)親代與先證者基因標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性，建立突變基因與標(biāo)記等位基因的連鎖相，從而對(duì)其他親屬或下一次妊娠胎兒的基因型進(jìn)行判斷。DMD連鎖遺傳分析一般選擇DMD基因兩端及內(nèi)含子區(qū)短串聯(lián)重復(fù)序列［10］。其主要優(yōu)點(diǎn)在于當(dāng)無(wú)法通過(guò)其他技術(shù)獲得先證者基因型時(shí)，可通過(guò)連鎖相得到的基因單體型信息判斷后代的疾病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。但需要注意的是，在某些情況下，使用該技術(shù)可能出現(xiàn)因多態(tài)信息量不足而無(wú)法分析的情況。此外，如果基因在減數(shù)分裂中發(fā)生了重組，或先證者為單純散發(fā)病例，若仍依據(jù)原先的連鎖相確定受檢者的基因型，就有誤診的可能性。因此在臨床實(shí)踐中，為提高診斷的可靠性，連鎖分析一般需與其他分子診斷技術(shù)聯(lián)合使用［11］。3.3 ML PA 該技術(shù)是2002年由Schouten等［12］開(kāi)發(fā)的一種中通量基因拷貝數(shù)分析方法。作為目前唯一的商品化DMD基因檢測(cè)方案，該技術(shù)可在2個(gè) PCR反應(yīng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)DMD基因所有外顯子的拷貝數(shù)信息分析。ML PA對(duì)由外顯子拷貝數(shù)異常導(dǎo)致的患者及攜帶者均具有較佳的檢測(cè)靈敏度。另外，對(duì)處于探針雜交或連接位點(diǎn)的微小基因突變，該技術(shù)也具有一定的檢出能力。隨著毛細(xì)管電泳設(shè)備的日益普及，ML PA事實(shí)上已成為當(dāng)前全球DMD臨床診斷的首選方案［13，14］，在國(guó)內(nèi)已開(kāi)展DMD基因診斷的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中，亦多為采用。但需注意的是，對(duì)于因基因微小突變所致的病患，多數(shù)情況下ML- PA無(wú)法檢出。此外，對(duì)于經(jīng)ML PA診斷為單外顯子缺失型病例，需通過(guò)其他方法進(jìn)一步區(qū)分屬于外顯子部分序列的缺失，還是因探針雜交或連接位點(diǎn)的突變所致［15］。

表l DMD基因診斷技術(shù)比較

3.4 DH PLC 變性高效液相色譜是一類在單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SN P）研究中常見(jiàn)的分析技術(shù)。盡管同時(shí)具有基因拷貝數(shù)分析功能，但受限于檢出能力［16］，在DMD診斷中，該技術(shù)主要被用于基因微小突變篩查［17-19］。由于并非對(duì)核酸序列的直接測(cè)定，故經(jīng)DH PLC檢測(cè)提示陽(yáng)性結(jié)果者，需進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。因此總體而言，盡管DH PLC的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)成本相對(duì)較低，然而由于局限較多、穩(wěn)定性易受干擾，因而多用于學(xué)術(shù)研究而鮮見(jiàn)于臨床診斷。

3.5 Sanger測(cè)序 同DH PLC類似，Sanger測(cè)序在DMD遺傳分析中主要針對(duì)于基因的微小變異［20］。其相較于前者的優(yōu)勢(shì)在于，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的病理性突變可直接作為基因診斷的結(jié)論。其缺點(diǎn)是成本較高、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，此外如果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的覆蓋范圍僅限外顯子區(qū)域，則由內(nèi)含子突變導(dǎo)致的DMD無(wú)法檢出。

3.6 高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，H TS） 由于DMD基因變異類型的多樣性，上述幾類技術(shù)在DMD的診斷中不同程度的存在檢出能力不足的問(wèn)題。有鑒于此，臨床上亟需一種可覆蓋所有DMD突變類型的檢測(cè)技術(shù)，而隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和成熟為這一問(wèn)題的解決提供了可能。近年來(lái)，已有學(xué)者嘗試將高通量測(cè)序應(yīng)用于DMD的疾病診斷［21-23］，并取得了良好的效果。缺點(diǎn)是現(xiàn)階段仍受技術(shù)準(zhǔn)入及成本等制約，預(yù)計(jì)在國(guó)內(nèi)的大規(guī)模臨床應(yīng)用尚需時(shí)日。

4 DMD臨床咨詢、診斷及遺傳優(yōu)生策略

遺傳咨詢的主要目標(biāo)有兩點(diǎn)，一是判斷疾病是否屬于遺傳，二是評(píng)估疾病在患者家系后代的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。相較于我國(guó)南方較為常見(jiàn)的地中海貧血等遺傳疾病，除患者的基因變異類型存在多樣性外，人群中DMD的發(fā)生方式也具有異質(zhì)性。患者基因突變可能源于親代伴性遺傳、親代生殖腺嵌合，或是單純散發(fā)。DMD突變類型及遺傳方式的這些特點(diǎn)對(duì)臨床遺傳咨詢及診斷策略的選擇提出了一定的挑戰(zhàn)。然而由于國(guó)內(nèi)長(zhǎng)期無(wú)相關(guān)臨床操作規(guī)范可供醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)施借鑒，導(dǎo)致不少誤診、漏診的情況發(fā)生。有鑒于此，作者所在單位參照歐洲多個(gè)國(guó)家聯(lián)合發(fā)布的DMD產(chǎn)前診斷實(shí)踐指南［24］，同時(shí)結(jié)合自身臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出如下操作建議。

4.1 知情同意原則 臨床實(shí)施DMD基因診斷的一個(gè)重要前提是須向就診者說(shuō)明所采用技術(shù)的局限性。由于ML PA檢出范圍僅限于基因的大片段缺失、重復(fù)及少數(shù)微小突變，因此有部分患者或其親屬可能無(wú)法通過(guò)該技術(shù)發(fā)現(xiàn)致病基因變異，而對(duì)擬接受高通量測(cè)序等技術(shù)進(jìn)一步排查者，亦需說(shuō)明存在不能檢出致病突變的可能性。（圖1）

4.2 先證者／攜帶者基因檢測(cè)策略 綜合疾病檢出率及檢測(cè)成本等因素考量，具備條件的醫(yī)院機(jī)構(gòu)現(xiàn)階段應(yīng)考慮以ML PA為一線DMD基因篩查技術(shù)。需要注意的是，對(duì)于ML PA提示為單外子缺失的結(jié)果，需進(jìn)一步驗(yàn)證；對(duì)臨床高度懷疑為患者或攜帶者，如ML PA檢測(cè)為陰性，可建議其進(jìn)一步行高通量測(cè)序檢測(cè)（圖1）。

圖l DMD基因診斷流程圖

4.3 DMD產(chǎn)前診斷策略 針對(duì)預(yù)行產(chǎn)前診斷者，應(yīng)同時(shí)獲知先證者及其本人基因型，對(duì)于因先證者病逝等原因無(wú)法獲取樣本、并無(wú)法獲知先證者基因型信息的情況下，如受檢者為體細(xì)胞DMD攜帶者，則建議實(shí)施產(chǎn)前診斷；如在可供選擇的檢測(cè)范圍內(nèi)未檢出體細(xì)胞攜帶致病突變，則應(yīng)向其說(shuō)明后代再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，尤其是針對(duì)曾經(jīng)生育基因突變明確患兒的高風(fēng)險(xiǎn)女性，需告之存在生殖腺嵌合的可能，并由其本人知情選擇是否實(shí)施產(chǎn)前診斷（圖2）。

5 DMD遺傳優(yōu)生發(fā)展趨勢(shì)

圖2 DMD產(chǎn)前診斷實(shí)施流程圖

盡管侵入性的產(chǎn)前診斷方式已十分成熟，但現(xiàn)實(shí)中，仍有部分母體或胎兒在取樣過(guò)程或鑒定為患癥胎兒后實(shí)施的引產(chǎn)術(shù)中發(fā)生損害。因而，如何在優(yōu)生過(guò)程中盡可能減少對(duì)母胎的影響是近階段胎兒醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。這其中，無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷及植入前診斷是這一領(lǐng)域中有望獲得突破的兩個(gè)領(lǐng)域。

5.1 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷 所謂無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，是指采用抽取孕婦外周血等非侵入性方式獲取胎兒的遺傳物質(zhì)、并對(duì)其進(jìn)行遺傳分析的技術(shù)手段。根據(jù)獲得的胎兒遺傳物質(zhì)的類型，從孕婦循環(huán)血液中可供分離的胎兒遺傳物質(zhì)包括胎兒有核紅細(xì)胞（nucleated red blood cells，NRBCs）及胎兒游離DNA片段這兩類。兩者之中，由于胎兒有核紅細(xì)胞中包含有完整的胎兒遺傳信息，因而在高通量測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)之前是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究的重要方向［25］。然而時(shí)至今日，胎兒有核紅細(xì)胞的富集技術(shù)一直未獲得實(shí)質(zhì)性的突破，故短期間該技術(shù)難以被應(yīng)用于臨床。與此同時(shí)，高通量測(cè)序技術(shù)在近十年來(lái)取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并且在檢測(cè)成本上已趨近于患者可接受的水平。近年來(lái)，應(yīng)用高通量測(cè)序?qū)μビ坞xDNA的分析已成為DMD無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)研究領(lǐng)域的新動(dòng)向［26］。事實(shí)上，針對(duì)部分染色體非整倍體異常的高通量測(cè)序無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查項(xiàng)目，近年已在國(guó)內(nèi)獲得了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，預(yù)計(jì)在不遠(yuǎn)的將來(lái)，該技術(shù)也有望在DMD的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)突破。

5.2 植入前診斷 無(wú)論是侵入性還是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷，對(duì)胎兒基因型的確診仍需在胚胎發(fā)育到一定階段之后。如經(jīng)診斷發(fā)現(xiàn)胎兒基因存在缺陷，孕婦需面臨因終止妊娠而產(chǎn)生的身體及心理的雙重傷害。因此，對(duì)孕產(chǎn)婦及其家屬而言，如何避免胎兒攜帶缺陷基因更具有現(xiàn)實(shí)意義。植入前診斷是有望解決這一現(xiàn)實(shí)問(wèn)題的最佳手段，目前已有一些機(jī)構(gòu)已經(jīng)開(kāi)始嘗試DMD的植入前診斷研究并取得功［27］，隨著成果的不斷深入，相信這一領(lǐng)域的成果也終將為DMD的防控帶來(lái)根本性的解決之道。

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R746.4

A

2015-02-06）

編輯：宋文穎

10.13470／j.cnki.cjpd.2015.02.017

*通訊作者：周裕林，E-mail：yulin＿zhou＠126.com