甘草酸脂質(zhì)體的制備及小鼠體內(nèi)肝靶向效率的評價(jià)

扈本荃，廉江平，徐玥，王燕，張韞，張博

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，西安 710021;2.陜西省人民醫(yī)院藥劑科，西安 710068)

肝炎是危害人類健康的嚴(yán)重疾病之一，尤其是慢性肝炎可誘發(fā)肝硬化、肝癌等繼發(fā)疾病，目前仍缺乏治愈率高、療效穩(wěn)定的藥物。已有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，中草藥治療慢性乙型肝炎有潛在療效和明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢［1，2］。

近代研究發(fā)現(xiàn)［2］，甘草酸有直接的抗乙肝病毒HBV作用及對肝功能障礙的改善作用，從甘草根中提取的甘草酸及其衍生物可明顯減輕肝細(xì)胞脂肪壞死以及肝細(xì)胞間質(zhì)炎癥反應(yīng)，抑制肝細(xì)胞纖維增生以及促進(jìn)肝細(xì)胞再生等，是一種值得重視與推廣的慢性肝炎治療藥物。但因甘草酸難溶于水、生物利用度低、肝靶向性差等原因限制了甘草酸在臨床的實(shí)際應(yīng)用。

脂質(zhì)體是一種人工制備的攜有雙層包膜的磷脂質(zhì)微囊，是一種定向給藥載體，經(jīng)靜脈注射后，自然靶器官主要為肝臟，由此可提高局部藥物濃度并減少全身不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以脂質(zhì)體為載體，制備了甘草酸的肝靶向制劑，增加甘草酸在肝臟中的濃度，提高藥物的療效，增強(qiáng)了藥物的治療效果，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。本文采用RP－HPLC法測定了不同時(shí)間甘草酸在小鼠肝臟和血漿中的含量，以甘草酸注射劑為對照，以相對攝取率(re)、靶向效率(te)和峰濃度比(Ce)3個(gè)參數(shù)來評價(jià)脂質(zhì)體的肝靶向性評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級KM小鼠60只，雌雄各半，6～8周齡，體重在18～22 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(陜)2014 －002】，實(shí)驗(yàn)前禁食 24 h，但自由進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)于西安醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(陜)2010－002】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 儀器和試劑

島津LC－10A高效液相色譜系統(tǒng)，SPD－10Avp紫外檢測器、Class－vp 6.0工作站(日本島津);真空干燥箱(SHZ北京科偉永鑫試驗(yàn)儀器設(shè)備廠);150型超聲儀(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)，透射電子顯微鏡(JEM－2000EX，日本 Olympus公司)，GR－202型分析天平(十萬分之一，日本A＆D公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R201C上海申順生物科技有限公司)。

甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院與北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制，含量:≥98%，批號:MUST－12103101);甘草酸原料藥(陜西惠科植物開發(fā)有限公司，含量≥98%，批號:20131101);大豆卵磷脂(天津市津南區(qū)咸水沽工業(yè)園區(qū)，含量≥99%，批號:Q/12HB4742－2012);膽固醇(安徽天啟化工科技有限公司)、甘露醇(廣西南寧化學(xué)制藥有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號:F691A)。甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);純水(雙重蒸餾水)、其余試劑為分析純;使用前所有液體試劑均經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜濾過。

1.2 甘草酸脂質(zhì)體的制備

精密稱取卵磷脂100 mg，膽固醇100 mg，置于500 mL茄形瓶中，再加入氯仿15 mL，使其充分溶解后，加入甘草酸10 mg，將燒瓶放在超聲清洗器上超聲3次，每次3min，待甘草酸完全溶解后，加入直徑為1 mm的玻璃珠20粒。37℃水浴下，以70 r/min旋轉(zhuǎn)減壓除去氯仿，可見在燒瓶內(nèi)出現(xiàn)白色的半透膜，將燒瓶敞口放置，待氯仿完全揮發(fā)后置于真空干燥箱6～7 h，取出，加入6%甘露醇16 mL進(jìn)行水合，超聲3次，每次20 min，得乳白色半透明液體，依次經(jīng)過0.8 μm和0.45 μm 微孔濾膜過濾，分裝于適合的安瓿中，4℃條件下密閉避光保存。

1.3 甘草酸脂質(zhì)體小鼠體內(nèi)肝靶向性實(shí)驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為10組(其中實(shí)驗(yàn)組5組，對照組5組)，每組6只，實(shí)驗(yàn)組按12 mg/kg劑量小鼠尾靜脈注射甘草酸脂質(zhì)體，對照組鼠尾靜脈注射同劑量的以生理鹽水和二甲基亞砜混合液(v/v，8∶2)配制相同濃度甘草酸的注射劑。

給藥后 5、30、60、120、240 min 眼眶取血0.5 mL置于肝素抗凝管中，3000 r/min，離心10 min，分取血漿，于－20℃保存，待檢。

取血后，小鼠眼眶取血后，立即取出肝臟，挑去膽囊，用蒸餾水洗滌去血，并用濾紙吸干表面水份，精密稱重后按2 μL/mg的比例加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)勻漿，15000 r/min，離心 10 min，取肝漿(上清液)，－20℃保存，待檢.

1.4 RP-HPLC檢測小鼠肝臟和血中的甘草酸

1.4.1 生物樣本前處理

(1)血漿的前處理方法:取待測血漿100 μL，加入甲醇400 μL，用液體快速混合器渦旋2 min，離心(15000 r/min)10 min，取20 μL上清液進(jìn)樣分析。

(2)肝漿的前處理方法:取肝漿液100 μL，加入甲醇400 μL，其后處理步驟同上述“血漿處理方法”。

1.4.2 色譜條件

色譜柱:采用 Shim－pack VP－ODS色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－pH2.6 磷酸鹽緩沖液(69∶31);流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量20 μL。在上述色譜條件下，樣品的分離良好，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，見圖1。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取小鼠空白血漿及空白肝漿加入不同濃度甘草酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制成1.563 ～25 μg/mL甘草酸的血漿樣品和5～200 μg/mL甘草酸的肝漿樣品。按“1.4.1”項(xiàng)和“1.4.2”項(xiàng)條件對樣品處理并測定并按相關(guān)要求配制高、中、低三個(gè)濃度的模擬生物樣本進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證［3］。

圖1 甘草酸測定的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of glycyrrhizic acid in the mouse plasma and liver

1.5 小鼠體內(nèi)肝靶向性評價(jià)［4－8］

以各時(shí)間點(diǎn)藥物濃度均值繪制藥時(shí)曲線，以藥時(shí)曲線下面積(AUC)、血藥濃度(C)為定量指標(biāo)，通過相對攝取率(re)、靶向效率(te)和峰濃度比(Ce)3個(gè)參數(shù)來衡量脂質(zhì)體的組織靶向性。

式中AUClip表示脂質(zhì)體組藥時(shí)曲線下面積，AUCinj表示注射劑組藥時(shí)曲線下面積;AUCliver，表示肝組織藥時(shí)曲線下面積，AUCplasma表示血漿藥時(shí)曲線下面積;(Cmax)lip表示脂質(zhì)體組峰濃度，(Cmax)inj表示注射劑組峰濃度。re、Ce和 (te)靶向制劑/(te)非靶向制劑大于1時(shí)，藥物具有靶向性。

圖2 甘草酸脂質(zhì)體透射電鏡照片(×100)Fig.2 Photograph of glycyrrhizic acid liposomes under transmission electron microscope

2 結(jié)果

2.1 甘草酸脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)、包封率及載藥量的檢測［9，10］

取適量脂質(zhì)體采用磷鎢酸負(fù)染法于透射電鏡下檢測其形態(tài)，見圖2，制備得到的脂質(zhì)體球形圓整，大小均勻，粒徑大小在40～60 nm之間;取適量甘草酸脂質(zhì)體，通過透析技術(shù)分離未包封甘草酸，用RPHPLC法測定脂質(zhì)體包封率及載藥量，甘草酸脂質(zhì)體包封率為84%，載藥量為0.60 mg/mL;脂質(zhì)體4℃放置2個(gè)月未發(fā)現(xiàn)任何沉淀，仍為乳白色混懸液，粒徑未見明顯變化，穩(wěn)定性較好。

2.2 HPLC測定甘草酸的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

以甘草酸峰面積 (Y)對模擬樣品濃度C(μg/mL)作線性回歸，血藥濃度組和肝藥濃度組回歸方程(n=5)分別為:Y=0.000808C+0.934432 r=0.9999;Y=0.000825C + 0.25003 r=0.9996。

二者r值表明在5～200 μg/mL和1.5625～25 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1 精密度、回收率和穩(wěn)定性結(jié)果

按1.4制備好的樣品在l d內(nèi)反復(fù)進(jìn)樣測定5次，測得日內(nèi)精密度;每天進(jìn)樣一次，連續(xù)測定5d，測得日間精密度，結(jié)果見表1、2，結(jié)果表明，精密度和回收率滿足要求。

2.2.2 穩(wěn)定性結(jié)果

本試驗(yàn)考察了高中低濃度的甘草酸經(jīng)過血漿樣品和肝漿樣品處理后8 h內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果平均RSD為5.4%和3.6%，表明甘草酸過血漿樣品和肝漿樣品處理后在室溫條件下至少能穩(wěn)定8 h。

表1 血液中甘草酸的方法回收率和精密度(n=5)Tab.1 Results of method recovery rate and precision of glycyrrhizic acid in plasma

表2 肝臟中甘草酸的方法回收率和精密度(n=3)Tab.2 Results of method recovery rate and precision of glycyrrhizic acid in the mouse liver

2.3 小鼠體內(nèi)肝靶向性評價(jià)

靜注后小鼠肝臟內(nèi)與小鼠血中藥物濃度進(jìn)行t－檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)組肝臟中的濃度明顯高于對照組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組與對照組中血漿濃度無明顯差異(P＞0.05)，藥時(shí)－曲線見圖3、4。根據(jù)梯形法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組血漿和肝臟中的AUC。240 min內(nèi)甘草酸脂質(zhì)體在小鼠肝臟內(nèi)的AUC為16.42 min/(μg·mL)，在血液中的 AUC 為 177.75 min/(μg·mL)，甘草酸注射劑在小鼠肝臟內(nèi)的AUC為11.75 min/(μg·mL)，在血液中的 AUC 為 200.81 min/(μg·mL)。

圖3 血漿中甘草酸藥時(shí)曲線Fig.3 The plasma concentration－time curve of glycyrrhizic acid

240 min內(nèi)甘草酸脂質(zhì)體肝臟相對攝取率re=1.4(＞1)，表明脂質(zhì)體制劑可明顯提高藥物在肝組織中的分布;甘草酸脂質(zhì)體肝靶向效率te=0.092;甘草酸注射液te=0.059，脂質(zhì)體組是注射劑組的1.6倍。肝臟中Ce=1.59(＞1)，血液中Ce=0.99。以上結(jié)果表明，與甘草酸注射劑相比，甘草酸脂質(zhì)體有明顯的肝靶向性。

圖4 肝臟中甘草酸藥時(shí)曲線Fig.4 The liver concentration－time curve of glycyrrhizic acid in the mice

3 討論

小鼠體內(nèi)甘草酸脂質(zhì)體肝靶向評價(jià)參數(shù)相對攝取率re是脂質(zhì)體組和溶液組在器官的AUC的比值，re＞1表示脂質(zhì)體組在肝臟有靶向性，re值越大，靶向性越強(qiáng);靶向效率(te)是指各器官的AUC與血漿AUC的比值，te表示待測物對靶器官的選擇性，te越大，選擇性越強(qiáng)。峰濃度比是指脂質(zhì)體組和注射劑組在各組織的濃度C的比值，Ce表示脂質(zhì)體改變藥物在肝臟中分布的效果，Ce大于1則具有靶向性，越大則表明改變藥物分布的效果越明顯。

本實(shí)驗(yàn)測得甘草酸脂質(zhì)體在小鼠內(nèi)re為1.4，脂質(zhì)體組te是注射劑組的1.6倍;肝臟中Ce=1.59(＞1)，血液中Ce=0.99，各結(jié)果均表明甘草酸脂質(zhì)體有明顯的肝靶向性。

經(jīng)小鼠靜脈注射甘草酸脂質(zhì)體，小鼠肝臟的藥－時(shí)曲線并非是一條緩慢降低的平滑曲線，而是在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)有2個(gè)峰的曲線。形成這種現(xiàn)象的原因可能是甘草酸脂質(zhì)體制備過程中，未將游離甘草酸分離，脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)后游離甘草酸和脂質(zhì)體包裹甘草酸共同發(fā)揮作用。游離甘草酸進(jìn)入體內(nèi)后隨血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，迅速形成濃度曲線上的第一個(gè)峰值，隨后肝臟中甘草酸濃度開始降低;隨后肝臟的吞噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)體，甘草酸脂質(zhì)體在肝臟中富集并釋放藥物，形成濃度曲線上的第二個(gè)峰。

脂質(zhì)體作為一種有效的被動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)，利用磷脂形成的脂質(zhì)雙分子層囊泡包裹藥物分子，具有生物降解性和生物相容性，脂質(zhì)體對肝臟有天然的靶向性。脂質(zhì)體的被動(dòng)靶向主要是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用，大量研究表明，脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機(jī)體的自身免疫功能。并改變被包封藥物的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和體內(nèi)分布，使藥物主要分布在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞富集的器官，達(dá)到減小給藥劑量。降低毒性的效果［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與甘草酸注射液相比，脂質(zhì)體顯著增加了甘草酸在肝的分布，甘草酸脂質(zhì)體有明顯的肝靶向性。

RP－HPLC法測定血液及肝臟中甘草酸時(shí)，需要對血液和肝臟中的藥物進(jìn)行提取，提取溶劑的選擇:筆者曾考察了三個(gè)提取方法:①先用氯仿提取揮干的殘?jiān)?，再以甲醇?fù)溶;②飽和硫酸鋅甲醇溶液;③只用甲醇。但測定結(jié)果表明用①法甘草酸提取率太低，且引入內(nèi)源性雜質(zhì)太多;方法②和方法③提取效果相似，最終本實(shí)驗(yàn)選擇了方法以甲醇為提取溶酶。血漿和甲醇(蛋白沉淀劑作用)的比例經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，確定1∶4為理想比例。

甘草酸為酸性三萜皂甙類化合物，考慮到生物體內(nèi)的偏堿性環(huán)境可能使甘草酸成鹽(而變?yōu)殡x子態(tài))，而影響到提取溶劑的效率。因此，曾擬用酸性緩沖液來作為小鼠肝臟的勻漿液，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用酸性緩沖液作小鼠肝臟勻漿液，會(huì)引入過多的雜質(zhì)，造成雜質(zhì)峰過多而使主峰難以得到滿意的分離。最后，采用pH為7.4磷酸鹽緩沖液作為小鼠肝臟的勻漿液，引入的生物內(nèi)源性雜質(zhì)較少，甘草酸可以得到很好的分離。

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