超聲引導射頻消融術(shù)對肝癌患者免疫功能的影響

閆景彬閆秀梅陳 斌孫洪偉

超聲引導射頻消融術(shù)對肝癌患者免疫功能的影響

閆景彬1閆秀梅2陳 斌3孫洪偉3

目的 觀察射頻消融術(shù)（RFA）對肝癌患者免疫功能的影響。方法 87例肝癌患者按治療方法分為RFA組45例和手術(shù)組42例。應用流式細胞術(shù)檢測兩組治療前后外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T和CD56+NK細胞比例及CD4+/CD8+比值變化；通過細胞C3受體花環(huán)形成率（RBCC3BRR）、紅細胞黏附腫瘤細胞花環(huán)率（RBC－TRR）和紅細胞吸附免疫復合物花環(huán)形成率（RBC－ICR）實驗檢測外周血紅細胞免疫功能；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清Th1型細胞因子（IL－2、IFN－γ、TNF－α）含量。結(jié)果 RFA組治療15天CD3+、CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值和NK細胞數(shù)目與治療前比較顯著升高（P均＜0.05）；治療30天上述指標繼續(xù)升高（P均＜0.05）；手術(shù)組治療15天后CD3+、CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值和NK細胞數(shù)目與治療前比較升高不顯著（P＞0.05），治療30天后較治療前顯著升高（P均＜0.05）。治療30天后，兩組CD8+T細胞數(shù)目較治療前均有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。RFA組治療15天RBC－ICR與治療前比較顯著下降（P＜0.05），RBC－C3bRR、RBC－TRR顯著升高（P均＜0.05）；手術(shù)組治療30天后上述指標才開始顯著改善（P均＜0.05），但與同期RFA組比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。RFA組治療15天IL－2、IFN－γ、TNF－α濃度與治療前比較顯著升高（P均＜0.05），治療30天后上述指標繼續(xù)升高（P均＜0.05）；手術(shù)組治療30天后IL－2、IFN－γ、TNF－α濃度與治療前比較顯著升高（P均＜0.05），但顯著低于同期RFA組（P均＜0.05）。結(jié)論 與手術(shù)治療相比較，RFA能更好地改善肝癌患者的淋巴細胞和紅細胞免疫功能，促進Th1型細胞因子分泌，對肝癌治療產(chǎn)生有益的影響。

肝癌；射頻消融術(shù)；手術(shù)治療；免疫功能；Th1型細胞因子

肝癌（hepatic carcinoma）是我國常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除一直是臨床首選治療手段。但由于肝癌起病隱匿，多中心發(fā)生及早期播散、轉(zhuǎn)移，使得外科手術(shù)切除率僅為20%～55%，術(shù)后復發(fā)率也較高，并發(fā)癥偏多[1]。近20年來，超聲引導射頻消融術(shù)（radio frequency ablation，RFA）作為一種原位滅活腫瘤細胞的介入手段,在原發(fā)性、繼發(fā)性肝癌的根治及姑息性治療上得到廣泛應用，具有安全有效、微創(chuàng)、耐受性好、并發(fā)癥少等特點[2]。據(jù)報道，RFA除局部熱凝治療殺死腫瘤細胞，毀滅腫瘤組織外，還能改善患者的免疫功能[3－5]。本研究通過對肝癌患者RFA和手術(shù)治療前后免疫功能、肝功能變化進行比較分析，探討RFA在肝癌治療方面的優(yōu)勢，為RFA的臨床應用提供依據(jù)。

1 臨床資料

選取本院腫瘤外科2012年2月—2013年4月經(jīng)臨床或肝穿刺活檢病理證實的肝癌患者87例，男53例，女34例；年齡36～74歲，平均年齡（56.41± 6.73）歲；其中原發(fā)性肝細胞癌（HCC）61例，轉(zhuǎn)移性肝癌26例。并且滿足以下條件：①單個癌灶≤5cm，或多個癌灶（≤4個且每個≤3cm）；②肝癌患者未接受其他治療；③無合并免疫系統(tǒng)疾患，半個月內(nèi)無細菌、病毒感染史，且近半年未接受影響機體免疫功能的藥物治療；④門靜脈或下腔靜脈內(nèi)無癌栓，亦無肝外轉(zhuǎn)移；⑤肝功能Child－pugh分級為A或B級，血小板計數(shù)＞50×109/L，凝血酶原時間＜18s。

87例按治療方法分為RFA組45例，手術(shù)組42例。兩組患者平均年齡、性別、肝功能分級、AFP等級等比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1?；颊呔栽附邮苁中g(shù)或RFA治療，術(shù)前由本人或家屬簽字。治療方法經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，接受治療后1個月內(nèi)，患者不再接受化療、放療或免疫等其他治療。

2 治療方法

2.1 手術(shù)組 根據(jù)臨床分期、患者肝功能情況，經(jīng)術(shù)前準備、保肝治療后，于全麻下采用肝葉切除或肝葉不規(guī)則切除術(shù)。切緣均達到癌灶旁1.5cm以上，確保無癌殘留。

2.2 RFA組 采用日立公司EUB7500型彩色多普勒診斷儀，探頭頻率3.5～4.0MHz。美國達隆公司RF－2000射頻治療儀，發(fā)射頻率500kHz，功率100W；取適當體位，以超聲明確定位癌灶后，確定進針點。常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因于穿刺局部逐層麻醉至肝包膜，超聲引導下將射頻針經(jīng)皮或開腹刺入肝臟癌灶預定位置；展開射頻針，調(diào)整半徑，通入射頻電流，電流強度從小到大、序貫治療，由計算機根據(jù)阻抗控制。若癌灶較大（＞5cm），采取多點、交叉、重疊消融至瘤體完全毀損，以毀損腫瘤及周圍0.5～1.0cm的肝組織為目的，最大限度地滅活癌灶，減少殘留與復發(fā)。

2.3 檢測指標 兩組患者均于治療前及治療后第1、15、30天空腹抽取肘靜脈血5mL，部分血抗凝用于檢測外周血淋巴細胞亞群比例和紅細胞免疫功能；部分血不加抗凝劑，常規(guī)制備血清。－20℃條件下保存待用，用于檢測免疫相關(guān)因子。

采用美國碧迪公司FACSCantoⅡ型流式細胞儀檢測患者外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD56+NK細胞的比例，鼠抗人CD3－PE－Cy5/CD4－FITC/CD8－PE三色熒光標記抗體，鼠抗人CD56－PE－CY7熒光標記抗體購自碧迪公司。實驗步驟嚴格按試劑說明書進行，由專門技術(shù)員負責流式儀器操作。

采用郭峰等[6]方法測定患者外周血紅細胞C3受體花環(huán)形成率（RBC－C3bRR）、紅細胞黏附腫瘤細胞花環(huán)率（RBC－TRR），紅細胞吸附免疫復合物花環(huán)形成率（RBC－ICR）。酵母多糖凍干試劑，補體致敏酵母多糖凍干試劑，小鼠艾氏腹水癌細胞凍干試劑由本院免疫室提供。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定患者外周血血清IL－2、IFN－γ、TNF－α含量。相關(guān)ELISA試劑盒均購自北京達科為生物技術(shù)有限公司。實驗步驟嚴格按試劑說明書進行。用美國賽默飛世爾科技全波長Multiskan Spectrum酶標儀測定和記錄結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件統(tǒng)計，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用F檢驗和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組治療前后外周血淋巴細胞亞群變化比較RFA組與治療前比較，RFA治療后第1天，外周血淋巴細胞亞群比例無明顯變化（P＞0.05）；治療后第15天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK細胞數(shù)目和CD4+/ CD8+比值均升高，與治療前和治療后第一天比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），CD8+T細胞數(shù)目有所降低，但與治療前和治療后第一天比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療后第30天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK細胞數(shù)目和CD4+/CD8+比值均進一步升高，與治療前和治療第1天后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），但與治療后第15天比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CD8+T細胞數(shù)目進一步降低，但與治療前和治療后第1、15天比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

手術(shù)組與治療前比較，手術(shù)治療后第1天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK細胞數(shù)目和CD4/CD8比值略有下降，CD8+T細胞數(shù)目略有上升，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后第15天，外周血淋巴細胞亞群變化不顯著。治療后第30天，CD3+T、CD4+T、CD56+NK細胞數(shù)目和CD4+/CD8+比值均升高，與治療前和治療后第1、15天比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；兩組CD8+T細胞數(shù)目無顯著變化（P＞0.05）。見表2。

組間同時期比較，治療后第15、30天，除CD8+T細胞外，RFA組其他外周血淋巴細胞亞群比例和CD4+/CD8+比值均顯著高于手術(shù)組（P均＜0.05）。見表2。

3.2 兩組治療前后紅細胞免疫功能比較 RFA組治療后第1天，RBC－C3bRR、RBC－TRR、RBC－ICR與治療前比較無顯著變化（P＞0.05）；治療后第15、30天后與術(shù)前、術(shù)后第1天比較，RBC－C3bRR、RBCTRR顯著增高，RBC－ICR顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），但第15、30天之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。手術(shù)治療后第1、15天后，RBC－C3bRR、RBC－TRR、RBC－ICR與治療前比較無顯著變化（P＞0.05）；手術(shù)30天后與治療前、治療第1、15天比較，RBC－C3bRR、RBC－TRR顯著升高（P均＜0.05），RBCICR顯著下降（P＜0.05）。同指標兩組間比較，治療前差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），治療后，RFA組紅細胞免疫指標與手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

3.3 兩組治療前后血清Th1型細胞因子含量比較RFA組血清Th1型細胞因子IL－2、IFN－γ、IFN－α含量治療15天后升高，與治療前和治療第1天后比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），治療30天后進一步升高，但與治療15天后比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。手術(shù)組治療第1、15天后，血清Th1型細胞因子IL－2、IFN－γ、TNF－α含量與治療前比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療30天后，Th1型細胞因子含量顯著升高，與手術(shù)前及術(shù)后第1、15天比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。兩組間治療15、30天IL－2、IFN－γ、TNF－α含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），見表4。

表2 兩組治療前后外周血淋巴細胞亞群比較（%±s）

表2 兩組治療前后外周血淋巴細胞亞群比較（%±s）

注：與治療前比較，△P＜0.05；與治療后第1天比較，*P＜0.05；與治療后第15天相比，▲P＜0.05；與手術(shù)組同期比較，□P＜0.05 RFA：超聲引導射頻消融術(shù)

組別RFA組手術(shù)組例數(shù)45 42治療前治療后第1天治療后第15天治療后第30天治療前治療后第1天治療后第15天治療后第30天CD3+T 59.20±8.61 58.52±7.98 71.42±7.07△*□72.39±7.53△*□58.21±9.28 55.8±8.88 60.70±6.44 67.57±5.64△*▲CD4+T 38.24±8.09 37.35±5.28 46.74±4.91△*□48.26±5.85△*□39.23±10.02 36.13±6.77 39.11±4.03 43.05±4.17△*▲CD8+T 21.49±5.91 21.15±5.79 19.01±5.44 18.77±5.30 21.60±13.21 22.3±6.26 21.59±4.36 20.35±3.85 CD4/CD8+ 1.66±0.88 1.69±0.75 2.42±0.56△*□2.61±0.71△*□1.85±0.85 1.62±0.27 1.82±0.33 2.15±0.66△*▲CD56+NK 9.75±6.97 10.56±4.07 19.59±4.89△*□21.18±5.24△*□8.37±5.42 6.48±3.55 9.49±4.05 16.53±5.27△*▲

4 討論

肝癌患者生存期短，生存質(zhì)量差。傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、化療、放療等都無法將患者體內(nèi)的腫瘤細胞徹底清除，而只是解除或減輕患者的腫瘤負荷，治療后宿主體內(nèi)都殘留一定的腫瘤細胞，而這些細胞能否被機體清除或形成新的病灶與患者免疫功能呈負相關(guān)[7－8]。若機體抗腫瘤免疫功能異常，腫瘤細胞可在免疫監(jiān)視失控下迅速增殖引起復發(fā)或轉(zhuǎn)移。因此，術(shù)后患者免疫功能狀態(tài)與預后有直接關(guān)系。然而傳統(tǒng)治療往往較大程度地干擾了患者的免疫功能[9]。

RFA治療肝癌療效肯定，作為一種熱凝固治療，其可以增強患者機體抗腫瘤免疫，有利于控制殘留腫瘤細胞的增殖，減少復發(fā)轉(zhuǎn)移[10]。RFA使病灶發(fā)生凝固性壞死，清除免疫抑制因子的來源，解除宿主的免疫抑制狀態(tài)；治療創(chuàng)傷小，有利于機體免疫功能的恢復；熱療導致腫瘤細胞表面抗原決定簇暴露或改變，增強腫瘤的抗原性，加上大量壞死腫瘤組織碎片入血，以及熱療刺激熱休克蛋白和炎癥反應產(chǎn)生等原因，從而加強刺激機體的免疫反應[11]。

研究表明，肝細胞癌患者細胞免疫功能低下，處于免疫抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為外周血各淋巴細胞亞群數(shù)目的異常，即機體CD3+、CD4+T細胞、NK細胞和CD4+/CD8+比值明顯降低，CD8+T細胞升高。T細胞亞群的變化均與肝細胞癌的惡性程度有關(guān)。CD4+T細胞具有輔助和誘導功能，是免疫應答的主要反應細胞；CD8+T是主要的效應細胞，但部分CD8+T細胞具有與CD4+T細胞相反的作用，可使腫瘤逃逸機體的免疫監(jiān)視；CD4+/CD8+比值可直接反映機體細胞免疫功能狀態(tài)；而NK細胞在清除循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞，防止血行播散中有著重要作用。因此，通過測定這些淋巴細胞亞群數(shù)目可較好地反映腫瘤患者免疫狀態(tài)。文獻[12]報道，肝癌患者行RFA術(shù)后2周，血清CD4+水平和CD4+/CD8+比值較術(shù)前明顯升高，而RBC－ICR水平明顯降低，RBC－C3bRR、RBCTRR顯著升高[13]。Vanagas等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者RFA術(shù)后7、14天，患者外周血CD3+細胞、CD4+細胞、CD4+/CD8+較治療前明顯升高。上述文獻結(jié)果表明，RFA后患者免疫功能有一定的改善，但這些研究結(jié)果均為2周內(nèi)變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RFA治療第15天后，CD3+、CD4+T細胞和NK細胞數(shù)目，以及CD4+/CD8+比值即較術(shù)前顯著升高（P＜0.05）；治療第30天后，這些指標繼續(xù)升高。而外科手術(shù)治療第30天后這些指標較術(shù)前才有顯著升高（P＜0.05）。兩組CD8+T細胞數(shù)目較術(shù)前均有所下降，但并不顯著（P＞0.05）。本研究結(jié)果說明，RFA治療后機體抗腫瘤免疫功能短時間內(nèi)有明顯改善，而手術(shù)則改善緩慢。同時顯示治療第15、30天后，RFA組患者的CD3+、CD4+T細胞和NK細胞數(shù)目，CD4+/CD8+比值均顯著高于手術(shù)組，說明RFA治療后患者免疫功能維持于較高水平。

表3 兩組治療前后紅細胞免疫功能比較（%，±s）

表3 兩組治療前后紅細胞免疫功能比較（%，±s）

注：與治療前比較，△P＜0.05；與治療后第1天比較，*P＜0.05；與治療后第15天比較，▲P＜0.05；與同期手術(shù)組比較，□P＜0.05 RFA：超聲引導射頻消融術(shù)

組別RFA組手術(shù)組例數(shù)45 42治療前治療后第1天治療后第15天治療后第30天治療前治療后第1天治療后第15天治療后第30天RBC－C3bRR 9.23±2.41 10.05±2.09 20.34±6.46△*□24.15±6.18△*□9.52±2.49 10.58±2.31 12.70±4.12 17.57±5.37△*▲RBC－TRR 18.02±2.15 17.35±2.68 25.13±3.59△*□27.14±4.65△*□19.42±2.17 18.50±2.79 18.61±3.63 23.60±3.07△*▲RBC－ICR 15.46±3.93 16.56±4.21 8.15±3.58△*□4.21±4.64△*□14.43±4.12 16.23±2.20 12.35±4.43 9.53±4.08△*▲

表4 兩組治療前后Th1型細胞因子含量比較（pg/mL，±s）

表4 兩組治療前后Th1型細胞因子含量比較（pg/mL，±s）

注：與治療前比較，△P＜0.05；與治療后第1天比較，*P＜0.05；與治療后第15天比較，▲P＜0.05；與同期手術(shù)組比較，□P＜0.05 RFA：超聲引導射頻消融術(shù)

組別RFA組手術(shù)組例數(shù)45 42治療前治療后第1天治療后第15天治療后第30天治療前治療后第1天治療后第15天治療后第30天IL－2 87.12±10.14 90.15±2.09 98.34±9.82△*□102.25±12.08△*□89.10±8.49 85.15±7.03 87.70±10.02 95.15±9.73△*▲IFN－γ 38.36±7.36 40.65±8.81 55.36±6.49△*□58.38±7.53△*□39.84±6.93 35.05±7.67 42.16±9.25 51.60±11.30△*▲TNF－α 65.12±8.19 63.15±6.51 79.48±8.15△*□80.21±5.16△*□64.14±9.37 66.32±8.72 68.35±8.74 70.55±7.60△*▲

在抗腫瘤細胞免疫反應中，CD4+T細胞處于核心位置，主要分泌Th1型細胞因子。其中Th1型細胞因子IL－2是T細胞生長因子，可活化T細胞和巨噬細胞并誘量T細胞分泌IFN－γ，TNF－α等細胞因子；刺激NK細胞增殖，促進NK細胞分泌IFN－γ；誘導細胞毒性T細胞和自然殺傷T細胞的產(chǎn)生，并增強其腫瘤殺傷活性。本研究結(jié)果顯示，RFA治療15天后肝癌患者外周血血清IL－2、IFN－γ、TNF－α濃度顯著升高（P＜0.05），30天后繼續(xù)升高。雖然手術(shù)治療30天后Th1型細胞因子濃度顯著升高（P＜0.05），但顯著低于同期RFA組（P＜0.05）。說明RFA滅活肝癌組織后較手術(shù)治療更能激活免疫細胞、促進Th1型細胞因子分泌，可產(chǎn)生較為明顯的Th1型免疫應答，顯著提高患者機體的抗肝癌免疫功能。

腫瘤產(chǎn)生的大量抗原與血中抗體形成的循環(huán)免疫復合物，被認為是造成腫瘤免疫抑制的因素之一，而人體清除免疫復合物主要靠紅細胞完成。有關(guān)臨床研究提示，腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移與紅細胞數(shù)量關(guān)系不大，而與其免疫功能高低密切相關(guān)[15]。本研究中RFA治療第15天后RBC－ICR較治療前顯著下降（P＜0.05），RBC－C3bRR、RBC－TRR顯著升高（P＜0.05），說明黏附在紅細胞上的免疫復合物降低及CR1活性增高，導致紅細胞對癌細胞的清除能力增強。而手術(shù)治療第30天后患者紅細胞免疫指標才有顯著改善，且顯著低于同期RFA治療組（P＜0.05）。

總之，RFA治療可顯著改善肝癌患者機體的淋巴細胞和紅細胞免疫功能，提高機體免疫功能，從而對肝癌的治療效果產(chǎn)生有益的影響。雖然手術(shù)治療也可改善肝癌患者免疫功能，但我們認為手術(shù)治療僅打破患者免疫耐受，無助于顯著提高患者抗腫瘤免疫功能。

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（收稿：2014－08－03 修回：2014－10－27）

Effects of Radio Frequency Ablation on Immune Function of Hepatic Carcinoma Patients

YAN Jingbin1,YAN Xiumei2,CHEN Bin3,SUN Hongwei3. 1 Department of Ultrasound,Wenzhou Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Wenzhou(325000),China;2 Department of Pediatrics,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China;3 Department of Ultrasound,the first Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou(325000),China.

Objective To explore the effect of radio frequency ablation（RFA）on post－operative immune function of hepatic carcinoma patients.Methods Eighty seven patients with hepatic carcinoma were randomly divided into two groups:RFA group（n=45）and surgical resection group（n=42）.The percentage of CD3+T cells,CD4+T cells,CD8+T cells and CD56+NK cells and the ratio of CD4+/CD8+T cells in peripheral blood of patients were determined by flow cytometry analysis.Red blood cell C3b receptor rosette（RBC－C3bRR）,tumor red blood cell rosette（RBC－TRR）and red blood cell immune complex rosette（RBC－ICR）were identified to detect the immune function of red blood cells.Thl type cytokines（IL－2,IFN－γ,TNF－α）in the sera were analyzed by ELISA assay. Results Compared to prior－treatment,CD3+,CD4+T cells and NK cells and CD4+/CD8+ratio increased significantly on D15 after RFA（all P＜0.05）and pushed up further on D30.However,they did not increase significantly on D15 after treatment in surgical group（all P＞0.05）and elevated to a significantly different level on D30 after treatment（all P＜0.05）.The percentage of CD8+T cells in both groups decreased on D30 after treatment,but not significantly（all P＞0.05）.On D15 after RFA,RBC－ICR decreased significantly and RBC－C3bRR,RBC－TRR in－creased significantly（all P＜0.05）.However,these immunological indicators in surgical group improved significantly on D30 after treatment（all P＜0.05）,and there are significant difference in them between RFA group and surgical group（all P＜0.05）.Additionally,IL－2,IFN－γ,and TNF－α in the sera raised significantly on D15 after RFA treatment（all P＜0.05）,and they kept on increasing on D30 after RFA.The serum level of these Thl type cytokines increased significantly on D30 after surgical resection（all P＜0.05）,but lower than that in RFA group（all P＜0.05）. Conclusion Compared with surgical treatment,RFA may further improve immune function of lymphocytes and red blood cells of hepatocellular carcinoma patients,promote secretion of Th1 type cytokines,which may benefit the treatment of hepatocellular carcinoma.

Hepatic carcinoma;Radio frequency ablation;Surgical resection;Immune function; Th1 type cytokines

浙江省自然科學基金項目（No.LY12H03005）

1浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院超聲科（溫州 325000）；2溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院兒科（溫州 325000）；3溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院超聲科（陳斌）、肝膽外科（孫洪偉）（溫州 325000）

閆景彬，Tel：0577－88913947；E－mail：48183846@qq.com