增液湯對(duì)干燥綜合征模型鼠血清腫瘤壞死因子-α和白介素-1β的影響*

孫麗英，秦鵬飛，張 亮，孫紅麗

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040

增液湯對(duì)干燥綜合征模型鼠血清腫瘤壞死因子-α和白介素-1β的影響*

孫麗英，秦鵬飛，張 亮，孫紅麗

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040

目的：觀察增液湯對(duì)干燥綜合征模型鼠血清中腫瘤壞因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的影響。方法：將54只ICR小鼠隨機(jī)分為6組：空白組，模型組，來氟米特組和增液湯高、中、低劑量組。采用弗氏完全佐劑及ICR小鼠頜下腺蛋白抗原聯(lián)合誘導(dǎo)干燥綜合征（SS）動(dòng)物模型，60天后眼球取血，采用ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。結(jié)果：模型組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；來氟米特組和增液湯高、中、低劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均低于模型組（P＜0.05），增液湯高劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明顯低于來氟米特組（P＜0.05），中劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明顯介于高、低劑量組之間。結(jié)論：增液湯治療SS模型小鼠的機(jī)制之一可能是降低了血清中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，而且增液湯劑量越大效果越明顯。

增液湯；干燥綜合征；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

干燥綜合征(sjogren syndrome，SS)［1］是一種全身外分泌腺(特別是淚腺和唾液腺)的慢性炎癥性的自身免疫病，主要表現(xiàn)為眼和口的干燥，且腺體外的系統(tǒng)如呼吸道、消化道、泌尿道、神經(jīng)、肌肉、關(guān)節(jié)等均可受損。SS可分為原發(fā)性和繼發(fā)性2種，前者指有干燥性角結(jié)膜炎和口腔干燥而不伴有其他結(jié)締組織??；而后者則指伴發(fā)其他結(jié)締組織病。其特征主要為外分泌腺特別是淚腺和唾液腺高度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且血清中可檢測(cè)到多種自身抗體?，F(xiàn)代的科學(xué)研究并未闡明其發(fā)病的根本原因，治療主要以改善癥狀為主。中醫(yī)將本病歸為“燥痹”“燥毒”“燥證”“虛勞”等范疇?！稖夭l辨》中增液湯的功效是增液潤(rùn)燥，在此基礎(chǔ)上對(duì)癥加減治療該病收效良好。本實(shí)驗(yàn)主要通過觀察增液湯對(duì)SS模型小鼠血清中腫瘤壞死因子α (TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的影響，進(jìn)一步探討增液湯在干預(yù)SS方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 增液湯按《溫病條辨》所載方用量：玄參30 g，生地黃24 g，麥冬24 g，上藥均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供。將上述比例藥材加8倍量蒸餾水浸泡半小時(shí)，煎煮60分鐘，過濾煎液；再加6倍量蒸餾水煎煮40分鐘，過濾煎液。合并2次濾液，濃縮成每毫升相當(dāng)于生藥材1.5g和0.5g的藥液，冷卻后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｎ魉幩幬铮簛矸滋仄?優(yōu)通)：常州華生制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20090330。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DZKW-D-1型電熱恒溫水浴鍋 (北京市永光明醫(yī)療儀器廠提供)，Anthos 2010酶標(biāo)儀(鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司提供)，渦旋式混勻器 (蘇州捷美電子有限公司提供)，722型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司提供)，KDC-40低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司提供)。

1.4 主要試劑 弗氏完全佐劑(FCA)［美國(guó)sigma公司，批號(hào)：SLBB1397］；百白破疫苗(成都生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20110846-1)；TNF-α、IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R＆D公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130312)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20130315)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 免疫用抗原的制備 脫頸處死4只ICR小鼠，75%酒精擦拭頸部，無菌操作臺(tái)上快速取出小鼠兩側(cè)頜下腺，分離包膜及結(jié)締組織，用生理鹽水洗凈，無菌濾紙吸干，稱重，剪碎，勻漿，每0.1 g加滅菌PBS緩沖液2mL，4℃低溫離心機(jī)中離心(3 000 rpm×20min)，取上清液置10mL無菌試管中，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定抗原蛋白含量，用滅菌PBS緩沖液將抗原蛋白稀釋至1mg/mL，加入等體積FCA，使抗原乳化成油包水狀態(tài)，抗原最終濃度為500μg/mL。

1.5.2 分組及處理 將小鼠隨機(jī)分為6組，每組9只，分別為空白對(duì)照組(A)，模型組(B)，來氟米特組(C)，增液湯高劑量組(D)，增液湯中劑量組(E)，增液湯低劑量組(F)。A組不作處理，B～F組兩后腳掌及兩側(cè)腹股溝皮下注射乳化蛋白抗原，每只腳掌及每側(cè)腹股溝皮下均注射0.05mL。首次免疫后第2天和第8天，B～F組每只小鼠腹腔注射百白破疫苗0.05mL。第8天，B～F組小鼠背部皮下多點(diǎn)注射乳化蛋白抗原加強(qiáng)免疫。之后每隔14天加強(qiáng)免疫一次，均為背部皮下多點(diǎn)注射。A組、B組小鼠每日灌服生理鹽水，0.02mL/g；C組小鼠每日灌服陽性對(duì)照藥來氟米特溶液(按人每日用量等效計(jì)算)，0.02mL/g；D組小鼠每日灌服高劑量增液湯(每毫升相當(dāng)于生藥材1.5g)，0.20mL/g；E組小鼠每日灌中劑量增液湯(每mL相當(dāng)于生藥材1.0 g)，0.02mL/g；F組小鼠每日灌服低劑量增液湯(每毫升相當(dāng)于生藥材0.5 g)，0.02mL/g。首次免疫后第60天，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血，血漿室溫靜置20分鐘后，2 000 r×15min離心取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 操作方法 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

增液湯對(duì)SS小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響見表1。

表1 增液湯對(duì)SS小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響(±s)pg/mL

表1 增液湯對(duì)SS小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響(±s)pg/mL

注：與空白組比較，△表示P＜0.01；與模型組比較，▲表示P＜0.01。

組別 例數(shù) TNF-α含量 IL-1β含量空白組 9 53.26±7.89 30.01±4.99模型組 9 126.33±10.07△132.78±20.15△來氟米特組 9 76.50±6.94△▲66.78±9.51△▲增液湯高劑量組 9 71.57±8.12△▲49.22±10.56△▲增液湯中劑量組 9 78.17±9.24△▲62.67±11.07△▲增液湯低劑量組 9 84.17±11.14△▲78.67±11.97△▲

由表1結(jié)果可見，與空白組比較，模型組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，來氟米特組和增液湯高、中、低劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；增液湯高劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量與來氟米特組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，中劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明顯介于高、低劑量組之間。

3 討論

干燥綜合征是一種慢性炎癥性的自身免疫疾病，在其發(fā)病過程中，存在大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)淚腺和唾液腺，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，促使B、T淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn)一步損害組織器官，最終導(dǎo)致腺體功能喪失。TNF-α是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、誘發(fā)炎癥并調(diào)控細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子之一，能促進(jìn)B、T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，引起炎癥反應(yīng)。IL-1β是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要環(huán)節(jié)之一，能激活其他炎癥介質(zhì)的合成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明：TNF-α及IL-1β在SS小鼠涎腺局部破壞和放大全身免疫紊亂中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：來氟米特和增液湯高、中、低劑量均可以改善SS小鼠的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為TNF-α和IL-1β在血清中的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，其中，增液湯高劑量效果優(yōu)于來氟米特(P＜0.01)。提示增液湯可能通過抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且從高、中、低劑量的對(duì)比可以看出增液湯高劑量組效果明顯優(yōu)于中、低劑量組。說明在臨床上應(yīng)用時(shí)要先從大劑量考慮使用［3-4］。增液湯在改善SS的癥狀方面發(fā)揮了很大的作用，可以為臨床更好的治療SS提供理論支持。但是SS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，增液湯是否通過其他機(jī)制參與了SS的發(fā)病過程，有待進(jìn)一步研究［3］。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì).干燥綜合征診治指南(草案)［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2003，7(7)：446-448.

［2］ 趙文鵬.周期聯(lián)合免疫抑制劑對(duì)干燥綜合征模型小鼠治療作用及TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響［D］.太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2008.

［3］ 何志軍.隴中消定膏對(duì)足舟狀骨缺血性壞死的臨床療效觀察［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26(8):25-26.

［4］ 吳國(guó)琳，普興宏.養(yǎng)陰益氣活血法對(duì)干燥綜合征NOD小鼠頜下腺的干預(yù)作用研究［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25(6):29-34.

Researcheson the ZengYe Tang in the Influencesof TNF-αand IL-1βover the SSRats

SUN Liying,QIN Pengfei,ZHANG Liang,SUN Hongli
Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China

Objective:To observe the effectof the ZengYe Tang on the tumornecrosis factor(TNF-α)and interleukin-1β(IL-1β)in the serum of ratswith Sjogren syndrome(SS).Methods:Totally 54 ICR ratswere random ly divided into 6 groups:the blank group,themodelgroup,the leflunomide group and the ZengYe Tang groupsof high, m iddle and low dosages.The SS ratmodelswere induced by injecting complete Freund adjuvant(CFA)and protein antigen of the submandibular gland of ICR rat.On the 60th day,the TNF-αand IL-1βlevels in the serum collected from the eyeballs were determ ined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results:The contents of TNF-αand IL-1βof rats in themodelgroup were allhigher than that in the blank group,the two groups had significant differences(P＜0.05);the TNF-αand IL-1βlevels in the leflunomide group and the ZengYe Tang groups of high,m iddle and low dosageswere all lower than those in themodelgroup(P＜0.05),especially in the group ofhigh dose they were significantly lower than those in the leflunomide group (P＜0.05)and in them iddle dose group the levelswere between the high and low groups.Conclusion:One of themechanisms of ZengYe Tang in the treatment of SS ratmay be relevant to its function in decreasing the expression of serum TNF-αand IL-1βlevels and its dosages,the higher,the greater.

ZengYe Tang;SS;TNF-α;IL-1β

R285.5

A

1004-6852(2015)02-0013-03

2014-07-04

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目計(jì)劃（編號(hào)12511529）。

孫麗英(1966—)，女，碩士研究生導(dǎo)師，博士學(xué)位，教授。研究方向：方劑的配伍規(guī)律及療效客觀化。