甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量分析*

李成義，楊苗苗，張櫻山，陸國弟

1甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2甘肅奇正藏藥有限公司

甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量分析*

李成義1，楊苗苗1，張櫻山2，陸國弟1

1甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2甘肅奇正藏藥有限公司

目的：建立板藍(lán)根中多糖的含量測定方法，分析比較甘肅省內(nèi)不同種植區(qū)域的板藍(lán)根多糖含量差異。方法：采用水提醇沉法提取板藍(lán)根中多糖，利用苯酚-硫酸法測定板藍(lán)根中多糖的含量。結(jié)果：甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量相差較大，最高為16.22%，最低為10.59%，平均回收率為99.42%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.15%（n=6）。結(jié)論：該測定方法簡單、準(zhǔn)確、真實(shí)，可用于測定板藍(lán)根中多糖含量。整體看甘肅地區(qū)板藍(lán)根中多糖含量相對較低，且不同市縣及鄉(xiāng)鎮(zhèn)其多糖含量存在較大差異，有必要對其種植區(qū)域進(jìn)行科學(xué)合理規(guī)劃。

板藍(lán)根；多糖；含量測定

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica For t.的干燥根，性寒味苦，具有清熱解毒，涼血利咽之功效，常用于溫毒發(fā)斑、舌絳紫暗、大頭瘟疫、痄腮、爛喉丹痧、丹毒、癇腫等癥［1］。全國各地均有分布，現(xiàn)主要產(chǎn)于安徽、河北、甘肅、黑龍江等地。板藍(lán)根中含有較豐富的化學(xué)成分［2-3］，其中多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖，護(hù)肝等多重功效。近年來隨著板藍(lán)根藥材種植區(qū)域的逐年擴(kuò)增，一些地區(qū)不合理開發(fā)板藍(lán)根種植區(qū)域的行為比比皆是，使得人們對板藍(lán)根藥材的質(zhì)量與療效提出了質(zhì)疑。為此，筆者采集甘肅省內(nèi)20個(gè)不同種植區(qū)域的板藍(lán)根藥材，采用苯酚-硫酸法對其多糖含量進(jìn)行分析比較研究，為甘肅地區(qū)優(yōu)選板藍(lán)根藥材種植區(qū)域提供科學(xué)合理的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器及主要設(shè)備 XS205DU型梅特勒-托利多分析天平 (梅特勒-托利多上海有限公司提供)；ACY-2001-U型艾科薄超低元素型超純水機(jī)(重慶伊洋企業(yè)發(fā)展有限公司提供)；HSY2-SP電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠提供)；WFH-201B紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司提供)。

1.2 試藥 D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110833-201205，供含量測定用)；苯酚，濃硫酸、無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、三氯乙酸均為分析純，水為超純水。所有板藍(lán)根(序號與來源見表2)藥材樣品均經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院李成義教授鑒定，為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica For t.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗多糖的提取和精制多糖的制備 取經(jīng)破碎的板藍(lán)根生藥200 g，置1 000mL的圓底燒瓶中加80%乙醇過夜，次日取出回流2小時(shí)，冷卻后濾過，濾液棄去，濾渣揮干溶劑加適量水，回流提取2次，2 h/次，合并兩次提取液并濃縮至150mL，給濃縮液中加無水乙醇直至溶液含醇量達(dá)80%，充分?jǐn)嚢韬笥?℃冰箱中靜止過夜，次日濾過并將濾渣除醇后冷凍干燥至恒重，即得板藍(lán)根粗多糖。準(zhǔn)確稱取以上制得的板藍(lán)根粗多糖，加蒸餾水200mL，再加氯仿多次萃取，隨后加5.0%三氯乙酸適量除去蛋白質(zhì)［4］，并采用透析袋除去無機(jī)鹽離子，以活性炭脫色，濾過，濾液加無水乙醇使含醇量達(dá)80%，4℃冰箱中靜止過夜，離心，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，低溫烘干至恒重，制得精制板藍(lán)根多糖。

2.2 對照品溶液的制備 取D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱定，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.106 1mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取板藍(lán)根藥材粉末各0.2 g，精密稱定，置于150mL具塞瓶中，加80%乙醇100mL，回流1小時(shí)，放冷，濾過，濾渣連同濾紙揮干溶劑一起放入具塞瓶中，再加蒸餾水60mL，加熱回流2小時(shí)，趁熱濾過，用蒸餾水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移入100mL容量瓶中稀釋至刻度，搖勻即可。

2.4 精制板藍(lán)根多糖的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的板藍(lán)根粗多糖10mg，置于50mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻置于冰箱中備用。

2.5 苯酚試液的配制 取苯酚300 g，加碳酸氫鈉0.15 g和鋁片0.25 g，常壓蒸餾182℃餾分，精密稱取該餾分25 g，定溶于500mL棕色容量瓶中，得5%苯酚溶液，置于冰箱中備用。

2.6 最大吸收波長的選擇 分別精密移取上述對照品溶液和供試品溶液各0.5mL，均置于20mL的具塞刻度試管中，補(bǔ)水至1.5mL，各加5%苯酚溶液1.5mL，混勻，再分別小心滴加濃硫酸5mL，充分搖勻，至沸水浴中煮沸15分鐘后，迅速冷卻，同上操作制得空白溶液，以空白溶液作參比。用紫外-可見分光光度計(jì)在400～600 nm全波長掃描，結(jié)果對照品溶液和供試品溶液均在487 nm處有最大吸收峰，故選擇487 nm為測定波長。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取葡萄糖對照品溶液0，0.2，0.5，0.8，1，1.2 mL，分別置于20 mL的具塞刻度試管中，補(bǔ)水至1.5mL，各加5%苯酚溶液1.5mL，混勻，再分別小心滴加濃硫酸5mL，充分搖勻，至沸水浴中煮沸15分鐘后，迅速冷卻，同上操作制得空白溶液，以空白溶液作參比。用紫外-可見分光光度計(jì)在487 nm波長處測定吸光度值，以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=43.295X-0.004 3(R=0.999 5)，結(jié)果表明葡萄糖對照品溶液在0.002 7～0.015 9mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖1。

圖1 葡萄糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.8 換算因子的測定 取“2.4”項(xiàng)下精制的多糖儲備液0.5mL，按“2.6”項(xiàng)下測定吸光度，平行3份，每份測定2次，由回歸方程求出板藍(lán)根精制多糖中葡萄糖的濃度，并按公式f=W/CD［公式中W為板藍(lán)根精制多糖的質(zhì)量(mg)，C為多糖溶液中葡萄糖的濃度mg/mL，D為板藍(lán)根多糖的稀釋倍數(shù)］，計(jì)算換算因子f，求得f均值為1.05，RSD為1.81%。

2.9 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下制得的葡萄糖對照品溶液0.5mL，按照“2.6”項(xiàng)下方法連續(xù)測定6次，吸光度均值為0.344，RSD為2.21%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地的板藍(lán)根藥材樣品溶液，按照“2.6”項(xiàng)下方法操作，每隔20分鐘測定1次，連續(xù)測定6次，RSD為1.66%，結(jié)果表明樣品溶液在2小時(shí)內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一產(chǎn)地板藍(lán)根藥材粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下分別制備溶液，測定其吸光度，結(jié)果多糖含量均值為13.38%，RSD為2.96%，表明重復(fù)性良好。

2.12 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量同一產(chǎn)地板藍(lán)根藥材樣品約0.1 g，精密稱定，平行6份，分別加“2.2”項(xiàng)下制得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，測定吸光度，結(jié)果見表1。

2.13 樣品測定 按“2.6”項(xiàng)下方法分別測定甘肅省20個(gè)不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材樣品吸光度，每個(gè)樣品平行測定3次，由回歸方程求出各供試品溶液中葡萄糖濃度，測定結(jié)果見表2(以干燥品計(jì)算)。

3 討論

多糖作為板藍(lán)根藥材中增強(qiáng)免疫力的主要成分，其本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，在分離純化以及結(jié)構(gòu)測定上難度很大。本試驗(yàn)結(jié)合前人研究成果，比較了回流提取法與超聲法提取板藍(lán)根多糖的提取效果，結(jié)果回流提取法效率高于超聲法提取法。另外，采用苯酚-硫酸法測定板藍(lán)根中多糖［5-6］，依次對水的用量，苯酚溶液用量，硫酸溶液用量，加熱時(shí)間及加熱溫度作了優(yōu)化，得出了測定板藍(lán)根多糖最佳顯色條件為：板藍(lán)根多糖在水1mL，苯酚溶液1.5mL，硫酸溶液5mL，100℃水浴中加熱15分鐘顯色效果相對明顯。

表1 板藍(lán)根藥材加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 板藍(lán)根藥材樣品中多糖含量測定結(jié)果(n=3)

目前，板藍(lán)根多糖雖還未列入2010版《中國藥典》必測成分中，但基于多糖本身所具有的特殊性，無論是在醫(yī)藥還是保健品方面都有其不可代替的地位，因此研究板藍(lán)根中多糖具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)比較了甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地多糖含量差異較大，其中以張掖市山丹縣位奇鎮(zhèn)十里堡村產(chǎn)的板藍(lán)根多糖含量最高，民樂縣三堡鎮(zhèn)韓莊村產(chǎn)的多糖含量最低，出現(xiàn)這種含量差異可能與兩地土壤類型、光照時(shí)間、氣溫高低及海拔高低等多條件方面有關(guān)。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道［7］不同產(chǎn)地菘藍(lán)種質(zhì)內(nèi)在品質(zhì)差異除與遺傳因素有關(guān)外，很大程度與其所處環(huán)境密切相關(guān)。這進(jìn)一步說明生長環(huán)境對板藍(lán)根藥材內(nèi)在質(zhì)量影響甚大。因此，合理規(guī)劃藥材種植區(qū)域?qū)⒊蔀樗幉钠焚|(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵，本試驗(yàn)將為甘肅地區(qū)合理規(guī)劃板藍(lán)根種植區(qū)域和保證藥材質(zhì)量方面提供借鑒性的資料。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：191.

［2］ 黃家娣.板藍(lán)根化學(xué)成分和藥理作用綜述［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(15)：197-198.

［3］ 雷黎明.板藍(lán)根化學(xué)、藥理、質(zhì)量及提取方法的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(10)：2578-2580.

［4] 孔凡例，張名位，于淑娟，等.荔枝粗多糖脫蛋白方法的研究［J］.食品科技，2008，10(20)：142-145.

［5］ 朱婷，尹溽紋.張貴強(qiáng)，等.板藍(lán)根多糖提取工藝及對活性成分影響的研究［J］.中國新藥雜志，2013，22(12)：1390-1395.

［6]蘇玉順，李艷君，趙方振，等.紫外-可見分光光度法在植物多糖含量測定中的應(yīng)用［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28(3)：1101-1105.

［7］ 陳宇航，郭巧生，鄧喬華，等.菘藍(lán)不同種質(zhì)活性成分動(dòng)態(tài)積累及其藥材品質(zhì)比較［J］.中國中藥雜志，2012，37(11)：1541-1544.

Determ ination of Polysaccharides in BanLanGen from DifferentHabitatsof Gansu Province

LIChengyi1,YANGMiaomiao1,ZHANG Yingshan2,LU Guodi1
1 Gansu University of Chinesemedicine,Lanzhou 730000,China; 2 Gansu Qizheng Tibetan Pharmaceutical Joint Stock Co.,Ltd

Objective:To distinguish the contentdifferencesof polysaccharides in BanLanGen(isatis tinctoria) from differenthabitats of Gansu Province by establishing a determ inationmethod.Methods:The polysaccharides in the Banlangen were extracted by water-extraction and alcohol-precipitationmethod and the polysaccharide contents were determ ined by phenol-sulfuric acid method.Results:The differences in different regions in Gansu province were great;the highestwas 16.22%,the lowest10.59%,the average recovery rate 99.42%and RSD 1.15%(n=6). Conclusion:The determiningmethod adopted,whichwas simple,accurate and practical,can be used tomeasure the contentof polysaccharides in Banlangen.Wholly,the polysaccharide contents of Banlangen in Gansu province are relatively low;because there exists great differences in the polysaccharide contents of Banlangen from different cities,countiesand towns,a scientific and rationalplanning for Banlangen′s planting division isnecessary.

BanLanGen;polysaccharides;contentdeterm ination

R259

A

1004-6852(2015)02-0005-03

2014-05-05

2013年甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號1308RJZA176)。

李成義(1964—)，男，博士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：中藥品種與質(zhì)量研究。