清脈飲及其拆方對兔動脈粥樣硬化閉塞癥模型NO及ET表達(dá)的影響

魏齊等

【摘要】目的：研究清脈飲及其拆方對兔動脈粥樣硬化閉塞癥模型NO及ET表達(dá)的影響。方法：選取SPF級雄性健康新西蘭白兔為研究對象，建立動脈粥樣硬化閉塞癥動物模型，36只白兔隨機(jī)分為全方組、模型組、空白組、活血組、軟堅組、清法組。造模的各組在造模完成后恢復(fù)普通飲食并分別予以相應(yīng)藥物干預(yù)8周后取材。以硝酸還原法測定NO，放免分析法測定ET水平的變化。結(jié)果：全方組、軟堅組、活血組NO的水平與空白組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05），清法組NO的水平明顯高于空白組（P <0.05），清法組、軟堅組、活血組、全方組的NO水平均明顯低于模型組（P <0.05），清法組的NO水平也低于軟堅組、活血組、全方組（P<0.01）；清法組、軟堅組、活血組、全方組的ET水平均明顯低于模型組（P <0.01），與空白組無明顯差異，清法組、軟堅組、活血組、全方組各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：清脈飲及其拆方能升高兔動脈粥樣硬化閉塞癥模型血液中NO的水平，降低ET的水平，對血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，清法組效果最佳。

【關(guān)鍵詞】動脈粥樣硬化閉塞癥；兔；NO ；ET

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）08-0010-02

動脈粥樣硬化閉塞癥（Atherosclerotic Occlusion， ASO）是指動脈粥樣硬化（Atherosclerotic，AS）累及周圍動脈并引起慢性閉塞的一種AS相關(guān)疾病。近來血管內(nèi)皮功能在AS發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關(guān)注，許多學(xué)者認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙不僅是AS 的一個始動環(huán)節(jié)，還是導(dǎo)致其不斷進(jìn)展的重要因素[1]。因此，改善和恢復(fù)血管內(nèi)皮功能已經(jīng)成為AS 防治的重要目標(biāo)之一。清脈飲是根據(jù)名老中醫(yī)奚九一教授軟堅清脈方精簡，以清法為主治療ASO的有效方劑[2]，但是目前對以清法為主的復(fù)方中藥治療ASO的作用機(jī)理和療效的研究很少，本實(shí)驗在建立ASO動物模型的過程中使用清脈飲及其拆方進(jìn)行干預(yù)治療，旨在研究以清法為主改善血管內(nèi)皮功能而達(dá)到對抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)理。

1資料與方法

1. 1 一般資料選用健康新西蘭白兔36只（SPF級，青島康大生物科技有限公司提供scxk （ 3 ） 20110001 ），雄性，體重（2.5～10.2） kg，隨機(jī)分為全方組、模型組、空白組、活血組、軟堅組、清法組，每組6只，于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫20～22 ℃，濕度40%～50%，用普通飼料或高脂飼料飼養(yǎng)。普通飼料和高脂飼料均由青島康大生物科技有限公司提供，高脂飼料配方：2%膽固醇、1%脫氧膽酸鈉、5%豬油、92%普通飼料。

1.2 研究方法參照文獻(xiàn)[3]造ASO動物模型。對全方組、模型組、活血組、軟堅組、清法組白兔進(jìn)行造模。造模方法[4]∶行造模的白兔自造模開始每天分別給予100g高脂飼料，第3天在3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉下行無菌手術(shù)，于右側(cè)腹股溝下搏動處暴露股動脈，于無血管分支處用7號手術(shù)線繞動脈輕輕結(jié)扎，注意不要完全結(jié)扎?？p合切口，術(shù)后肌注青霉素20萬U/只。第7天，靜脈注射牛血清白蛋白（250mg/kg），繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，共12周，造模完成。取胸主動脈組織行病理檢查判斷造模是否成功。繼續(xù)予以普通飼料喂養(yǎng)8周，然后處死，取血及相關(guān)組織。實(shí)驗持續(xù)共計20周。空白對照組：全程喂飼普通飼料，20周后處死。

1.3干預(yù)藥品①全方：由垂盆草、昆布、大黃、丹參、牡蠣等12味藥物組成；②軟堅方：海藻、昆布等4味藥物組成；③活血方：丹參、蒲黃等4味藥物組成；④清法方：垂盆草、大黃等5味藥物組成。以上中藥飲片均由寧夏古方醫(yī)院提供，依據(jù)傳統(tǒng)方法煎煮、過濾，濃縮至140ml/劑。

1.4干預(yù)方法白兔經(jīng)過12周造模完成后，自第13周起，全方組、活血組、軟堅組、清法組相應(yīng)予以清脈飲全方、活血方、軟堅方和清法方的中藥濃縮液灌胃，模型對照組予以滅菌水灌胃，共8周，白兔日灌胃液體用量為10ml·[KG-*1/5]（kg·d）-1。按體型系數(shù)換算法中人兔等效藥量換算方法計算給藥劑量，相當(dāng)于每組生藥量為全方組14g·[KG-*1/5]（kg·d）-1，軟堅方組5g·[KG-*1/5]（kg·d）-1，活血方組4.07g·[KG-*1/5]（kg·d） -1，清法方組5.148g·[KG-*1/5]（kg·d）-1。

1.5 標(biāo)本取材及組織處理耳緣靜脈穿刺取血約5ml，分別快速注入加入抗凝劑（10%EDTA二鈉30μl、抑膚酶40μl）的試管和普通試管中，體積各半（加入抗凝劑的試管需輕輕混勻），于4℃ ， 3000rpm/min離心10min，分離血漿和血清，分裝，-20℃凍存。

1.6檢測項目與方法

1.6.1血清NO測定采用硝酸還原法，按試劑盒說明書操作。反應(yīng)結(jié)束后，將試管內(nèi)反應(yīng)液倒入0.5cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，550nm波長處測定各管吸光度值。代入下列公式中計算血清NO含量。NO（μmol/l）=（樣品管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×100 μmol/L ×稀釋倍數(shù)。

1.6.2血漿ET測定以放免分析法測定。采用非平衡法，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作步驟操作。反應(yīng)結(jié)束后，4℃條件下，3000rpm離心20min，吸棄上清液，在自動Y計數(shù)儀上測定各管沉淀物放射性計數(shù)，直接給出相關(guān)參數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動計算樣品濃度。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，完全隨機(jī)設(shè)計的兩比較方差齊用t檢驗，方差不齊用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兔主動脈HE染色空白對照組兔主動脈管腔表面光滑，內(nèi)膜無明顯增生，內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)。模型組兔主動脈內(nèi)膜增生明顯，管腔狹窄，增生的內(nèi)膜下有大量泡沫細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞缺失或不連續(xù)，提示造模成功，見圖1。endprint

2.2 血清NO、血漿ET的測定全方組、軟堅組、活血組NO的水平與空白組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），清法組NO的水平明顯高于空白組（P<0.05），清法組、軟堅組、活血組、全方組的NO水平均明顯高于模型組（P<0.05），清法組的NO水平也高于軟堅組、活血組、全方組（P<0.01），清法組、軟堅組、活血組、全方組的ET水平均明顯低于模型組（P<0.01），與空白組無明顯差異，清法組、軟堅組、活血組、全方組各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。詳見表1。

3討論

動脈硬化閉塞癥（ASO）屬于中醫(yī)的“脈痹”范疇，以往對ASO研究多集中在活血化瘀方面，并且取得了不錯的效果和獲得了廣泛的認(rèn)可[5]，而ASO治療的其他治則方面的實(shí)驗研究幾乎沒有。名老中醫(yī)奚九一教授長期致力于中醫(yī)血管病的研究，其在20世紀(jì)60年代初就提出了ASO“邪是標(biāo)，癖是變，損是果，虛是機(jī)體的本質(zhì)”的慢性病變過程的理論，提出“祛邪為先，活血生新，扶正康復(fù)”的治療原則，并用其驗方軟堅清脈飲治療ASO取效，為以清法治療ASO開辟了新的路徑[2]。其弟子趙凱[6]教授在此基礎(chǔ)上總結(jié)認(rèn)為ASO的病機(jī)為“毒滯脈絡(luò)”， 且邪毒貫穿于疾病的始終，尊《內(nèi)經(jīng)》“以通為用”之旨，治法貴在清通，把清邪毒作為治療的重點(diǎn)，特別是在ASO的早期和急性期，更強(qiáng)調(diào)熱毒和濕毒作祟為主，并擬以垂盆草、大黃為君藥的清脈飲用于臨床，取得良效。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙不僅是ASO 的一個始動環(huán)節(jié)，還是導(dǎo)致其不斷進(jìn)展的重要因素[1]。因此，改善和恢復(fù)血管內(nèi)皮功能已經(jīng)成為ASO 防治的重要目標(biāo)之一。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是早期動脈粥樣硬化過程中重要的病理生理變化，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙伴隨一氧化氮生物活性降低， 氧化產(chǎn)物的增加及多種黏附分子的表達(dá)， 從而啟動粥樣斑塊的形成及發(fā)展， 最終導(dǎo)致血管疾病的發(fā)生[7]。NO和ET是依賴于血管內(nèi)皮的一組重要活性物質(zhì)，檢測血液中二者的水平變化即可反映出血管的內(nèi)皮功能狀態(tài)。血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO，通過細(xì)胞膜迅速傳遞至血管平滑肌細(xì)胞，使平滑肌松弛，動脈血管擴(kuò)張，從而調(diào)節(jié)血壓和血流分布[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO在生理、病理情況下均有保持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的作用。NO對ET的合成和釋放也有抑制作用，還能清除氧自由基，所以NO具有顯著的抗血管動脈粥樣硬化的作用。內(nèi)皮素（ET） 是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的主要縮血管物質(zhì)，被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性縮血管肽，具有很強(qiáng)的縮血管和促細(xì)胞增殖作用，血管內(nèi)皮激活時，內(nèi)皮素水平增加，而NO的產(chǎn)生減少，表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性的舒張因子和收縮因子失衡，從而損傷血管內(nèi)皮功能，造成血管動脈粥樣硬化的發(fā)生[9]。本實(shí)驗觀察到，軟堅組、活血組、全方組的NO水平均明顯高于模型組，提示清脈飲及其拆方在一定程度上可以抵消高脂飲食和免疫損傷帶來的影響，使其表達(dá)與空白組處于同一水平。而清法組NO的水平明顯高于模型組且存在顯著差異，同時也高于軟堅組、活血組、全方組，提示清法組在保護(hù)血管內(nèi)皮功能方面效果最佳。就ET的水平而言，清法組、軟堅組、活血組、全方組的ET水平均明顯低于模型組，提示清脈飲及其拆方可以降低兔動脈硬化閉塞癥模型血液中的ET水平，清法組略低于軟堅組、活血組、全方組，但各組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，清脈飲及其拆方可以升高兔動脈硬化閉塞癥模型血液中NO的水平，降低ET水平，對血管內(nèi)皮功能有保護(hù)作用，其中清法拆方的效果最佳，這為實(shí)驗及臨床研究運(yùn)用中醫(yī)清法治療ASO提供了新的選擇。

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（收稿日期：2015.01.23）endprint