羅布麻浸膏微生物限度檢查方法的驗證

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【摘要】 目的：應(yīng)用試驗驗證羅布麻浸膏微生物限度檢查的方法。方法：選用平皿法與培養(yǎng)基稀釋法測定該藥品對5株驗證菌的回收率，同時驗證控制菌（大腸埃希菌）的檢驗方法。結(jié)果：5株人工污染菌的回收率均達(dá)到70%以上，符合驗證要求。結(jié)論：該方法有效排除了樣品抑菌作用的干擾，適用于羅布麻浸膏的微生物限度檢查。

【關(guān)鍵詞】 羅布麻浸膏；微生物限度檢查；驗證試驗

【中圖分類號】R927.11【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）08-0035-02

羅布麻浸膏曾用名為羅布麻霜，收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》，具有祛痰、降血壓、止咳、降血脂、抗菌消炎、抗衰老等功效[1]。其作用效果顯著，尚未見毒副作用。由于羅布麻浸膏具有明顯的抑菌作用，采用常規(guī)的微生物限度檢查方法不能反映出樣品被微生物污染的情況，因此選擇合適的方法除去自身既有的抑菌作用才能進(jìn)行微生物限度檢查。為了確定該藥品的抑菌活性及檢驗方法的可靠性，本文按照微生物限度檢查法的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（《中國藥典》2010年版一部）的相關(guān)要求[2]，制定了羅布麻浸膏的微生物限度檢查法，驗證結(jié)果表明檢驗方法簡便易行、準(zhǔn)確、可靠，為同類藥物的微生物限度檢查提供了科學(xué)的試驗依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器（見表1）

1.2培養(yǎng)基及試劑（見表2）

1.3供試品羅布麻浸膏（新疆尉犁縣金興甘草制品有限公司）。

1.4試驗用菌株（見表3）

以上菌株均為第三代，由新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所提供。

2方法學(xué)驗證與結(jié)果[2]

2.1菌液制備方法分別取適量枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌（ECO）、金黃色葡萄球菌（sau）標(biāo)準(zhǔn)菌株，轉(zhuǎn)移至10ml滅菌后的營養(yǎng)肉湯中，恒溫（37℃）下培養(yǎng)18～24h；取白色念珠菌（cal）適量，接種于改良馬丁培養(yǎng)基中，在25℃下恒溫培養(yǎng)24～48h。分別取1ml上述培養(yǎng)物，置于盛有加9ml的0.9%無菌NaCl溶液的試管中稀釋使為10-5～10-7的菌懸液[2]。

將黑曲霉培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移在改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)7d，用3ml 0.9%無菌NaCl溶液洗脫孢子，之后取1ml孢子液，倒入9ml的0.9%無菌NaCl溶液中稀釋使為10-5～10-7的孢子懸液[2]。

2.2供試液制備取樣品10g，置錐形瓶中，加無菌NaC-蛋白胨緩沖液（pH7.0）至100ml，4000r/min振搖5min，使充分溶解混勻，便可（1∶10）。

2.3細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查方法的驗證

2.3.1試驗組①平皿法：取“2.2”項下的供試液1ml，及各“2.1”項下的五種試驗菌，分別注入平皿中，迅速倒入45℃完全溶化的相應(yīng)培養(yǎng)基20ml，為減少誤差每株菌平行制備2個平皿，待冷凝后，置所需溫度下倒扣培養(yǎng)至規(guī)定的時間，觀察計數(shù)。②培養(yǎng)基稀釋法：取0.2ml“2.2”中的供試液/皿，每皿加入驗證菌各10-5～10-7，其余方法同平皿法。

2.3.2菌液組不添加供試液，分別取“2.1”項下的五種試驗菌，操作方法同試驗組測定所加入的試驗菌數(shù)。

2.3.3供試品對照組不加試驗菌之外，其余方法同試驗組，測定供試品本底菌數(shù)。平皿法與培養(yǎng)基稀釋法各菌回收率試驗結(jié)果見表4。

2.4大腸埃希菌檢查方法的驗證取供試液（1∶10）10ml及1ml10-5～10-7大腸埃希菌，接種在預(yù)先制備好的100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）中，于37℃下恒溫培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基澄清度的變化；之后取渾濁管中的培養(yǎng)物適量做熒光反應(yīng)與靛基質(zhì)試驗。另取培養(yǎng)物劃線接種于MacC平板上，恒溫（37℃）培養(yǎng)24h后觀察其菌落的生長形態(tài)特征[2]。同時取金黃色葡萄球菌替代大腸埃希菌，其余操作方法同試驗組。結(jié)果見表5。

3討論

從表4結(jié)果可以看出，羅布麻浸膏經(jīng)常規(guī)平皿法驗證可以使人工污染的黑曲霉菌、大腸埃希菌和白色念珠菌的回收率在80%～99%，提示該藥品對以上菌株無抗菌作用或抗菌作用很弱，回收率的結(jié)果滿意（規(guī)定大于70%），證明平皿法可用于該藥物的霉菌及酵母菌數(shù)檢查。表4中還可知，羅布麻浸膏對枯草芽孢桿菌非常敏感，完全被抑制，回收率僅為0；而對金黃色葡萄球菌較敏感，回收率為44%～55%，說明羅布麻浸膏對細(xì)菌的生長繁殖有一定的抑制作用，不能采用常規(guī)法測定細(xì)菌數(shù)，必須改用其它的方法消除自身對細(xì)菌的抑制作用。但羅布麻浸膏對細(xì)菌的抑制作用不是很強，本試驗選用了培養(yǎng)基稀釋法。實驗結(jié)果顯示，每皿0.2ml，可基本去除抑菌成分對細(xì)菌生長的影響，回收率均大于70%。為此，培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.2ml）可用于羅布麻浸膏的細(xì)菌數(shù)檢查。

從表5可知，在控制菌的驗證中，試驗組MUG呈現(xiàn)熒光，MUG陽性，靛基質(zhì)試液液面呈玫瑰紅色，結(jié)果檢出大腸埃希菌；陰性菌對照組結(jié)果為未生長（表示未檢出金黃色葡萄球）。故控制菌（大腸埃希菌）用常規(guī)方法檢查。

通過方法驗證試驗，羅布麻浸膏的微生物限度檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）測定細(xì)菌數(shù)；霉菌及酵母菌數(shù)采用平皿法測定；控制菌檢查采用常規(guī)法即可達(dá)到效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)（第11冊）[M].國家藥品監(jiān)督管理局，2002：76-77.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國中醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79-88.

（收稿日期：2015.01.26）